劉朋，李恒*，龔勁松，蔣敏，許泓瑜，許正宏,3，史勁松*

1(糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點實驗室(江南大學(xué))，江南大學(xué) 生命科學(xué)與健康工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122) 2(糧食發(fā)酵與食品生物制造國家工程研究中心(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122) 3(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122)

殼寡糖(chitooligosaccharides，COS)是由海洋生物甲殼提取而成的低聚寡糖，其在抗炎、降血脂、提高免疫力及保肝等方面具有良好療效[8]。COS能夠顯著降低糖尿病小鼠血糖水平，改善胰島細(xì)胞功能并抑制腸道對葡萄糖的攝取[9]，但作用機制并不完全明晰。鑒于COS的藥理作用往往與其聚合度息息相關(guān)[10]。因此，本研究旨在探究COS及其組成單體對胰島素誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞胰島素抵抗的改善作用，為COS的降糖、保肝等生物活性應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

HepG2細(xì)胞由本實驗室保存；COS(成分為殼二糖、殼三糖和殼四糖，占比分別為28.4%、50.07%和21.53%)，揚州日興生物科技股份有限公司；殼二糖、殼三糖、殼四糖標(biāo)準(zhǔn)品，青島博智匯力公司；胰島素、二甲雙胍、DMEM培養(yǎng)基及葡萄糖檢測試劑盒，Sigma公司；CCK-8試劑盒，日本同仁化學(xué)；抗體胰島素受體(insulin receptor，IR)、胰島素受體底物(insulin receptor substrate，IRS-1)，Abcam公司；磷酸化蛋白激酶B(phosphate protein kinase B，p-PKB/p-Akt)、蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/Akt)、葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4(glucose transporter 4，GLUT4)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)，Cell Signaling Technology公司。

1.2 主要儀器

SpectraMaxM2e多功能酶標(biāo)儀，美國molecular devices公司；T100型PCR分析儀、CFX96TMTouch熒光定量PCR分析儀，美國Bio-Rad公司；Tanon 4800 Multi化學(xué)發(fā)光圖像分析儀，上海天能科技公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 細(xì)胞活力檢測

HepG2細(xì)胞在含體積分?jǐn)?shù)10%血清和1%青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基中，于37 ℃、5% CO2的濕潤環(huán)境中培養(yǎng)。

HepG2細(xì)胞(2×104個/孔)培養(yǎng)于96孔板中至完全貼壁后，更換添加待測藥物(干預(yù)組)的新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)孵育24 h，不添加藥物的培養(yǎng)孔為對照組，無細(xì)胞的培養(yǎng)孔為空白組。然后，再次吸去每孔培養(yǎng)基，并用pH 7.5的PBS洗3遍后，加入含有10% CCK-8溶液的等體積無血清培養(yǎng)基，避光孵育2 h后于450 nm波長下測OD值(n=3)。根據(jù)公式(1)計算細(xì)胞活力。

(1)

1.3.2 HepG2細(xì)胞胰島素抵抗模型的建立

而此時，城中早已看不到鱗次櫛比的樓宇殿閣、整齊有序的房屋建筑和寬闊筆直的街道，只剩下狼藉一片。一堵堵居民房屋的殘墻孤獨而立，那些散布遍地的磚石瓦當(dāng)、鐵器銅鏃、泥佛遺物無不訴說著當(dāng)年的繁榮與興旺。走在黑城里，有一種強烈的時光逆流的感覺，夕陽照在殘垣斷壁上，看著千年以前的古建筑變成金黃色，在湛藍(lán)的天幕下，有一種無言的悲壯和蒼涼。

HepG2細(xì)胞(2×104個/孔)于96孔板中培養(yǎng)貼壁后，更換不含或含不同濃度胰島素(0.1 ～ 50 μmol/L)的DMEM培養(yǎng)基，分別設(shè)為對照組和模型組，繼續(xù)培養(yǎng)24、36或48 h，無細(xì)胞的培養(yǎng)孔為空白組。漂洗3遍后更換新鮮無血清培養(yǎng)基繼續(xù)孵育12 h，檢測培養(yǎng)基中葡萄糖含量及細(xì)胞活力情況(n=3)。葡萄糖消耗量按公式(2)計算。

