劉雙平，趙澤素，劉海坡，吳玉峰，毛健*

1(糧食發(fā)酵與食品生物制造國家工程研究中心(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122) 2(江南大學(xué)(紹興)產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，浙江 紹興，312000) 3(中國酒業(yè)協(xié)會，北京，100089)4(國家黃酒工程技術(shù)研究中心，浙江 紹興，312000)

紅曲酒是以糯米為原料，經(jīng)過蒸煮、拌曲、糖化發(fā)酵釀制而成的一種低度黃酒[1]。紅曲酒與其他黃酒最大的不同是以紅曲作為糖化發(fā)酵劑，從而使其酒味香醇、酯香濃厚、口感清冽爽口且酒體呈現(xiàn)獨特的棕紅色[2]。紅曲含有紅曲色素等次級代謝產(chǎn)物，賦予了酒體明亮的紅色[3]。

紅曲色素是一種天然色素，按顏色差異分為紅、橙、黃3大類。然而，由于紅曲色素對光、熱、pH等因素敏感[4]，極易發(fā)生降解，從而使紅曲酒褪色，導(dǎo)致貨架期縮短，品質(zhì)降低。穩(wěn)定紅曲酒顏色是提高紅曲酒外觀品質(zhì)的重要手段。研究發(fā)現(xiàn)光照是影響紅曲酒色價不穩(wěn)定的首要因素[5]，特別是自然光和紫外線，使得紅色素比黃色素和橙色素降解更快[6]；避光下儲存紅曲酒，能夠一定程度上提高紅色價的穩(wěn)定性[5]。然而，實驗發(fā)現(xiàn)紅曲酒在長期避光儲藏過程中仍會發(fā)生顯著的褪色現(xiàn)象，目前關(guān)于紅曲酒在避光條件下導(dǎo)致色價降低的因素仍不清楚。

紅曲酒的釀造過程是一個復(fù)雜的系統(tǒng)，其色價穩(wěn)定性可能受有機酸、氨基酸等物質(zhì)和煎酒溫度、儲存溫度、酒精度、氧氣、pH等工藝條件影響。為此，本研究探討了長期避光儲存條件下紅曲酒酒體物質(zhì)及加工儲藏指標(biāo)對紅曲酒色澤穩(wěn)定性的影響，以期為保護紅曲酒色澤提供科學(xué)方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅曲及紅曲酒樣品，福建漳州某紅曲酒工廠。

甲醇、乙腈、無水乙醇、氨基酸等(均為分析純)，國藥集團化學(xué)有限公司；酒石酸、乳酸、乙酸、兒茶素、沒食子酸、綠原酸等高效液相色譜和氣相色譜-質(zhì)譜檢測使用的化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)品，Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1800型紫外分光光度計，上海美普達儀器有限公司；Waters e2695高效液相色譜系統(tǒng)，美國Waters科技有限公司；安捷倫A1100高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司；氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，賽默飛世爾科技公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 紅曲酒的相關(guān)指標(biāo)測定方法

常規(guī)理化指標(biāo)的測定：還原糖、總酸、氨基態(tài)氮、酒精度參照GB/T 13662—2018《黃酒》進行測定。

有機酸含量和游離氨基酸含量參照劉蕓雅的方法[7]，采用HPLC法測定。

揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)參照ZHOU等[8]的方法，采用GC-MS法測定。

1.3.2 紅曲酒中色價的測定

色價參照GB 1886.19—2015《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑 紅曲米》，采用紫外分光光度計法測定。

使用紫外可見分光光度計測定溶液在410、465、510 nm的吸光度，分別表示黃色素、橙色素、紅色素含量，以A410、A465、A510表示。色素保存率的計算如公式(1)所示：

(1)

式中：A，紅曲浸提液或紅曲酒儲存后吸光度；A0，紅曲浸提液或紅曲酒儲存前吸光度。

1.3.3 酒體本身指標(biāo)對紅曲酒避光保存色價的影響

1.3.3.1 紅曲浸提液的制備

稱取一定量的紅曲按1∶10(g∶mL)的固液比溶于蒸餾水中，過濾后再重復(fù)浸泡3次，合并濾液即得紅曲浸提液。

1.3.3.2 pH值對紅曲酒色價的影響

分別用1 mol/L乳酸和1 mol/L NaHCO3溶液調(diào)整紅曲浸提液pH為3、4、5、6、7、8，之后將其靜置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中避光存放，定時取樣測定色價并計算色價保存率[9]。

