馬 寧，周 知，周 璟，胡嘉嘉，趙立強(qiáng)，陳 姣，盧偉英(海南省婦女兒童醫(yī)學(xué)中心生殖醫(yī)學(xué)中心，?？?70206)

反復(fù)著床失敗(repeated implantation failure，RIF)是不孕癥治療領(lǐng)域的一大難題，更已成為阻礙體外受精(invitrofertilization，IVF)妊娠率進(jìn)一步提高的瓶頸，RIF指優(yōu)質(zhì)胚胎在幾個(gè)新鮮和(或)冷凍胚胎移植周期后仍未能植入子宮內(nèi)膜而獲得臨床妊娠，這不僅給患者帶來了一定的心理負(fù)面情緒，更加重了其經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，進(jìn)而影響再次移植結(jié)局[1]。RIF的發(fā)生可能與胚胎缺陷、內(nèi)分泌、血栓前狀態(tài)、遺傳因素和免疫狀態(tài)等相關(guān)，同時(shí)子宮內(nèi)膜容受性(endometrial receptivity，ER)下降也是影響胚胎著床的主要因素之一，因此，如何改善胚胎種植環(huán)境，即提高ER一直是臨床攻克RIF的關(guān)鍵靶點(diǎn)[2]。近年來，宮腔灌注治療備受關(guān)注，其灌注方式主要包括自體細(xì)胞及藥物。血小板富集血漿(platelet-rich plasma，PRP)是從患者新鮮全血中提取的血漿血小板濃縮物，含有多種細(xì)胞因子及一大類生長因子，PRP在創(chuàng)面愈合、口腔種植骨再生等方面均有應(yīng)用，近年來也有國內(nèi)外研究結(jié)果表明PRP可作為治療RIF及薄型子宮內(nèi)膜的創(chuàng)新型方式[3-4]。粒細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF)是一種糖蛋白，能夠刺激中性粒細(xì)胞分化及增殖，并通過一定機(jī)制改善ER[5]。有研究結(jié)果表明，宮腔灌注G-CSF能夠改善子宮內(nèi)膜發(fā)育狀態(tài)和血流灌注，從而提高臨床妊娠率[6]。基于此，本研究采用回顧性分析，探究PRP聯(lián)合G-CSF宮腔灌注對(duì)RIF患者ER及臨床結(jié)局的影響，以期為臨床治療RIF提供參考，報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 資料來源

選擇2020年1月至2022年7月于我院就診的RIF患者76例，按照凍融胚胎移植前是否進(jìn)行宮腔灌注，分為PRP+G-CSF灌注組(n=38)和對(duì)照組(未灌注，n=38)。RIF診斷標(biāo)準(zhǔn)：年齡<40歲，已接受≥3個(gè)新鮮胚胎移植周期或者凍融胚胎移植周期，且累計(jì)移植≥4枚優(yōu)質(zhì)胚胎而未能臨床妊娠者[7]。納入標(biāo)準(zhǔn)：基礎(chǔ)卵泡刺激素(FSH)<10 U/L；無輸卵管積水或已結(jié)扎；內(nèi)分泌檢查正常；自身免疫性抗體如抗心磷脂抗體、抗核抗體、抗甲狀腺抗體及抗β2-糖蛋白1抗體陰性。排除標(biāo)準(zhǔn)：存在盆腔腫瘤患者；有妊娠禁忌證或患有對(duì)妊娠有明確影響的疾病者；子宮解剖結(jié)構(gòu)異常(單角子宮、雙角子宮、雙子宮和縱隔子宮)者；存在重度子宮內(nèi)膜異位癥、黏膜下子宮肌瘤、子宮腺肌癥、子宮內(nèi)膜息肉及宮腔粘連等患者；夫妻雙方存在染色體異常者；存在精神障礙或無法配合治療者；存在血液系統(tǒng)疾病者，如遺傳性易栓癥等；對(duì)本研究藥物過敏者。