葡萄糖消耗量/(μmol·L-1)=c(空白)-c(對照/模型)

(2)

1.3.3 COS對葡萄糖消耗量的影響

參照1.3.2建立胰島素抵抗模型，PBS洗3遍并更換含有不同濃度COS或其組分的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。低劑量組100 μg/mL，高劑量組200 μg/mL，陽性組二甲雙胍2 mmol/L，對照組則給予相同體積的DMEM培養(yǎng)基。之后，更換無血清培養(yǎng)基繼續(xù)孵育12 h。取培養(yǎng)基上清液對其進(jìn)行葡萄糖水平檢測(n=3)。

1.3.4 RT-PCR分析

通過TRIzol法提取細(xì)胞總RNA[11]，1 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)體系：200 ng cDNA，5 nmol/L上下游引物，5 μL SYBR Green混合物，并在95 ℃、15 s，60 ℃、30 s條件下運行40個循環(huán)。通過RT-PCR系統(tǒng)測定靶基因的相對表達(dá)水平，并用2-(△△CT)方法進(jìn)行分析。測定的目標(biāo)基因為IR、IRS-1、GLUT4、過氧化物酶體增生物激活受體-γ輔激活子-1α(peroxisome proliferator activated receptor γ coactivator 1α，PGC-1α)、叉頭轉(zhuǎn)錄因子1(fork head transcription factor，F(xiàn)oxo1)、白細(xì)胞介素6(interleukin，IL-6)和β-肌動蛋白(β-actin)(表1)。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.3.5 Western Blot分析

細(xì)胞重懸于添加了磷酸酶抑制劑和蛋白酶抑制劑的裂解液中，冰上渦旋10 s，靜置1 min，反復(fù)操作3次。4 ℃、12 000 r/min離心20 min，取上清液，獲得總蛋白。蛋白定量后，與Loading buffer混勻沸水浴10 min。蛋白通過SDS-PAGE分離后，凝膠迅速轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上，并進(jìn)行電轉(zhuǎn)。封閉2 h后，一抗4 ℃孵育過夜。洗滌緩沖液蕩洗3遍后二抗室溫孵育1～2 h，通過化學(xué)發(fā)光法對目標(biāo)蛋白顯影，并通過image J軟件定量分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單向方差分析法進(jìn)行分析，通過GraphPad Prism 5軟件作圖分析。P<0.05為具有顯著性差異。與對照組比較，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001，與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，ns為無統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 HepG2細(xì)胞胰島素抵抗模型的建立

高濃度胰島素刺激是建立胰島素抵抗模型的常用方法之一，如圖1-a所示，50 μmol/L胰島素孵育細(xì)胞24 h即能夠顯著降低其葡萄糖消耗量(P<0.05)；在刺激36 h和48 h后，5 μmol/L胰島素也能夠明顯抑制HepG2細(xì)胞的葡萄糖消耗量(P<0.05)(圖1-b，圖1-c)。同時，為了評估胰島素對HepG2細(xì)胞的毒性作用，通過CCK-8法檢測細(xì)胞增殖情況，如圖1-d所示，孵育24 h時，胰島素刺激無細(xì)胞毒性(P>0.05)；孵育36 h時，50 μmol/L胰島素顯著引起細(xì)胞毒性(P<0.05)(圖1-e)；圖1-f顯示，孵育48 h時，10和50 μmol/L的胰島素均可以明顯引起細(xì)胞毒性(P<0.05)。綜合考慮，選擇5 μmol/L胰島素對HepG2細(xì)胞刺激36 h為誘導(dǎo)胰島素抵抗的造模條件。

a-胰島素刺激細(xì)胞24 h葡萄糖消耗量；b-胰島素刺激細(xì)胞36 h葡萄糖消耗量；c-胰島素刺激細(xì)胞48 h葡萄糖消耗量； d-胰島素刺激細(xì)胞24 h細(xì)胞存活率；e-胰島素刺激細(xì)胞48 h細(xì)胞存活率；f-胰島素刺激細(xì)胞36 h細(xì)胞存活率圖1 HepG2細(xì)胞的胰島素抵抗模型建立Fig.1 Establishment of insulin-resistant HepG2 cell model

