譚海玲，黃濤，陳功，石侃，張薄博，許贛榮，吳振強(qiáng)*

1 (華南理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州, 510006)2 (武漢工程大學(xué) 環(huán)境生態(tài)與生物工程學(xué)院，湖北 武漢, 430205) 3 (西北農(nóng)林科技大學(xué) 葡萄酒學(xué)院，陜西 楊凌, 712100) 4 (糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué)),江蘇 無錫, 214122) 5(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122)

紅曲色素是紅曲菌次級代謝物，通常是紅、橙、黃三類色素的混合物，作為天然食用色素已具有悠久歷史，廣泛應(yīng)用在肉制品加工、醬油、果汁飲料、化妝品中[1]。早期主要是以紅曲紅色素的形式被大眾接受，隨著紅曲黃色素的研究深入，紅曲黃色素產(chǎn)品凸顯出了巨大的市場潛力。紅曲色素的應(yīng)用源于東南亞國家，隨著全球經(jīng)濟(jì)一體化的發(fā)展，國際市場對紅曲色素的需求量日益增加[2-3]。制約我國紅曲色素進(jìn)入國際市場的瓶頸主要是產(chǎn)品中桔霉素含量無法達(dá)到國際認(rèn)可的標(biāo)準(zhǔn)，日本食品添加劑協(xié)會將紅曲色素中桔霉素的限量指標(biāo)定為0.2 mg/kg，歐盟對紅曲霉發(fā)酵大米食品補(bǔ)充劑中最大限量值為2 mg/kg[4]。因此，制定先進(jìn)科學(xué)的國家標(biāo)準(zhǔn)，提升紅曲色素品質(zhì)，是提高我國紅曲色素產(chǎn)業(yè)國際競爭力的關(guān)鍵。

然而，目前只有紅曲紅色素的國家標(biāo)準(zhǔn)以及還原型紅曲黃色素的國家標(biāo)準(zhǔn)，還未有天然紅曲黃色素的國家標(biāo)準(zhǔn)出臺，嚴(yán)重制約著紅曲黃色素的開發(fā)利用。因此，亟需行業(yè)內(nèi)人士參與探討并制定更加完善的紅曲黃色素國家標(biāo)準(zhǔn)。本文將分別綜述天然紅曲黃色素的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，并與國家標(biāo)準(zhǔn)GB 1886.66—2015提及的還原型紅曲黃色素作比較，希望行業(yè)內(nèi)外對紅曲黃色素有更加深入的認(rèn)識，為充實(shí)和完善紅曲黃色素的國家標(biāo)準(zhǔn)等提供參考。

1 天然紅曲黃色素與還原型紅曲黃色素的分子結(jié)構(gòu)比較

1.1 天然紅曲黃色素

近年來，紅曲黃色素受到國內(nèi)外眾多研究者的關(guān)注，不斷有新型色素被發(fā)現(xiàn)。CHEN等[5]總結(jié)了從1932—2011年被報道的35種紅曲黃色素，其中31種屬于天然紅曲黃色素；水溶性紅曲黃色素有6種，其中只有2種是天然紅曲黃色素。LIU等[6]在2016年使用紅曲菌突變菌株ΔMpigJ-R發(fā)酵大米，得到新的紅曲黃色素M7PKS-1。HUANG等[7]在2017年使用紅曲菌MonascusruberCGMCC10910經(jīng)過液態(tài)發(fā)酵得到4種水溶性天然紅曲黃色素Y1，Y2，Y3，Y4，經(jīng)初步鑒定，Y1為已報道黃色素Azanigerone E，其他色素結(jié)構(gòu)尚未報道。同年，CHENG等[8]使用產(chǎn)黃色素紅曲菌突變菌株進(jìn)行大米固態(tài)發(fā)酵，得到1種新的紅曲黃色素Monascusmellein，經(jīng)過結(jié)構(gòu)鑒定，該色素為雙氫異香豆素衍生物。表1給出了已報道的天然紅曲黃色素的特性參數(shù)，包括分子式、分子量和最大紫外吸收值等，部分新型色素結(jié)構(gòu)特性有待進(jìn)一步研究補(bǔ)充。