1.2 方法

1.2.1 凍融胚胎移植的內(nèi)膜準(zhǔn)備方案：(1)降調(diào)節(jié)激素替代周期。月經(jīng)期第2—3日皮下注射注射用醋酸亮丙瑞林微球(規(guī)格：3.75 mg)3.75 mg，28～30 d后口服戊酸雌二醇片(規(guī)格：1 mg)6 mg/d。當(dāng)內(nèi)膜厚度≥7 mm時(shí)，口服黃體酮膠囊(規(guī)格：50 mg)300 mg/d及陰道用黃體酮軟膠囊(規(guī)格：0.1 g)600 mg/d轉(zhuǎn)化內(nèi)膜，內(nèi)膜轉(zhuǎn)化第4日移植1～2枚卵裂胚，或第6日移植1～2枚囊胚。(2)激素替代周期。月經(jīng)期第2—3日直接口服戊酸雌二醇片(規(guī)格同上)6 mg/d。當(dāng)內(nèi)膜厚度≥7 mm時(shí)，口服黃體酮膠囊(規(guī)格同上)300 mg/d及陰道用黃體酮軟膠囊(規(guī)格同上)600 mg/d轉(zhuǎn)化內(nèi)膜，內(nèi)膜轉(zhuǎn)化第4日移植1～2枚卵裂胚，或第6日移植1～2枚囊胚。(3)促排卵周期。月經(jīng)期第2—3日口服來曲唑片(規(guī)格：2.5 mg)2.5～5 mg/d，共5 d，定期監(jiān)測卵泡發(fā)育，待排卵后口服黃體酮膠囊(規(guī)格同上)300 mg/d及陰道用黃體酮軟膠囊(規(guī)格同上)400 mg/d黃體支持，在排卵后的第4日移植1～2枚卵裂胚，或第6日移植1～2枚囊胚。

1.2.2 PRP的標(biāo)準(zhǔn)化制備：采用患者自體外周血，以兩步離心法制成，使用裝有檸檬酸鈉抗凝溶液1.5 mL的注射器抽取患者靜脈血20 mL，1 200 r/min離心(離心半徑15 cm)12 min后，吸取上層富含血小板的上清液，再次以2 500 r/min離心(離心半徑15 cm)7 min，吸棄離心管內(nèi)上清液，得到剩余約1 mL液體，吹打混勻沉淀即為PRP，盡快用于宮腔灌注。

1.2.3 宮腔灌注：患者充盈膀胱，取膀胱截石位，以安爾碘Ⅲ型皮膚消毒劑消毒外陰，使用窺器暴露宮頸，用安爾碘Ⅲ型皮膚消毒劑棉球擦洗陰道及宮頸，用干棉球?qū)㈥幍纼?nèi)多余液體擦干；將一次性使用無菌胚胎移植管接上2 mL注射器，抽取處理后的PRP液及重組人粒細(xì)胞刺激因子注射液[規(guī)格：9.0×106IU(150 μg)/0.9 mL]0.9 mL混勻，在腹部超聲的引導(dǎo)下將一次性使用無菌胚胎移植管經(jīng)宮頸緩慢送入宮腔，調(diào)整管尖距宮底約1 cm處將混合液無阻力下全部緩慢注入宮腔，停留30 s后輕輕取出一次性使用無菌胚胎移植管；必要時(shí)可使用宮頸鉗牽拉宮頸，以便于一次性使用無菌胚胎移植管順利進(jìn)入宮腔；術(shù)后患者于手術(shù)床上臀高位靜躺5 min后于觀察室觀察30 min。對(duì)照組患者則不進(jìn)行宮腔灌注處理。

1.3 觀察指標(biāo)

(1)兩組患者胚胎種植率比較：胚胎種植率=B超發(fā)現(xiàn)宮內(nèi)孕囊數(shù)/移植胚胎總數(shù)×100%。(2)兩組患者妊娠結(jié)局比較：記錄臨床妊娠率、生化妊娠率、早期流產(chǎn)率、異位妊娠率以及PRP+G-CSF組宮腔灌注不良事件發(fā)生情況。于胚胎移植4～6周采用B超檢查見宮內(nèi)妊娠囊存在卵黃囊、胚芽及原始心管搏動(dòng)為臨床妊娠。卵裂胚移植后14 d、囊胚移植后12 d檢測β-HCG≥25 IU/L為化學(xué)妊娠。妊娠12周前發(fā)生胚胎停育或自然流產(chǎn)定義為早期流產(chǎn)。(3)兩組患者子宮內(nèi)膜及血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)比較：于胚胎移植日行陰道超聲檢查，記錄子宮動(dòng)脈搏動(dòng)指數(shù)(PI)、阻力指數(shù)(RI)，并參照Gonen標(biāo)準(zhǔn)將子宮內(nèi)膜分為A型(三線型，為外層和中部強(qiáng)回聲以及內(nèi)層低回聲或暗區(qū)，宮腔中線回聲明顯)、B型(弱三線型，宮腔中線回聲不明顯)和C型(均質(zhì)強(qiáng)回聲，無宮腔中線回聲)。子宮內(nèi)膜下血流分型標(biāo)準(zhǔn)采用Applebaum分型法，分為Ⅰ型(血管穿過內(nèi)膜外側(cè)低回聲帶但未達(dá)到內(nèi)膜高回聲外緣)、Ⅱ型(血管穿過高回聲外緣但未進(jìn)入內(nèi)膜低回聲區(qū))和Ⅲ型(血管穿過內(nèi)膜低回聲區(qū))。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 兩組患者一般資料比較

