喬 江,王 葉,吳肖男,孫曉峰,劉 祎,陳智芬

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖南長沙410007；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一中醫(yī)臨床學(xué)院，湖南長沙 410208；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)組織胚胎學(xué)教研室，湖南長沙 410208

近年來，我國女性不孕癥發(fā)病率呈上升趨勢，高達(dá)11%，其中輸卵管炎性不孕為女性輸卵管因素不孕的最主要原因[1-4]。西醫(yī)治療該病的主要方式有子宮輸卵管造影、宮腹腔鏡手術(shù)治療、輔助生殖治療等[5-6]，輔助生殖治療的運(yùn)用較大解決了輸卵管性不孕的生育問題，但其治療技術(shù)要求高，費(fèi)用昂貴，且仍存在反復(fù)著床失敗、卵巢過度刺激等方面的問題，許多婦女仍難以接受這項(xiàng)技術(shù)[7]。丹荔輸通湯為第四批全國名老中醫(yī)藥學(xué)術(shù)經(jīng)驗(yàn)指導(dǎo)教師楊秉秀教授60余年治療輸卵管炎性不孕之經(jīng)驗(yàn)方，臨床療效顯著，前期研究中發(fā)現(xiàn)，丹荔輸通湯能明顯降低輸卵管炎性阻塞患者血清細(xì)胞間黏附因子-1(ICAM-1)水平，升高血清血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)水平，但對輸卵管局部炎性微環(huán)境及調(diào)控機(jī)制的影響尚不明確[8]。本研究旨在探究丹荔輸通湯治療慢性輸卵管炎性阻塞的作用機(jī)制，為提高丹荔輸通湯的臨床療效及推廣運(yùn)用提供更可靠、更科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并實(shí)現(xiàn)對名老中醫(yī)經(jīng)驗(yàn)方的傳承、優(yōu)化與創(chuàng)新，為臨床中藥新藥研發(fā)提供前期基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本來源 SD健康雌性大鼠84只，湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供(SPF級)。飼養(yǎng)溫度為18～24 ℃，濕度為30%～70%，體重為180～200 g。合格證號：No.1107272011007368。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物 中藥：丹荔輸通湯為第四批全國名老中醫(yī)藥學(xué)術(shù)經(jīng)驗(yàn)指導(dǎo)教師楊秉秀教授經(jīng)驗(yàn)方，組方由丹參15 g、荔枝核15 g、劉寄奴15 g、王不留行10 g、桃仁10 g、赤芍10 g，生黃芪15 g、太子參15 g等組成，以上飲片由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房鑒定并提供。阿奇霉素混懸液：阿奇霉素干混懸劑(0.1 g×6包)，購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院西藥房，批號為200101，加蒸餾水10 mL制成阿奇霉素混懸液。造模藥物：液化苯酚(500 g×1瓶)，購自湖南麥克林試劑有限公司，批號為P815401。羧甲基纖維素鈉(500 g×1瓶)，購自湖南麥克林試劑有限公司，批號為C804625。灌腸藥物為丹荔輸通湯灌胃制劑。

1.3儀器與試劑 輪轉(zhuǎn)石蠟切片機(jī)(徠卡RM2235)、生物組織攤片機(jī)(金迪YD-A)、電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒DNP-9162)、數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)(Motic 6.0)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(WaferGen Biosystems)、漩渦混勻儀(Kylin-Bell)、掌式離心機(jī)(Kylin-Bell)、熱循環(huán)儀(Life)、電泳儀(上海天能科技有限公司)，以及R1600型DEPC處理水(Solarbio)、10006818型三氯甲烷(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、#41003型GelRed染料(Biotium)、9168型NA Loading Buffer(TaKaRa)、T9122型Tris-Borate-EDTA Buffer(TBE) 10×Powder,pH8.3(TaKaRa)、DP419型RNAsimple Total RNA Kit(天根)、K1622型RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(ThermoFisher)、TB Green?Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)(ThermoFisher)、兔抗鼠轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1和Smad2多克隆抗體(武漢proteintech公司)、Smad3單克隆抗體(武漢proteintech公司)、山羊抗兔IgG二抗(武漢proteintech公司)。