1.3.3.3 有機酸、氨基酸、酚類化合物對紅曲酒色價的影響

分別調(diào)整紅曲浸提液成分3 g/L乙酸、3 g/L乳酸，3 g/L酒石酸、3 g/L檸檬酸、2 g/L 17種常見氨基酸、80 mg/L兒茶素、80 mg/L沒食子酸和80 mg/L綠原酸，裝入陶瓷瓶中，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱避光存放，定時取樣測定色價并計算色價保存率。

1.3.3.4 酒精度對紅曲酒色價的影響

用無水乙醇將紅曲浸提液的酒度調(diào)配成0%vol、5%vol、10%vol、15%vol、20%vol、28%vol、38%vol，之后裝入陶瓷瓶中，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱避光存放，定時取樣測定色價并計算色價保存率。

1.3.4 加工儲藏條件對紅曲酒避光保存色價的影響

1.3.4.1 灌裝溫度對紅曲酒色價的影響

將紅曲原酒分裝于陶瓷瓶中，密封保存，分別置于60、70、80、90、100 ℃下保溫60 min，定時取樣測定色價并計算色價保存率。

1.3.4.2 貯藏溫度和時間對紅曲酒色價的影響

將陶瓷瓶裝的紅曲原酒分別置于4、25、37 ℃條件下避光存放，定時取樣測定色價并計算色價保存率。

1.3.4.3 氧氣對紅曲酒色價的影響

將紅曲原酒分裝到外包錫箔紙的棕色補料瓶中，分別在厭氧(瓶中通入氮氣，氮吹2 min，排盡瓶內(nèi)氧氣，取樣時一邊氮吹一邊取樣)和有氧(每隔2周通入10 mL空氣)條件下避光存放，定時取樣測定色價并計算色價保存率。

1.3.5 提高紅曲酒色價穩(wěn)定性驗證實驗

用汗酒將紅曲酒酒度調(diào)到38%vol，裝到陶瓷瓶中，之后放入4 ℃冰箱中避光存放，定時取樣測定色價并計算色價保存率。

1.4 統(tǒng)計分析

所有實驗得到的數(shù)據(jù)用SPSS 22.0軟件進行Duncan’s差異顯著性分析，顯著性水平為P<0.05。實驗均重復(fù)3次，所有指標(biāo)的測定結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Origin 2018和GraphPad Prism8軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅曲酒中色價的穩(wěn)定性分析

跟蹤福建漳州某紅曲酒工廠生產(chǎn)過程中紅曲酒色價變化(圖1)，發(fā)現(xiàn)紅曲酒煎酒前后紅曲酒色價損失為5.70%，可能是由于采用高溫短時煎酒工藝，色價損失較少。在隨后的陶瓷酒壇避光常溫儲存過程中，色價隨著儲存時間延長，顯著下降。180 d后，色價下降了64.10%，酒體顏色由初始的鮮紅色變?yōu)樽攸S色，褪色現(xiàn)象顯著。雖然采用了避光保存方法，紅曲酒色價仍然會顯著降低，說明除光照外，仍然存在使紅曲酒色價不穩(wěn)定的因素。由于在儲存過程中并未有人為因素干擾，研究人員分析導(dǎo)致紅曲酒色價不穩(wěn)定的主要因素應(yīng)該包括紅曲酒的理化成分和工藝條件2個部分。

圖1 貨架期的紅曲黃酒的色價穩(wěn)定性Fig.1 Color stability of Hong Qu glutinous rice wine during shelf life

2.2 紅曲酒主要理化指標(biāo)及其對避光儲存時色價的影響

2.2.1 紅曲酒主要理化指標(biāo)

對市售紅曲酒理化指標(biāo)分析發(fā)現(xiàn)，紅曲酒的pH為4～5，有機酸是導(dǎo)致其成酸性的主要因素。醋酸、乳酸、琥珀酸、蘋果酸和酮戊二酸是紅曲酒中的主要有機酸，占總量的86.10%，其中乳酸和乙酸比例最高，分別為28.16%和35.73%。有機酸是紅曲酒中重要的風(fēng)味物質(zhì)，適量的有機酸對紅曲酒的酸味起著不可或缺的作用，對酯類物質(zhì)形成也有一定的促進作用[10]。