紅曲色素是一系列聚酮化合物的混合物，其聚酮合成途徑可分為2個分支：1個分支是經(jīng)過聚酮體合酶的催化，3分子丙二酰CoA和1分子乙酰CoA生成四酮化合物，接著以四酮化合物為底物，形成聚酮發(fā)色團(tuán)[22]；另1個分支是乙酸和丙二酸在脂肪酸合成酶的作用下生成β-酮酸[23]。該2種途徑合成的產(chǎn)物在色素合酶的作用下形成胞內(nèi)色素，胞內(nèi)色素經(jīng)糖基化或?；磻?yīng)可轉(zhuǎn)化為胞外水溶性色素。使用不同的菌種、發(fā)酵底物、培養(yǎng)條件會對紅曲色素的結(jié)構(gòu)帶來差異，從而造成天然紅曲黃色素結(jié)構(gòu)的多樣性，代表性的天然紅曲黃色素結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1 部分天然紅曲黃色素結(jié)構(gòu)Fig.1 Structures of some natural Monascusyellow pigments

在日本，Yaegaki BioIndustry公司已經(jīng)采用發(fā)酵模式大規(guī)模生產(chǎn)天然紅曲黃色素，實(shí)現(xiàn)商品化生產(chǎn)，商品名為High-moon Yellow S 200A的產(chǎn)品主要以如圖2兩種物質(zhì)組成[24]，分別是Xanthomonasin A及其異構(gòu)體。

圖2 組成High-moon Yellow S 200A產(chǎn)品的紅曲黃色素分子結(jié)構(gòu)Fig.2 Structures of natural Monascus yellow pigments in High-moon Yellow S 200A

1.2 還原型紅曲黃色素

中國于2015年11月13日發(fā)布了“食品添加劑

紅曲黃色素”國家標(biāo)準(zhǔn)(GB 1886.66—2015)[25]，該標(biāo)準(zhǔn)中紅曲黃色素是以紅曲米為原料，經(jīng)堿液洗脫分離制得紅曲紅(或直接以紅曲紅為原料)，然后通過堿解反應(yīng)生成羧酸鹽，以特定的含氧硫化物作為還原劑，使紅色素中的環(huán)羰基還原成羥基，從而生成水溶性紅曲黃色素。在結(jié)構(gòu)上，GB 1886.66還原型紅曲黃色素是在微生物代謝后運(yùn)用化學(xué)法改性而得到的紅曲色素衍生物，與直接發(fā)酵生產(chǎn)的天然紅曲黃色素有相似的骨架。經(jīng)過結(jié)構(gòu)分析，認(rèn)為紅曲紅色素與連二亞硫酸鈉在堿性溶液中進(jìn)行反應(yīng)，紅曲紅色素分子中的內(nèi)酯被水解，生成羧酸鹽和醇，同時引入磺酸基，制得水溶性紅曲黃色素[26]。YANG等[27]以市場上流通的水溶性紅曲黃色素為研究對象，進(jìn)行分離純化，鑒定出8種主體組分的結(jié)構(gòu)，其中化合物3、化合物7和化合物8為水溶性紅曲黃色素的主要組分，而化合物7與化合物8均含有磺酸基，如表2所示。

表2 含有磺酸基的還原型紅曲黃色素[26]Table 2 Reduced Monascus yellow pigments with sulfonic acid group