2.2 COS對HepG2細(xì)胞增殖活性影響

為探究COS對HepG2細(xì)胞的毒性作用，CCK-8法檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，COS在15.625～1 000 μg/mL質(zhì)量濃度下對HepG2細(xì)胞無毒性作用(P>0.05)(圖2)。

圖2 COS對HepG2細(xì)胞毒性分析Fig.2 Cytotoxicity analysis of COS and chitotriose on HepG2 cells

2.3 COS對HepG2細(xì)胞胰島素抵抗的改善作用

如圖3所示，高劑量組的COS能夠顯著促進(jìn)胰島素抵抗HepG2細(xì)胞的葡萄糖消耗量(P<0.05)。COS能夠改善2型糖尿病小鼠空腹血糖水平、口服糖耐量、飲水量和體重等[12]。細(xì)胞水平上，COS可以逆轉(zhuǎn)胰島細(xì)胞損傷、提高肝細(xì)胞和小腸上皮中糖轉(zhuǎn)運蛋白水平以促進(jìn)葡萄糖吸收[13]。雖然COS改善葡萄糖代謝的詳細(xì)機制并未完全清楚，但是以上結(jié)果體現(xiàn)了COS確實具有顯著的降血糖、促進(jìn)葡萄糖代謝作用。

圖3 COS對胰島素抵抗HepG2細(xì)胞的緩解作用Fig.3 Alleviative effect of COS on insulin resistant HepG2 cells

2.4 不同COS單體對胰島素抵抗HepG2細(xì)胞的作用

為進(jìn)一步探討不同COS單體對HepG2細(xì)胞胰島素抵抗的作用，對殼二糖、殼三糖和殼四糖的作用進(jìn)行評價。如圖4所示，不同濃度下的殼二糖和殼四糖對胰島素抵抗的HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗量并無明顯的改善效果(P>0.05)，而殼三糖可以明顯地提高胰島素抵抗細(xì)胞的葡萄糖消耗量(P<0.05)。不同聚合度COS因攜帶的電荷量、與作用受體親和力等差異而具有不同的生物活性[14]。本研究中，殼三糖對胰島素抵抗HepG2細(xì)胞的改善作用表現(xiàn)出最優(yōu)效果，這可能與其相關(guān)受體具有更高的親和力等原因有關(guān)。綜上，COS組分中的殼三糖對胰島素抵抗HepG2細(xì)胞具有顯著的改善效果。

a-殼二糖；b-殼三糖；c-殼四糖圖4 不同COS單體對HepG2細(xì)胞胰島素抵抗的改善作用Fig.4 Improvement of insulin resistance of HepG2 cells by COS with different degree of polymerization