氨基酸是紅曲酒的主要營養(yǎng)成分之一，對紅曲酒的營養(yǎng)價值和風(fēng)味形成有重要貢獻。市售紅曲酒中游離氨基酸總量為4.12 g/L，其中苦味氨基酸占比最高，占總量的54.87%，甜味氨基酸次之，為27.22%，而鮮味氨基酸和澀味氨基酸分別僅占總量的10.51%和7.40%，因此市售紅曲酒的苦味相對較多，鮮甜味較少?？偟膩碚f，其在口感上偏苦澀，鮮甜味較少。

表1 市售紅曲酒的主要理化指標(biāo)Table 1 Main physical and chemical indexes of Hong Qu glutinous rice wine sold in market

揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)是形成紅曲酒香氣的重要成分，紅曲黃酒中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)主要包括醇類、酸類、醛類、酯類、酚類等，實驗中檢測到了14種酯類、4種醇類、4種酸類、6種醛類和5種酚類物質(zhì)。酯類含量較高，是最主要的風(fēng)味物質(zhì)，占其總量的61.75%；而酚類物質(zhì)占總量的12.82%，是紅曲酒中重要的抗氧化成分，已有研究證明酚類能夠保護色素[11]。

2.2.2 pH對避光儲存時色價的影響

由于紅曲酒中有機酸大部分為乳酸，通過添加乳酸將紅曲浸提液調(diào)整到不同pH，避光保存90 d。結(jié)果表明，紅曲色素對pH的耐受性較好，3種色素色價均在70%以上(圖2-a)。當(dāng)pH 7時，色素保存率相對較好，均在90%左右，這與張帝[9]、鄭虹等[12]對紅曲色素結(jié)論一致。當(dāng)pH為4～9時，黃色素的保存率均在90%以上，當(dāng)pH 3的強酸環(huán)境下，黃色素保存率略微下降，但仍在85%以上，說明pH在3～9范圍內(nèi)對黃色素的穩(wěn)定性幾乎無明顯影響。綜上，pH對紅曲酒色價穩(wěn)定性影響不大。

2.2.3 有機酸、氨基酸、多酚對避光儲存時色價的影響

紅曲酒體系組成較為復(fù)雜，其主要成分有機酸、氨基酸、多酚是否會影響紅曲黃酒顏色穩(wěn)定性，尚未見報道。本研究發(fā)現(xiàn)，乳酸、乙酸的添加均會降低紅曲酒色價穩(wěn)定性(圖2-b)，添加了乳酸、乙酸的紅曲浸提液避光儲存90 d后紅色素保存率為35.71%和36.22%，與對照相比，紅色素的穩(wěn)定性分別降低了13.58%和11.59%。在避光條件下，乙酸、乳酸、酒石酸、檸檬酸對溶液的顏色穩(wěn)定性影響較大，且溶液中有明顯的沉淀，這可能是由于酸加速了水與色素的相互作用，例如酯鍵斷裂[13]，從而影響了紅曲酒顏色的穩(wěn)定性。

添加了兒茶素、沒食子酸、綠原酸的紅曲浸提液避光儲存90 d后紅色素保存率分別為58.97%、51.51%、49.68%(圖2-c)，顯著高于對照組，而橙黃色素的保存率與對照組沒有明顯差異，說明多酚化合物對紅色素有一定的保護作用。已有研究發(fā)現(xiàn)，紅曲原酒中添加綠茶提取物，能夠有效提高紅曲酒陳釀過程中的色價穩(wěn)定性[14]，結(jié)合本研究結(jié)果，分析原因可能是綠茶中的兒茶素等茶多酚含量較高，緩解了色價降低[15]。然而，茶葉中含有大量的咖啡堿等使機體興奮的化合物[16]，加上紅曲酒中酒精的刺激[17]，茶葉紅曲黃酒飲用后可能導(dǎo)致頭疼、斷片等宿醉問題。

另外，單獨添加氨基酸中的甘氨酸或組氨酸后，紅色價的穩(wěn)定性分別提高了8.94%或6.99%，但整體添加17種游離氨基酸對避光保存90 d的紅曲酒色價沒有顯著影響。

