楊杰，李蘭林

萬古霉素(vancomycin)是一種三環(huán)糖肽類抗生素，對(duì)革蘭陽性球菌抗菌作用強(qiáng)，特別是目前臨床上較棘手的嚴(yán)重耐藥金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌所致的感染有較好的療效[1]。萬古霉素于1958年被批準(zhǔn)用于臨床，因其在嚴(yán)重感染中具有重要地位，因此，萬古霉素曾被譽(yù)為“人類對(duì)付難治性耐藥菌株的最后一道防線”，通常在其他抗菌藥物無效時(shí)才應(yīng)用[2]。其主要的給藥方式是靜脈給藥，90%以上由腎臟排泄，萬古霉素的抑菌機(jī)制之一是通過其七肽骨架與細(xì)菌細(xì)胞壁糖蛋白合成啟動(dòng)子——胞壁酰五肽的末端二肽片段D-Ala-D-Lac形成5個(gè)氫鍵抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的生長(zhǎng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[3]。隨著萬古霉素的大量使用，不良反應(yīng)時(shí)有發(fā)生。萬古霉素服用量較大，腎功能不全或老年患者更易發(fā)生耳腎毒性，因此，需要通過監(jiān)測(cè)萬古霉素的血藥濃度實(shí)現(xiàn)個(gè)體化給藥方案，提高M(jìn)RSA等革蘭陽性球菌感染的治愈率,減少藥物不良反應(yīng)[4-5]。

目前國內(nèi)外對(duì)萬古霉素的血藥濃度監(jiān)測(cè)多采用免疫檢測(cè)法、微生物法及高效液相色譜法(HPLC)等。免疫檢測(cè)法試劑盒較昂貴，需集中標(biāo)本后檢測(cè)，專屬性較差，測(cè)量結(jié)果偏高，且FPID購置儀器費(fèi)用較高，受專用試劑供應(yīng)限制，因此，限制了其在臨床應(yīng)用[6-7]。微生物檢測(cè)法是利用抗菌藥物在瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)的擴(kuò)散作用，比較標(biāo)準(zhǔn)品與供試品兩者對(duì)接種的試驗(yàn)菌產(chǎn)生抑菌圈的大小，以檢測(cè)供試品效價(jià)的一種測(cè)試方法。微生物法因步驟繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)而較少使用[8]。HPLC測(cè)定萬古霉素血藥濃度多采用內(nèi)標(biāo)法，但內(nèi)標(biāo)法操作步驟較繁瑣，同時(shí)由于內(nèi)標(biāo)物的不穩(wěn)定性，檢測(cè)過程中需不斷地配制內(nèi)標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)通過建立了一種外標(biāo)法定量測(cè)定血清中萬古霉素濃度的HPLC，該法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、快速，適用于萬古霉素血藥濃度的監(jiān)測(cè)和藥動(dòng)學(xué)研究。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 試劑 乙腈(色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：20140101)；磷酸二氫鉀(分析純，廣東光華科技股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：20111129)；三氯醋酸(分析純，湖南匯虹試劑有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：20140623)；磷酸(色譜純，上海士鋒生物科技有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：T13200-500)；滅菌注射用水(安徽雙鶴藥業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)，批號(hào)：k17062107)；萬古霉素標(biāo)準(zhǔn)品(中國藥品生物制品檢定所生產(chǎn)，批號(hào)：130338-200303)。

1.2 儀器與設(shè)備 HITACHI高效液相色譜儀(日立高新技術(shù)公司生產(chǎn))；AJXDC-10氮?dú)獯祾邇x(上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司生產(chǎn))；FA114A電子天平(萬分之一，上海海康電子儀器廠生產(chǎn))；雷磁PHS-3C型pH計(jì)(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司生產(chǎn))；TDL-80-2B低速臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器生產(chǎn))；HMS-350渦旋震蕩器(天津市威儀科技發(fā)展有限公司生產(chǎn))；Lenovo微型計(jì)算機(jī)(新圓夢(mèng)F2028，北京聯(lián)想有限公司生產(chǎn))；微量進(jìn)樣器MC20 μl(上海安亭微量進(jìn)樣器廠生產(chǎn))。

2 實(shí)驗(yàn)方法選擇

2.1 流動(dòng)相的考察 本實(shí)驗(yàn)結(jié)合彭芳辰等[9]、林玉仙等[10]文獻(xiàn)，分別考察了如下流動(dòng)相的分離效果：16%甲醇：84%磷酸二氫鉀(pH 3.2)；91%鄰苯二甲酸氫鉀：9%乙腈；91%磷酸二氫鉀：9%乙腈(pH 3.2)。最終選擇流動(dòng)相為91%磷酸二氫鉀：9%乙腈(pH 3.22)。峰型良好，且無雜質(zhì)峰干擾。色譜圖見圖1-3。

圖1 16%甲醇：84%磷酸二氫鉀(pH 3.2)

圖2 91%鄰苯二甲酸氫鉀：9%乙腈(pH 3.2)

圖3 91%磷酸二氫鉀：9%乙腈(pH 3.2)

2.2 外標(biāo)法的選擇 目前國內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道中多為內(nèi)標(biāo)法測(cè)定萬古霉素血藥濃度，而去甲萬古霉素、維生素B等內(nèi)標(biāo)物是臨床常用藥物，若患者同時(shí)使用萬古霉素和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，內(nèi)標(biāo)物質(zhì)可能作為內(nèi)源性雜質(zhì)干擾檢測(cè)結(jié)果，不能準(zhǔn)確計(jì)算萬古霉素血藥濃度，因此本實(shí)驗(yàn)采取更簡(jiǎn)便的外標(biāo)法檢測(cè)。