兩組患者年齡、既往移植次數(shù)、不孕年限、體重指數(shù)、抗米勒管激素(AMH)水平、FSH水平、移植胚囊周期占比及內(nèi)膜方案比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 兩組患者一般資料比較Tab 1 Comparison of general information between two groups

2.2 兩組患者胚胎種植率比較

兩組患者平均移植胚胎數(shù)、移植優(yōu)質(zhì)胚胎率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；PRP+G-CSF組患者的胚胎種植率為46.88%，高于對(duì)照組的26.56%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 兩組患者胚胎種植率比較Tab 2 Comparison of embryo implantation rates between two groups

2.3 兩組患者妊娠結(jié)局比較

治療后，PRP+G-CSF組患者的化學(xué)妊娠率、臨床妊娠率為60.53%、60.53%，高于對(duì)照組的31.58%、31.58%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；兩組患者的早期流產(chǎn)率分別為4.35%、16.67%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；兩組患者均無異位妊娠發(fā)生，且PRP+G-CSF組患者無宮腔灌注不良事件發(fā)生，見表3。

表3 兩組患者妊娠結(jié)局比較[例(%)]Tab 3 Comparison of pregnancy outcomes between two groups [cases (%)]

2.4 兩組患者子宮內(nèi)膜情況比較

胚胎移植日，PRP+G-CSF組患者的子宮內(nèi)膜厚度較對(duì)照組厚，子宮內(nèi)膜血流類型GⅡ型及以上占比、C型內(nèi)膜占比高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表4。

表4 兩組患者子宮內(nèi)膜情況比較Tab 4 Comparison of endometrium between two groups

2.5 兩組患者子宮血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)水平比較

胚胎移植日，PRP+G-CSF組患者的子宮動(dòng)脈PI、RI水平均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表5。

表5 兩組患者胚胎移植日PI、RI水平比較Tab 5 Comparison of PI and RI levels between two groups on the day of embryo transfer

3 討論

伴隨胚胎實(shí)驗(yàn)室技術(shù)的不斷提高，IVF在治療不孕癥方面已取得了較好效果，但仍有5%～10%的不孕癥患者出現(xiàn)RIF，不能獲得臨床妊娠[8]。RIF是限制IVF成功率的主要原因之一，其對(duì)不孕不育患者的生理及心理都造成了極大影響，更不利于后續(xù)治療[9]。胚胎著床依賴于胚胎質(zhì)量與ER間的協(xié)調(diào)，良好的ER是胚胎能順利植入的前提，因而臨床積極治療改善ER十分重要[10]。PRP來源于自體血液，其血小板濃度為普通血漿的4～5倍，早期用于頜面外科，2015年Chang等[11]首次報(bào)告其在治療子宮內(nèi)膜≤7 mm的不孕癥婦女中具有較好的療效。Bakhsh等[12]的研究結(jié)果表明，采用PRP治療的RIF女性的妊娠率為20%，高于僅通過宮內(nèi)導(dǎo)管插入治療的13.33%，說明PRP能改善妊娠結(jié)局。G-CSF是造血系特異性細(xì)胞因子，宮腔灌注G-CSF能夠通過調(diào)節(jié)宮腔局部免疫和細(xì)胞黏附、影響子宮內(nèi)膜相關(guān)基因的表達(dá)，從調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜血管重塑等方面改善患者內(nèi)膜發(fā)育狀態(tài)、促進(jìn)子宮內(nèi)膜增厚等，減少妊娠損失[13]。羅燕群等[14]的研究結(jié)果表明，RIF患者采用宮腔灌注G-CSF 150 μg治療2次，其β-hCG陽性率、臨床妊娠率分別達(dá)到77.5%、68.4%，效果優(yōu)于灌注1次及0次者。