1.4方法

1.4.1實(shí)驗(yàn)分組與造模 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，按體重進(jìn)行編號，用隨機(jī)數(shù)字表法抽取11只大鼠作為空白組(A組)，其余73只大鼠全部苯酚明膠造模法制作慢性輸卵管炎性阻塞模型[9-10]。以10% 水合氯醛0.3 mL/100 g腹腔注射麻醉，將73只造模大鼠仰臥固定，腹部剪毛備皮，碘酒、酒精消毒，鋪巾，于恥骨聯(lián)合向上約0.5 cm處作縱形切口，長1.0～1.5 cm，打開腹腔，暴露Y形子宮，沿子宮找到雙側(cè)輸卵管，于子宮靠近輸卵管處向兩側(cè)輸卵管分別注入15%苯酚糊劑0.03 mL，然后縫合創(chuàng)口。術(shù)后消毒術(shù)區(qū)，鋪無菌墊料，正常飼養(yǎng)。造模第25天，A組與73只造模大鼠中分別隨機(jī)處死3只大鼠進(jìn)行病理檢測，術(shù)中及HE染色見A組3只大鼠輸卵管管腔形態(tài)規(guī)則，管壁富有彈性，質(zhì)地柔軟，色澤鮮亮，未見充血、腫脹、扭曲等病變，與周圍組織無粘連。3只造模大鼠輸卵管管腔扭曲、畸形，管壁結(jié)締組織增生纖維化，質(zhì)硬，管壁增粗、阻塞，充血、水腫較為明顯，大量炎性細(xì)胞浸潤，與周圍組織廣泛粘連。確定模型制備成功，在模型制備過程中，有4只大鼠死亡。經(jīng)病理檢測造模成功后，將66只造模大鼠隨機(jī)分為6組，每組11只，分別為B組(模型組)、C組(丹荔輸通湯高劑量灌胃+灌腸組)、D組(丹荔輸通湯中劑量灌胃+灌腸組)、E組(丹荔輸通湯低劑量灌胃+灌腸組)、F組(丹荔輸通湯中劑量灌胃組)、G組(阿奇霉素混懸液灌胃對照組)。

1.4.2給藥途徑 自造模第31天開始予B組生理鹽水灌胃30 d，予C組[14.0 g/(kg·d)]、D組[7.0 g/(kg·d)]、E組[3.5 g/(kg·d)]丹荔輸通湯灌胃、灌腸30 d，予F組丹荔輸通湯中劑量[7.0 g/(kg·d)]灌胃30 d，予G組阿奇霉素混懸液[10.0 mg/(kg·d)]灌胃 7 d，每天1 次，其余 23 d灌胃等容積生理鹽水，每天1 次，灌胃容積均為3 mL，灌腸容積為2 mL。

1.4.3標(biāo)本檢測 實(shí)驗(yàn)給藥第31天，處死全部大鼠，選取輸卵管組織，一部分行HE染色后行形態(tài)學(xué)檢查，染色制成病理切片，電鏡下觀察輸卵管組織病理變化，剩余部分行逆轉(zhuǎn)錄-實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR) 、Western blot檢測，測定組織中的CTGF、Smad7相對表達(dá)水平。

1.4.4RT-qPCR檢測輸卵管組織中CTGF、Smad7轉(zhuǎn)錄表達(dá) 提取大鼠輸卵管組織總RNA，采用分光光度計(jì)測定RNA質(zhì)量。參考Thermo公司反轉(zhuǎn)錄酶說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄制備cDNA，實(shí)時(shí)熒光定量PCR mRNA操作如下。根據(jù)實(shí)驗(yàn)標(biāo)本數(shù)量選擇對應(yīng)規(guī)格并在冰上配制如下反應(yīng)體系，引物設(shè)計(jì)與合成為TGF-β1上游引物：GACCGCAACAACGCAATCTAT；下游引物：CGTGTTGCTCCACAGTTGAC；smad2上游引物：CGTCGGAAGAGGAAGGAACAA；下游引物：TGGTAAATCTACCCTGCACCC；smad3上游引物：GGAGGAGAAGTGGTGCGA GAA；下游引物：GCCACAAGCGGCAGTAGAT。將配置好的qPCR的反應(yīng)體系(20 μL)置于PCR儀中，65 ℃ 5 min，25 ℃ 5 min，42 ℃ 60 min，循環(huán)40 次，70 ℃ 5 min。采用2-ΔΔCt法計(jì)算大鼠輸卵管組織中TGF-β1和Smad2、Smad3相對表達(dá)水平。

1.4.5Western blot法檢測輸卵管組織標(biāo)本中CTGF、Smad7轉(zhuǎn)錄表達(dá) 提取輸卵管組織蛋白，BCA法蛋白定量，電泳，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜完成，麗春紅染色試劑染色，觀察轉(zhuǎn)膜效果,泳道標(biāo)記，浸沒膜于3%BSA-TBST中室溫輕搖30 min封閉，3%BSA-TBST稀釋一抗，室溫孵育10 min，放4 ℃過夜，第2天在室溫孵育30 min。TBST洗膜5次，每次3 min，二抗孵育，5%脫脂奶粉-TBST稀釋二抗，辣根過氧化酶(HRP)標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)，稀釋濃度1∶10 000，室溫輕搖 40 min。洗膜：TBST洗膜6次，每次3 min，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯影，反應(yīng)3～5 min，膠片曝光定影后掃描，以β-actin為內(nèi)參照，軟件Total Lab Quant V11.5讀取條帶積分光密度值。