2.2.4 酒精度對避光儲存時色價的影響

紅曲酒避光存放90 d后，酒度為5%vol時，紅色價和黃色價的保存率顯著降低(圖2-d)，但隨著酒度的提高(5%vol～38%vol)，3種色價的保存率均顯著升高。表明了隨酒度的升高，紅曲酒的顏色穩(wěn)定性更高。同時，在光照條件下，也發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象，如酒度的增大提高了梔子黃色素的色價穩(wěn)定性，降低了紫外光對紅曲紅色價的破壞[18]。生產(chǎn)中可以采用添加紅曲酒副產(chǎn)物-汗酒來提高紅曲酒酒度，從而提高產(chǎn)品顏色的穩(wěn)定性。

綜上，研究發(fā)現(xiàn)酒體物質(zhì)中有機酸、pH對紅曲酒顏色穩(wěn)定雖有一定影響，但效果不大；酒精度對提高紅曲酒的色價穩(wěn)定性最有效，其次是多酚化合物和氨基酸。

a-pH值；b-有機酸；c-多酚；d-酒精度圖2 避光條件下儲存90 d后酒體成分及理化指標(biāo)對紅曲酒色價的影響Fig.2 Effects of wine composition and physical and chemical indexes on color value of Hong Qu glutinous rice wine after 90 days of storage under dark conditions注：原酒為新壓榨的紅曲酒；對照為儲存90 d后的原酒，不同小寫字母表示不同色價有顯著差異(P<0.05)(下同)

2.3 加工貯藏條件對紅曲酒色價的影響

2.3.1 灌裝溫度對避光儲存時色價的影響

黃酒殺菌普遍采用熱殺菌工藝，故又稱為“煎酒”，其煎酒溫度一般為85～93 ℃[19]。黃酒生產(chǎn)采用熱灌裝，灌瓶殺菌后大量酒堆積在一起，酒體降溫較慢，因此本研究適當(dāng)延長了灌裝后的觀測時間至60 min，以評估紅曲酒灌瓶后緩慢降溫過程對色價的影響。當(dāng)溫度≤60 ℃時，紅曲色素的穩(wěn)定性較好(圖3-a)，紅曲酒中的紅色價保存率為94.63%，同時橙色素和黃色素保存率分別為93.10%和98.25%；當(dāng)溫度>70 ℃時，隨著溫度升高，色素降解的趨勢也顯著加快；當(dāng)煎酒溫度為80 ℃時，紅曲酒中的紅色素、橙色素和黃色素保存率分別為80.45%、85.41%、96.60%，當(dāng)溫度達到100 ℃時，紅曲酒中的紅色價、橙色價和黃色價保存率分別為68.60%、76.09%、92.06%。可見，經(jīng)過不同條件的加熱處理，紅曲色素中的紅色素和橙色素穩(wěn)定性均受到了破壞，隨著灌瓶溫度的提高，其降解程度加大，而黃色素在受熱條件下保存率較高，這可能是因為紅色素、橙色素由于長時間受熱，結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，并向黃色素結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，導(dǎo)致紅曲酒的棕紅色逐漸變淺，酒體逐漸呈黃色[20]，但黃色素在熱處理過程中不飽和酮結(jié)構(gòu)和鏈狀共軛雙鍵均會消失，降解產(chǎn)物為無色[21]，因此隨著儲存時間的進一步延長，紅曲酒的黃色將逐漸褪成無色。

2.3.2 貯藏溫度和時間對避光儲存時色價的影響

結(jié)合紅曲酒在實際生產(chǎn)流通過程中的情況，本研究將紅曲酒分別在4、25、37 ℃下避光存放，每隔一定時間測定色價。避光儲存90 d后，4 ℃下紅色價、橙色價和黃色價的保存率分別為69.19%、74.82%和78.12%(圖3-b)，25和37 ℃下色價保存率均顯著降低，尤其是紅色價保存率分別僅為45.95%和34.69%，說明避光條件下，室溫儲存是導(dǎo)致色價降低的主要因素，低溫(<4 ℃)儲運是保證紅曲酒色價穩(wěn)定性的有效方式。多數(shù)天然色素對熱敏感，如花青素[22]和蘿卜藍色素[23]。研究發(fā)現(xiàn)紅曲黃色素的熱降解與光降解機制不同，黃色素在光照下褪色是因為α,β-不飽和酮結(jié)構(gòu)的助色基團消失，而熱降解是因為生色基團α,β-不飽和酮結(jié)構(gòu)及共軛雙鍵均受到破壞，顏色直接消失[21]，橙色素在光照下褪色是由于其發(fā)生了電子能級躍遷，提高了光降解能量，從而加快褪色，紅色素的光降解機制與黃色素一致[24]，然而關(guān)于紅色素和橙色素?zé)峤到鈾C制仍有待探索。

a-灌裝溫度；b-氧氣及儲存溫度圖3 避光條件下儲存90 d后加工儲存條件對 紅曲酒色價的影響Fig.3 Influence of processing and storage conditions on color value of Hong Qu glutinous rice wine after 90 days of storage under dark conditions