2.5 HepG2細(xì)胞胰島素抵抗相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平

正常情況下，胰島素的主要作用方式為與下游IR結(jié)合，結(jié)合胰島素后的IR與下游IRS-1進(jìn)一步發(fā)生酪氨酸磷酸化反應(yīng)，活化后的IR/IRS-1復(fù)合體進(jìn)一步與Akt結(jié)合，促使其磷酸化[15-16]。磷酸化的Akt會進(jìn)一步使下游靶蛋白磷酸化引起一系列級聯(lián)反應(yīng)，最終引起GLUT4移位到細(xì)胞膜表面，促進(jìn)葡萄糖從胞外向胞內(nèi)轉(zhuǎn)運，從而降低胞外的葡萄糖水平[15-16]。然而，在胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下，IR對胰島素產(chǎn)生耐受，該通路表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致葡萄糖轉(zhuǎn)運下降，血糖水平繼而升高。為分析COS和殼三糖緩解HepG2細(xì)胞胰島素抵抗的作用機制，首先對IR、IRS-1和GLUT4等基因轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行評估。結(jié)果顯示，COS(200 μg/mL)和殼三糖(100 μg/mL)孵育后可以顯著提高其轉(zhuǎn)錄水平(P<0.05)，其改善效果與陽性對照組基本保持一致的趨勢(圖5-a～圖5-c)。Foxo1是胰島素通路下游的重要轉(zhuǎn)錄因子，受Akt磷酸化的調(diào)節(jié)，過度活化Foxo1可以導(dǎo)致胰島素敏感性降低[17-19]。另外，PGC-1α與胰島素抵抗形成密切相關(guān)，其可加速肝臟糖異生進(jìn)程，誘發(fā)肝內(nèi)胰島素抵抗[19]。因此，為進(jìn)一步評估COS及其殼三糖對IR/Akt/GLUT4通路下游基因的影響情況，分別探究了Foxo1和PGC-1α基因轉(zhuǎn)錄水平的變化情況。如圖5-d，圖5-e所示，COS和殼三糖可以顯著降低Foxo1和PGC-1α基因的轉(zhuǎn)錄水平(P<0.05)，COS和殼三糖也逆轉(zhuǎn)了胰島素抵抗模型中的IL-6基因轉(zhuǎn)錄水平(P<0.05)(圖5-f)。

a-IR；b-IRS-1；c-GLUT4；d-FOXO1；e-PGC-1α；f-IL-6圖5 HepG2細(xì)胞胰島素抵抗相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平變化Fig.5 Amelioration of insulin resistance related mRNA levels in HepG2 cells

2.6 HepG2細(xì)胞胰島素抵抗Akt/GLUT4蛋白水平變化

如圖6所示，模型組細(xì)胞中IR、IRS-1、GLUT4及p-Akt水平顯著低于對照組(P<0.05)，COS(200 μg/mL)和殼三糖(100 μg/mL)處理后可以顯著上調(diào)IR、IRS-1、GLUT4和Akt的蛋白水平(P<0.05)。

a-凝膠電泳條帶；b-IR；c-IRS-1；d-GLUT4；e-P-AKT圖6 HepG2細(xì)胞胰島素抵抗Akt/GLUT4蛋白水平變化Fig.6 The protein levels of Akt/GLUT4 in insulin resistance of HepG2 cells

報道顯示，COS對多種細(xì)胞系均可以顯著調(diào)控其Akt的磷酸化水平，尤其在2型糖尿病疾病中，能夠通過激活A(yù)kt蛋白促進(jìn)胰島素分泌、提高胰島素敏感性和胰高血糖素樣肽1水平，改善機體血糖水平，降低膽固醇及血清甘油三酯水平等，被認(rèn)為是一種理想的糖尿病食品[20-21]，與本文結(jié)果基本一致。綜上，COS和殼三糖通過上調(diào)Akt/GLUT4通路改善HepG2細(xì)胞的胰島素抵抗情況，作用機制如圖7所示。

圖7 COS改善胰島素抵抗的作用機制Fig.7 Mechanism of COS ameliorating insulin resistance

3 結(jié)論

COS具有廣泛的生物活性，其中，降糖作用一直是研究熱點，但由于COS組成及聚合度的復(fù)雜性，以及評價所用細(xì)胞類型和造模方式等差異，其降糖作用機制尚未完全闡明。研究結(jié)果表明，COS作用于胰島素抵抗的HepG2細(xì)胞可顯著促進(jìn)葡萄糖代謝作用，其中殼三糖的作用顯著高于殼二糖和殼四糖。COS和殼三糖通過上調(diào)Akt/GLUT4通路從而改善胰島素抵抗。