2.3 血樣預(yù)處理的選擇 萬古霉素的提取方案有多種，國外多采用固相提取和在線提取，在線提取對(duì)儀器要求較高，蛋白沉淀法的沉淀機(jī)理是降低水的介電常數(shù)，導(dǎo)致具有表面水層的生物大分子脫水，互相聚集，最后析出。使用較多的有機(jī)溶劑有乙醇、甲醇及乙腈等。低溫可保持生物大分子活性，同時(shí)降低溶解度，提高提取效率。蛋白沉淀-HPLC快速簡(jiǎn)便經(jīng)濟(jì)，取樣量少[11-12]。本實(shí)驗(yàn)采用10%三氯醋酸對(duì)樣品進(jìn)行蛋白沉淀，得到良好的分離條件，因此確定為本實(shí)驗(yàn)血樣處理方案，見圖4。

圖4 三氯醋酸處理

3 實(shí)驗(yàn)操作方法

3.1 血漿的來源 采集健康體檢者的靜脈血，離心后，取上層清液用于制備空白血漿，備用。采集給予萬古霉素治療患者的靜脈血，離心后，取上層清液備用，作為患者血漿樣品。

3.2 色譜條件 色譜柱Agilent TC-C185 μm(150 mm×4.6 mm)；流動(dòng)相9%乙腈-91%磷酸二氫鉀(pH 3.2)；流速1.0 ml/min；柱溫25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)236 nm；進(jìn)樣量20 μl；采集時(shí)間30 min。

3.3 萬古霉素對(duì)照品溶液 精密稱取萬古霉素對(duì)照品56.3 mg于50 ml量瓶中，用注射滅菌用水溶解定容至刻度線，配制成濃度為1 126 mg/L的萬古霉素對(duì)照品儲(chǔ)備液，置于冰箱4 ℃冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

3.4 血漿樣品的處理 將患者血樣以3 500 r/min離心5 min后，吸取上層血清150 μl于離心管中，10%三氯醋酸40 μl，漩渦震蕩3 min，13 000 r/min離心12 min后，取上清液20 μl進(jìn)樣，在上述色譜條件下測(cè)定，記錄萬古霉素的峰面積。

4 方法學(xué)驗(yàn)證

4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍 取空白血漿100 μl置于試管中，精密量取不同質(zhì)量濃度、相同體積的萬古霉素對(duì)照品稀釋儲(chǔ)備液50 μl，混勻，制備成濃度分別為4.69、9.38、18.76、37.52、75.04、300.16 mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品，按“血漿樣品的處理”項(xiàng)下方法操作測(cè)定，經(jīng)HPLC分析，記錄色譜圖，測(cè)定結(jié)果見表1。以萬古霉素進(jìn)樣濃度(mg/L)為橫坐標(biāo)(X)，峰面積(A)為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。計(jì)算回歸方程為Y=10 526X+10 533，r=0.9998。結(jié)果表明，綠原酸在4.69～300.16 mg/L范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，見圖5。

表1 萬古霉素進(jìn)樣濃度與峰面積關(guān)系 (n=6)

圖5 標(biāo)準(zhǔn)曲線

4.2 方法的專屬性 分別取空白血漿和含藥血漿樣品，每個(gè)濃度各配制5份，按“血漿樣品的處理”項(xiàng)下進(jìn)行處理，測(cè)得色譜圖，見圖6、圖7。

圖6 空白血漿

圖7 含藥血漿

4.3 相對(duì)回收率實(shí)驗(yàn) 取空白血漿，加入已知濃度的萬古霉素對(duì)照品，配制成濃度分別為9.38、37.52、150.08 mg/L的血漿樣品各5份，按“血漿樣品的處理”項(xiàng)下進(jìn)行處理，測(cè)得回收率。精密度用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差RSD(RSD=SD/平均值×100%)表示，提取回收率用測(cè)得平均濃度/實(shí)際濃度×100%表示。結(jié)果見表2，提取回收率分別為107.02%、91.18%、106.56%。

表2 提取回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4.4 精密度實(shí)驗(yàn) 配制9.38、37.52、150.08 mg/L的萬古霉素血漿樣品各5份，作為一批精密度樣品，按“血漿樣品的處理”項(xiàng)下進(jìn)行處理，測(cè)得峰面積。以1 d內(nèi)每個(gè)濃度5個(gè)樣品測(cè)得的萬古霉素濃度計(jì)算日內(nèi)精密度，每天制備上述濃度血樣各5份連續(xù)測(cè)定3 d，得日間精密度，見表3。

表3 萬古霉素批內(nèi)、批間精密度 (n=5)

4.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 將萬古霉素的低、中、高濃度的血漿樣品避光放置在4 ℃的冰箱中冷凍0、24、48 h，樣品經(jīng)不同條件保存后按“血漿樣品的處理”項(xiàng)下操作進(jìn)行穩(wěn)定性考察，結(jié)果顯示見表4，精密度達(dá)到要求，但隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，萬古霉素會(huì)降解。

表4 萬古霉素穩(wěn)定性考察 (n=5)

5 討 論

本實(shí)驗(yàn)建立的HPLC法測(cè)定人血清中萬古霉素的血藥濃度，在4.69～300.16 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；方法回收率均>90%，精密度實(shí)驗(yàn)、穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)等的RSD也在規(guī)定范圍內(nèi)，符合《中國藥典》中生物樣品測(cè)定的要求。本方法具有靈敏、準(zhǔn)確、測(cè)定成本低、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，適用于人血清中萬古霉素血藥濃度監(jiān)測(cè)，有利于患者個(gè)性化治療的安全實(shí)施，為臨床用藥劑量和給藥方案調(diào)整提供重要參考依據(jù)。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突。