2 天然紅曲黃色素與轉(zhuǎn)化紅曲黃色素的性能比較

2.1 溶解性與穩(wěn)定性

2.1.1 天然紅曲黃色素

天然紅曲色素可分成親水性和疏水性兩大類，大部分天然紅曲色素是疏水性色素，在乙醇、丙酮、乙酸乙酯等有機(jī)溶劑中溶解性較好；而天然水溶性紅曲色素較少，可以從紅曲菌液態(tài)發(fā)酵的液體中直接分離得到[28]。張慶慶等[29]比較天然水溶性和醇溶性紅曲色素的光穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)在相同光照條件下，水溶性色素光穩(wěn)定性大于醇溶性色素；同時得出波長較長的單色光對天然紅曲色素的保存率影響較低，而紫外線對天然紅曲色素的穩(wěn)定性影響較大。楊玲等[30]對液態(tài)發(fā)酵的天然紅曲黃色素的穩(wěn)定性進(jìn)行了深入的研究，結(jié)果顯示紅曲黃色素在酸性條件下較穩(wěn)定，顏色趨于亮黃色；而在中、堿性條件下顏色變成紅色。在熱穩(wěn)定性方面，紅曲黃色素溶液在100 ℃下加熱60 min，吸光度殘存率為95%，經(jīng)80 ℃烘箱加熱2 d，吸光度殘存率在70%以上；說明天然紅曲黃色素具有較好的耐熱性。另外，添加0.03%的茶多酚可以明顯提高紅曲黃色素的光穩(wěn)定性。楊強(qiáng)等[31]研究發(fā)現(xiàn)Na+、K+、Ca2+和Zn2+對液態(tài)發(fā)酵的天然紅曲黃色素基本無影響，但Fe2+和Cu2+會使黃色素發(fā)生變色并產(chǎn)生沉淀。

與還原型紅曲黃色素不同，天然紅曲黃色素在我國尚未實(shí)現(xiàn)工業(yè)化，對其穩(wěn)定性研究有待加強(qiáng)。

2.1.2 還原型紅曲黃色素

蘇金為等[32]對還原法生產(chǎn)的水溶性紅曲黃色素的性質(zhì)進(jìn)行研究，顯示其最大吸收波長是476 nm，即國家標(biāo)準(zhǔn)GB 1886.66描述的紅曲黃色素的最大吸收波長，與天然紅曲黃色素的最大吸收波長(一般為410 nm左右)不一致。還原法生產(chǎn)的紅曲黃色素可以溶于多種偏極性的溶劑，很難溶解于非極性的溶劑，水溶液下顯橙黃色，固體狀態(tài)下100 ℃加熱2 h，吸光度下降小于5%，對各種金屬離子穩(wěn)定。容艷筠等[33]研究了還原法生產(chǎn)的紅曲黃色素的耐酸堿、耐高溫高壓和光熱穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)其在pH值為3～10的范圍內(nèi)穩(wěn)定性基本不變化，100 ℃下水浴加熱，0.1 MPa、121 ℃下滅菌，太陽光照射，紫外光照射等條件下，色素殘留率均較高，說明該色素光熱穩(wěn)定性好。

2.2 生物活性

2.2.1 天然紅曲黃色素

研究表明天然紅曲黃色素不僅具有降血糖、降血壓、降血脂的功能，還具有抗炎癥、抗癌癥、抗腫瘤等功能[34-39]。大部分研究主要集中在2種經(jīng)典的醇溶性天然紅曲黃色素紅曲素和安卡紅曲黃素。LEE等[40]研究發(fā)現(xiàn)紅曲素可以增強(qiáng)PPAR-γ結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，阻止其磷酸化，同時抑制c-Jun氨基末端激酶的激活，從而改善胰島素抵抗癥狀。LIN等[41]報道，紅曲素和安卡黃素可以降低由腫瘤壞死因子TNF-α誘導(dǎo)的內(nèi)皮黏附性，減少與炎癥相關(guān)的血管疾病的發(fā)生。AKIHISA等[42]使用小鼠模型，發(fā)現(xiàn)紅曲素可以減少由過氧化硝酸或者紫外誘導(dǎo)的皮膚癌。SU等[43]發(fā)現(xiàn)安卡紅曲黃素對人體肝癌細(xì)胞株Hep G2和肺癌細(xì)胞A459有明顯的抑制作用，半抑制濃度均為15 μg/mL，相同濃度安卡紅曲黃素對人體正常細(xì)胞MRC-5和WI-38并沒有細(xì)胞毒性。CHENG等[44]研究發(fā)現(xiàn)紅曲素和安卡紅曲黃素通過抑制Akt / NF-κB/ p38信號通路誘導(dǎo)活化的肝星狀細(xì)胞凋亡，從而達(dá)到預(yù)防肝硬化的作用。SHAYMAA等[45-46]把紅曲素和安卡黃素裝載于納米膠束中，增強(qiáng)其對乳腺癌細(xì)胞的抑制作用。CHENG等[47]使用酒精誘導(dǎo)小鼠肝損傷模型，發(fā)現(xiàn)紅曲素和安卡紅曲黃素通過調(diào)節(jié)抗氧化酶和酒精代謝酶的活性從而保護(hù)肝細(xì)胞。這些研究成果表明，一定劑量的天然紅曲黃色素可以在醫(yī)藥領(lǐng)域中應(yīng)用。