2 結(jié) 果

2.1肉眼觀結(jié)果 經(jīng)實(shí)驗(yàn)給藥30 d后，處死全部大鼠，選取輸卵管組織肉眼觀察各組大鼠輸卵管組織解剖形態(tài)變化，具體觀察情況如下，見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)處理30 d后肉眼觀

2.2實(shí)驗(yàn)處理30 d病理檢測結(jié)果 經(jīng)實(shí)驗(yàn)給藥30 d后，處死全部大鼠，取各組大鼠輸卵管組織，HE染色后光鏡下觀察其病理學(xué)改變情況，具體觀察情況為A組：輸卵管絨毛完整，結(jié)構(gòu)正常，無炎性細(xì)胞浸潤，未見成纖維細(xì)胞；B組：輸卵管腔阻塞，絨毛不完整，破壞嚴(yán)重，腔內(nèi)有炎性滲出，大量炎細(xì)胞浸潤；C組：輸卵管形態(tài)正常，絨毛完整，結(jié)構(gòu)正常，無炎性細(xì)胞浸潤，可見少許成纖維細(xì)胞；D組：輸卵管無阻塞，管腔正常大小，結(jié)構(gòu)完整，絨毛數(shù)量較多，部分有粘連，輕微炎性細(xì)胞浸潤，可見纖維結(jié)締組織增生；E組：輸卵管輕微阻塞，管腔縮小，輸卵管部分絨毛上皮脫落，可見粘連增粗，可見炎性細(xì)胞浸潤及較多纖維組織增生；F組：輸卵管尚通暢，管腔稍有縮小，結(jié)構(gòu)基本完整，絨毛數(shù)量減少，部分有粘連，輕微炎性細(xì)胞浸潤，可見纖維結(jié)締組織增生；G組：輸卵管尚通暢，管腔稍有縮小，結(jié)構(gòu)基本完整，絨毛數(shù)量減少，部分有粘連，輕微炎性細(xì)胞浸潤，可見纖維結(jié)締組織增生。見圖1。

圖1 各組大鼠輸卵管形態(tài)HE染色結(jié)果(×200)

2.3丹荔輸通湯對大鼠輸卵管組織CTGF表達(dá)的影響 實(shí)驗(yàn)30 d后經(jīng)檢測，A組大鼠輸卵管組織CTGF相對表達(dá)水平較低，B組大鼠輸卵管組織CTGF相對表達(dá)水平高于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)處理30 d后，與B組相比，C、D、E、F及G組大鼠輸卵管組織CTGF相對表達(dá)水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與G組相比，C組、D組CTGF相對表達(dá)水平更低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在丹荔輸通湯不同用藥劑量上：C、D組大鼠輸卵管組織CTGF相對表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但與E、F組比較，C、D組大鼠輸卵管組織CTGF相對表達(dá)水平較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。對于丹荔輸通湯中劑量的不同用藥方式上:與F組相比，D組大鼠輸卵管組織CTGF相對表達(dá)水平較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2、圖2。

圖2 丹荔輸通湯對慢性輸卵管炎性阻塞模型大鼠輸卵管組織CTGF表達(dá)

表2 丹荔輸通湯對慢性輸卵管炎性阻塞模型大鼠輸卵管組織CTGF的影響

2.4丹荔輸通湯對大鼠輸卵管組織Smad7表達(dá)的影響 實(shí)驗(yàn)30 d后經(jīng)檢測，A組與B組大鼠輸卵管組織Smad7相對表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，實(shí)驗(yàn)處理30 d后，與B組相比，C、D、E、F及G組大鼠輸卵管組織Smad7相對表達(dá)水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與G組相比，C、D組Smad7相對表達(dá)水平更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在丹荔輸通湯不同用藥劑量上：C、D組Smad7相對表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但C、D組Smad7相對表達(dá)水平高于E、F組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。對于丹荔輸通湯中劑量的不同用藥方式上:與F組相比，D組大鼠輸卵管組織Smad7相對表達(dá)水平更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3、圖3。

表3 丹荔輸通湯對大鼠輸卵管組織Smad7表達(dá)的影響

圖3 丹荔輸通湯對慢性輸卵管炎性阻塞模型大鼠輸卵管組織Smad7表達(dá)