2.3.3 氧氣對避光儲存時色價的影響

紅曲酒在陶壇儲存過程中，陶壇壁微孔能夠緩慢滲入氧氣，促進酒體陳化，但尚不清楚氧氣是否能夠影響紅曲酒避光儲存過程中顏色的穩(wěn)定性。通過定時通入定量氧氣，研究了氧氣對不同儲存溫度(4、25、37 ℃)下紅曲酒色價的影響(圖3-b)。發(fā)現(xiàn)氧氣不影響紅曲酒色價穩(wěn)定性，與徐海笑等[21]研究類似。

2.4 提高紅曲酒色價穩(wěn)定性的策略

通過對紅曲酒成分以及加工儲藏條件的分析，發(fā)現(xiàn)pH、有機酸、溫度和氧氣影響了紅曲酒顏色穩(wěn)定性，其中，溫度是影響紅曲酒顏色穩(wěn)定性的首要因素，灌裝溫度比儲存溫度對紅曲酒色價穩(wěn)定影響大；而氨基酸、多酚、乙醇可以延緩紅曲酒色素降解，前兩者雖起到了一定作用，但作用遠不如酒精度。

雖然紅曲酒生產(chǎn)采用高溫殺菌，但高溫瞬時殺菌裝備、超高溫瞬時滅菌等裝備的出現(xiàn)，能夠有效縮短殺菌時間，從而避免煎酒對色價的破壞。儲運過程雖然溫度低，但時間長，是導(dǎo)致紅曲酒色價降低的主要原因。根據(jù)上述研究結(jié)論，提出提高酒度、降低儲存溫度的紅曲酒生產(chǎn)方式(圖4)。通過汗酒調(diào)整酒度為38%vol，在4 ℃下避光存放90 d后的色素保存率為91.27%，是單獨4 ℃下儲存的1.25倍，是現(xiàn)有室溫存放的2.27倍；存放120 d后，其色素保存率為87.73%，是單獨4 ℃下儲存的1.23倍，是現(xiàn)有室溫存放的2.32倍。因此，高酒度低溫儲存是保護紅曲酒色價穩(wěn)定性的有效方法。

圖4 避光條件下紅曲酒在不同酒度和溫度下色價穩(wěn)定性Fig.4 Color stability of Hong Qu glutinous rice wine at different temperatures under the condition of avoiding light

3 結(jié)論

紅曲酒在貨架期的顏色穩(wěn)定對于其在食品行業(yè)的發(fā)展具有重要意義。本文研究了避光條件下不同因素對紅曲黃酒顏色穩(wěn)定性的影響。研究結(jié)果表明，避光儲存條件下，各因素對色價的降解能力分別是：灌裝溫度>儲存溫度>pH>有機酸>氧氣；而對紅曲酒顏色穩(wěn)定性的提高能力分別是4 ℃儲存>酒精度>多酚成分>氨基酸。

雖然灌裝溫度對紅曲酒的影響最大，但因高溫灌裝殺菌是一個必要的過程，因此可以通過控制儲存溫度和酒度來使紅曲酒色價保持穩(wěn)定。本研究發(fā)現(xiàn)4 ℃儲存對紅曲酒的護色效果最好。此外，紅曲酒煎酒產(chǎn)生的副產(chǎn)物汗酒可以用來提高酒度，既可省去黃酒滅菌這一過程，同時還可將副產(chǎn)物加以利用，節(jié)約資源。因此，綜合考慮，紅曲酒過濾完后加入汗酒調(diào)節(jié)酒度到38%vol，之后放入4 ℃條件下儲存以達到護色的效果。

汗酒的使用可以有效提高紅曲酒副產(chǎn)物的附加值，4 ℃冷藏存放工藝在黃酒行業(yè)內(nèi)業(yè)已成熟，如張家港釀酒有限公司、會稽山紹興酒股份有限公司均已采用冷藏儲酒，相關(guān)技術(shù)可快速在紅曲酒行業(yè)推廣。