2.2.2 還原型紅曲黃色素

目前還沒有學(xué)者對還原型紅曲黃色素(GB 1886.66國標(biāo)方法生產(chǎn))的生物活性進(jìn)行報道。陳冠敏等[48]對市售紅曲黃色素進(jìn)行亞慢性毒性試驗(yàn)，得出在一定使用范圍內(nèi)，紅曲黃色素對人體健康不存在潛在的毒性作用,可以作為著色劑應(yīng)用在食品加工業(yè)。GB 1886.66紅曲黃色素在生產(chǎn)過程中使用硫化物，可能會造成原料的殘留，因此在生產(chǎn)過程中需要嚴(yán)格的質(zhì)量控制體系。

3 紅曲黃色素國家標(biāo)準(zhǔn)改進(jìn)的思考

隨著紅曲色素研究的深入，對色素的組成及分子特性有了更科學(xué)的理解，因此相應(yīng)的國家標(biāo)準(zhǔn)也不斷完善，如2016年發(fā)布的“紅曲紅”國家標(biāo)準(zhǔn)(GB 1886.181—2016)[49]是第3次修訂，前2次分別于2005年(GB 15961— 2005)和1995年(GB 15961—1995)發(fā)布。紅曲黃色素的開發(fā)稍晚，其國家標(biāo)準(zhǔn)(GB1886.66—2015)于2015年底首次發(fā)布，其中生產(chǎn)工藝中使用的原料連二亞硫酸鈉，是一級遇濕易燃物品，在空氣中易氧化，同時發(fā)出刺激性酸味，與大多數(shù)氧化劑混合，具有爆炸危險性，因此生產(chǎn)過程對員工的安全保護(hù)要求較高[50]。隨著直接發(fā)酵生產(chǎn)天然紅曲黃色素技術(shù)水平的提高[51-55]，在適當(dāng)?shù)臅r間可以對還原型紅曲黃色素國標(biāo)(GB 1886.66—2015)進(jìn)行修訂，補(bǔ)充直接發(fā)酵的天然紅曲黃色素生產(chǎn)工藝，使非轉(zhuǎn)化的天然紅曲黃色素生產(chǎn)與銷售合法化，推動天然安全性食品添加劑的發(fā)展。

3.1 生產(chǎn)原料及工藝改進(jìn)

GB 1886.66—2015國家標(biāo)準(zhǔn)的使用范圍是以紅曲米作為原料，經(jīng)堿液洗脫，分離制得紅曲紅(或直接以紅曲紅為原料)，經(jīng)硫化物磺化、干燥制成的食品添加劑紅曲黃色素。然而，通過紅曲菌液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)、提取、濃縮、精制而成的或者以紅曲谷物為原料，經(jīng)過萃取、濃縮、精制直接得到的天然紅曲黃色素并不在此使用范圍內(nèi)。建議增加相關(guān)內(nèi)容，將直接發(fā)酵生產(chǎn)的天然紅曲黃色素納入其中，擴(kuò)大GB 1886.66—2015國家標(biāo)準(zhǔn)的使用范圍，使天然紅曲黃色素得到認(rèn)可。