3 討 論

CTGF廣泛存在于多種組織器官中，主要發(fā)揮介導(dǎo)細(xì)胞黏附、促進(jìn)血管生成、誘導(dǎo)細(xì)胞遷移等作用，可促進(jìn)機(jī)體、器官的生長和發(fā)育，刺激胚胎發(fā)育等[11-13]。在創(chuàng)傷愈合及心、肝、腎、肺等器官纖維化發(fā)生中CTGF明顯過度表達(dá)，并與TGF明顯相關(guān)，是TGF-β1關(guān)鍵的下游分子[14-16]，Smads是TGF-β受體作用的直接底物，不同的Smad介導(dǎo)不同的TGF-β家族成員的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[17-19]。Smad2在TGF-β生物學(xué)功能效應(yīng)發(fā)揮中起著關(guān)鍵作用，可能是與組織纖維化最密切相關(guān)的蛋白質(zhì)之一，Smad7是一個(gè)抑制型蛋白，可與Smad2競爭結(jié)合TGF-β受體，能阻斷Smad2磷酸化，從而抑制TGF-β/Smads通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，抑制輸卵管炎性反應(yīng)，延緩輸卵管的纖維化[20-24]。目前研究已發(fā)現(xiàn)纖維化器官中Smad7的相對降低可能引起促纖維化的信號傳遞反應(yīng)增強(qiáng)，并通過有絲分裂原及CTGF mRNA表達(dá)水平增加，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)和CTGF的增多，CTGF的過度表達(dá)，可誘導(dǎo)纖維蛋白酶抑制劑的合成增加，阻止ECM的降解，使組織的ECM積聚，進(jìn)而發(fā)生器官和組織的纖維化，Smad7的高表達(dá)可抑制CTGF的表達(dá)[25-30]。丹荔輸通湯為第四批全國名老中醫(yī)藥學(xué)術(shù)經(jīng)驗(yàn)指導(dǎo)教師楊秉秀教授治療輸卵管炎性不孕的經(jīng)驗(yàn)方，該方由丹參、荔枝核、劉寄奴、王不留行、桃仁、赤芍，生黃芪、太子參等組成，方中丹參為君藥，丹參功用涼血化瘀，方中荔枝核、劉寄奴、王不留行、赤芍、桃仁為臣藥行氣通絡(luò)、活血化瘀，桃仁、赤芍均為婦科治瘀血要藥，二者配伍，破婦人血閉腹痛，王不留行通經(jīng)行血，善治婦科月經(jīng)不調(diào)、血癥等，劉寄奴功擅破血行經(jīng)，生黃芪、太子參為佐藥，益氣扶正，助氣行血，全方標(biāo)本同治，體現(xiàn)攻補(bǔ)兼施、消散結(jié)合、氣血兼顧的治療特點(diǎn)，使得氣血旺盛、瘀血蕩滌、脈絡(luò)通暢，從而達(dá)到使輸卵管的充血消退、水腫減輕、纖維化緩解的作用。前期臨床研究表明，該方能明顯降低輸卵管炎性阻塞患者血清ICAM-1水平，升高血清VEGF水平，改善患者炎癥狀態(tài)。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)丹荔輸通湯治療后的慢性輸卵管炎性阻塞模型大鼠輸卵管組織局部形態(tài)得到不同程度的恢復(fù)。通過RT-qPCR、Western blot 檢測各組輸卵管組織CTGF、Smad7表達(dá)發(fā)現(xiàn)，丹荔輸通湯能夠抑制大鼠輸卵管組織CTGF、上調(diào)Smad7表達(dá)，從而抑制輸卵管組織炎性反應(yīng)與纖維化形成，改善恢復(fù)輸卵管生理功能。不同劑量丹荔輸通湯對慢性輸卵管炎性阻塞模型大鼠輸卵管組織CTGF及Smad7表達(dá)影響有差異，C組、D組對大鼠輸卵管組織CTGF、Smad7表達(dá)的影響優(yōu)于E組、F組及G組，D組對大鼠輸卵管組織CTGF、Smad7表達(dá)的影響優(yōu)于F組，為丹荔輸通湯治療慢性輸卵管炎性阻塞的最佳治療方案提供理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。中醫(yī)藥在某些婦科疾病治療上有著不可替代的優(yōu)勢，如盆腔炎性疾病后遺癥、不孕癥、子宮內(nèi)膜異位癥、異位妊娠等[31-32]。雖然療效確切，但目前藥物的作用機(jī)制不夠明確，因此，不斷發(fā)揮中醫(yī)藥優(yōu)勢，學(xué)習(xí)新知識、掌握新的科研方法與技術(shù)，也是中醫(yī)藥文化傳承與發(fā)展的重要一步。