本研究結(jié)果顯示，治療后，PRP+G-CSF組患者的胚胎種植率、化學(xué)妊娠率和臨床妊娠率分別為46.88%、60.53%和60.53%，高于對(duì)照組的26.56%、31.58%及31.58%；兩組患者早期流產(chǎn)率的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，兩組患者均無異位妊娠發(fā)生，且PRP+G-CSF組患者無宮腔灌注不良事件發(fā)生，提示PRP聯(lián)合G-CSF宮腔灌注有助于提高RIF患者的胚胎種植，進(jìn)而改善其妊娠結(jié)局。PRP在改善胚胎植入過程中的分子機(jī)制可能為：活化的PRP可直接促進(jìn)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞、子宮內(nèi)膜基質(zhì)成纖維細(xì)胞等增殖、遷移，改善患者宮腔環(huán)境；同時(shí)在胚胎植入過程中，PRP中的生長因子可對(duì)增殖、免疫和抗炎等起到調(diào)節(jié)作用，且血小板富集血漿由患者自體提供，不會(huì)發(fā)生變態(tài)反應(yīng)，具有一定的安全性[15]。宮腔灌注G-CSF能通過血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)促進(jìn)子宮內(nèi)膜血管生成，還可通過調(diào)節(jié)自然殺傷細(xì)胞毒性影響局部免疫功能，進(jìn)而影響妊娠結(jié)局。張曦倩等[16]的研究結(jié)果表明，宮腔內(nèi)灌注G-CSF能夠通過降低γ干擾素、白細(xì)胞介素(IL)17水平以及提高IL-10、轉(zhuǎn)化生長因子β和VEGF水平來調(diào)節(jié)RIF患者Th1/Th2與Th17/Treg平衡狀態(tài)，從而提高RIF患者的胚胎種植率、臨床妊娠率。因此，PRP+G-CSF聯(lián)合宮腔灌注可能發(fā)揮協(xié)同作用，有助于提高RIF患者的胚胎種植率，改善其妊娠結(jié)局。

ER與子宮內(nèi)膜厚度、血流灌注和形態(tài)等相關(guān)，而內(nèi)膜下的血流灌注是妊娠成功的重要前提[17]。本研究中，胚胎移植日時(shí)，PRP+G-CSF組患者的子宮內(nèi)膜厚度較對(duì)照組厚，子宮內(nèi)膜血流類型GⅡ型及以上占比、C型內(nèi)膜占比均高于對(duì)照組，PRP+G-CSF組患者的子宮動(dòng)脈PI、RI水平均低于對(duì)照組，提示PRP聯(lián)合G-CSF宮腔灌注能增加RIF患者子宮內(nèi)膜厚度，改善其子宮內(nèi)膜血流、子宮內(nèi)膜形態(tài)，繼而改善患者ER。也有研究結(jié)果表明，采用宮腔灌注G-CSF治療能改善RIF患者子宮內(nèi)膜PI、RI水平，但與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)[18]。該研究結(jié)果與本研究結(jié)果不同，可能是受到測量手段影響。本研究的創(chuàng)新之處在于，將PRP與G-CSF聯(lián)合進(jìn)行宮腔灌注，發(fā)揮協(xié)同效應(yīng)，增強(qiáng)治療效果，還可以減少因其他研究[19]中使用G-CSF反復(fù)皮下注射引起的不良反應(yīng)，操作簡單、經(jīng)濟(jì)廉價(jià)，且具有一定的安全性。本研究也存在一定的不足，本研究為單中心回顧性研究，樣本量較小，且PRP用于生殖醫(yī)學(xué)的時(shí)間較短，后期將擴(kuò)大樣本量聯(lián)合多中心進(jìn)行研究；同時(shí)，PRP聯(lián)合G-CSF宮腔灌注對(duì)于子代的影響也需要進(jìn)一步研究，而兩者聯(lián)合治療對(duì)于改善胚胎著床的機(jī)制也需進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究加以驗(yàn)證。

綜上所述，PRP聯(lián)合G-CSF宮腔灌注能改善RIF患者的ER和妊娠結(jié)局。