3.2 產(chǎn)品形態(tài)改進(jìn)

國家標(biāo)準(zhǔn)GB 1886.66—2015描述紅曲黃色素的狀態(tài)為“粉末”。有研究發(fā)現(xiàn)天然紅曲黃色素的穩(wěn)定性與所處的環(huán)境有關(guān)，并且在酸性條件下較穩(wěn)定，為提高天然紅曲黃色素穩(wěn)定性，一般將其儲存在酸性液體中。所以建議增加“糊狀”“液體”2種狀態(tài)的國家標(biāo)準(zhǔn)制定，提高紅曲黃色素的品質(zhì)，使紅曲色素產(chǎn)品形式多元化。

3.3 檢測鑒定方法改進(jìn)

在鑒別試驗(yàn)方面，GB 1886.66—2015描述紅曲黃色素的溶解性為“易溶于水”。天然紅曲黃色素可分為疏水性色素和親水性色素，且大部分為疏水性色素。大量研究表明，天然紅曲黃色素具有豐富的生物活性，所以應(yīng)促進(jìn)醇溶性色素的市場應(yīng)用。因此，在檢測方法方面，應(yīng)該對不同溶解性的紅曲黃色素設(shè)置不同的檢測方法，其中醇溶性色素應(yīng)該使用乙醇溶液進(jìn)行稀釋及色價分析。

GB 1886.66—2015紅曲黃色素色價的檢測標(biāo)準(zhǔn)為(476±10) nm。根據(jù)目前文獻(xiàn)報道，大部分天然紅曲黃色素的特征波長在330～450 nm的范圍內(nèi)[5, 14-15, 17, 20, 56]，而且具有不同特征波長的紅曲黃色素以不同比例混合時，最終產(chǎn)品的最大吸收波長會相應(yīng)移動[57]。如果以GB 1886.66—2015規(guī)定的檢測波長檢測天然紅曲黃色素的色價，會造成部分產(chǎn)品的色價偏低，無法真實(shí)反應(yīng)產(chǎn)品的品質(zhì)。因此，建議使用分光光度計(jì)測定天然紅曲黃色素溶液在330～450 nm范圍內(nèi)的最大吸收峰，根據(jù)最大吸收峰的吸光值計(jì)算出色價。另外，GB 1886.66—2015規(guī)定色價大于或者等于100，這個規(guī)定可以在一定程度上保證產(chǎn)品的質(zhì)量，但也限制了一些具有豐富生物活性、色價偏低的天然紅曲黃色素產(chǎn)品的發(fā)展；參照“紅曲紅”國家標(biāo)準(zhǔn)(GB 1886.181—2016)中對色價的指標(biāo)，建議將紅曲黃色素色價的指標(biāo)改為“符合聲稱”。

4 結(jié)論

隨著天然紅曲黃色素生產(chǎn)技術(shù)的提高和發(fā)展，現(xiàn)有紅曲黃色素國家標(biāo)準(zhǔn)GB 1886.66—2015并不能代表先進(jìn)的紅曲黃色素生產(chǎn)技術(shù)，相反會抑制天然紅曲黃色素的開發(fā)和潛在功能價值的發(fā)現(xiàn)。因此，建議在現(xiàn)有紅曲黃色素國家標(biāo)準(zhǔn)GB 1886.66—2015的基礎(chǔ)上，進(jìn)行一定補(bǔ)充完善，從紅曲黃色素種類、使用范圍、感官要求、鑒別試驗(yàn)、理化指標(biāo)以及檢測方法等方面增加相關(guān)內(nèi)容，使直接發(fā)酵生產(chǎn)的非還原性天然紅曲黃色素合法化，促進(jìn)紅曲黃色素產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展，為社會提供新型安全的天然色素產(chǎn)品。