程 碩，譚 琰，丁成成，陳偉航，彭甜甜，張亞麗，王雅蕾，張華偉，李海燕，張佳妮，劉肇恒，王 旭，華 茜#(.北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，北京 0009； .北京中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京0009； .北京中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，北京 0009)

黃連阿膠湯出自《傷寒論》，為安神劑-交通心腎劑，具有心腎交合、水升火將、滋陰泄火的功效，可用于抑郁癥的治療。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)通過建立靶點(diǎn)、疾病、藥物成分之間的相互作用關(guān)系圖，從整體性和系統(tǒng)性2個(gè)方面認(rèn)識(shí)疾病的本質(zhì)，這與中藥的整體觀、辨證論治原則相一致。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)理論，對(duì)黃連阿膠湯治療抑郁癥的作用機(jī)制進(jìn)行探討，然后基于PC12細(xì)胞進(jìn)行驗(yàn)證。

1 資料與方法

1.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)

1.1.1 黃連阿膠湯有效成分及靶點(diǎn)獲?。狐S連阿膠湯的主要成分為黃連、黃芩、芍藥、阿膠和雞子黃。利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)(TCMSP)、中藥綜合數(shù)據(jù)庫、中藥與化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫對(duì)5種藥物進(jìn)行有效成分及靶點(diǎn)的檢索，將口服生物利用度(OB)≥30%和類藥性(DL)≥0.18作為篩選條件對(duì)其進(jìn)行篩選，基于Uniprot數(shù)據(jù)庫獲取靶點(diǎn)官方基因名。

1.1.2 抑郁癥相關(guān)靶點(diǎn)的獲取：以“Depression”為關(guān)鍵詞輸入至人類孟德爾遺傳綜合數(shù)據(jù)庫、DrugBank、GeneCards、治療靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫及Pharmgkb等數(shù)據(jù)庫中獲取相關(guān)靶點(diǎn)，GeneCards數(shù)據(jù)庫獲得的靶點(diǎn)以相關(guān)性評(píng)分≥10分作為篩選條件[1]。將黃連阿膠湯的靶點(diǎn)與抑郁癥的靶點(diǎn)輸入Venn平臺(tái)中，獲取交集靶點(diǎn)。

1.1.3 “藥物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建：將黃連阿膠湯中的有效成分、作用靶點(diǎn)輸入Cytoscape 3.7.2軟件中，基于Network Analyzer功能，構(gòu)建藥物成分與靶點(diǎn)之間的網(wǎng)絡(luò)圖。

1.1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建及核心靶點(diǎn)的篩選：將交集靶點(diǎn)輸入平臺(tái)STRING中，物種設(shè)定為“Homo sapiens”，最低互動(dòng)得分設(shè)置為0.4，得到PPI圖。利用軟件Cytoscape 3.7.2對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，以Average Shortest Path Length、Betweenness Centrality、Closeness Centrality和Degree中位數(shù)作為篩選條件篩選核心靶點(diǎn)[2]。通過GEO數(shù)據(jù)庫中GSE12654與GSE76826芯片分析核心靶點(diǎn)在抑郁癥患者體內(nèi)的表達(dá)情況。

1.1.5 京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析與京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析：將交集靶點(diǎn)輸入到DAVID平臺(tái)中，物種設(shè)置為“Human”，進(jìn)行GO及KEGG富集分析。

1.1.6 分子對(duì)接：基于軟件AutoDockTools 1.5.6，對(duì)前10個(gè)有效成分和前10個(gè)核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接?；赑yMol軟件獲取對(duì)接模型圖。

1.2 體外實(shí)驗(yàn)

1.2.1 儀器：QuantStudioTM3型熒光定量PCR儀(美國Agilent公司)；SeriesⅡ WJ型細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Thermofisher公司)；Allegra V-15R型離心機(jī)(美國Beckman Coulter公司)。

1.2.2 藥品與試劑：黃連阿膠湯藥材購自北京同仁堂有限公司，其中黃連12 g(批號(hào)：20220905)，黃芩6 g(批號(hào)：22060401)，芍藥6 g(批號(hào)：22012402)，阿膠9 g(批號(hào)：22031402)，雞子黃2枚。將藥物用水浸泡30 min，然后煎煮1 h進(jìn)行過濾，藥渣加水繼續(xù)煎煮30 min，進(jìn)行過濾，然后合并濾液進(jìn)行濃縮，加入雞子黃，將藥液濃縮至2 g/mL。多皮質(zhì)酮(CORT，HPLC≥98%)、槲皮素(HPLC≥98%)、黃芩素(HPLC≥98%)購自上海源葉生物科技有限公司。RPMI-1640培養(yǎng)基(#R8758)購自美國Sigma公司。CCK8試劑盒(#HY-K0301)購自美國MedChemExpress公司。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)：將PC12細(xì)胞置于37 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)基為RPMI-1640培養(yǎng)基，其中添加10%熱滅活的胎牛血清、5%馬血清和1%的青霉素/鏈霉素。

1.2.4 分組與給藥：將細(xì)胞分為空白組、模型組、槲皮素組以及黃芩素組。模型組、槲皮素組以及黃芩素組加入終濃度為200 μmol/L的CORT培養(yǎng)基溶液，空白組加入等體積細(xì)胞培養(yǎng)基。各組培養(yǎng)3 h后，槲皮素組和黃芩素組分別加入60 μmol/L的槲皮素和80 μmol/L的黃芩素，繼續(xù)培養(yǎng)12 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 細(xì)胞活性測量：CCK8試劑盒用于測試細(xì)胞的活性。將細(xì)胞以5×104個(gè)/孔的密度種植于96孔板中，培養(yǎng)24 h，然后每孔添加CCK8溶液10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)1 h，測定其活性。

1.2.6 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)：將細(xì)胞用磷酸鹽緩沖液(PBS)進(jìn)行清洗，加入裂解液，離心后獲得RNA沉淀，測定RNA的濃度與完整性，然后將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以便進(jìn)行擴(kuò)增。實(shí)驗(yàn)中內(nèi)參為甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)。

2 結(jié)果

2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)

2.1.1 黃連阿膠湯有效成分的篩選：通過檢索及篩選，共得到有效成分73種，其中黃連12種，黃芩36種，白芍8種，雞子黃5種，阿膠16種，其中谷甾醇(sitosterol)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)為白芍與黃芩的共有成分，表小檗堿(epiberberine)、黃連堿(coptisine)為黃連與黃芩的共有成分。共得到靶點(diǎn)577個(gè)。

2.1.2 疾病靶點(diǎn)的篩選：對(duì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行篩選獲得抑郁癥靶點(diǎn)3 157個(gè)，黃連阿膠湯與抑郁癥的交集靶點(diǎn)283個(gè)，見圖1(A)。

A.藥物-疾病靶點(diǎn)交集；B.成分-疾病靶點(diǎn)圖；C.PPI圖；D.核心靶蛋白相互作用圖；E.核心靶點(diǎn)臨床表達(dá)差異A. drug-disease target intersection; B. component-disease target; C. PIP; D. interaction of core target protein; E. different clinical expression of core targets圖1 黃連阿膠湯治療抑郁癥的核心靶點(diǎn)篩選Fig 1 Screening of core targets of Huanglian Ejiao decoction in the treatment of depression

2.1.3 “藥物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建：“藥物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖共有361個(gè)節(jié)點(diǎn)，1 077條邊，形狀越大表示連接度越高；槲皮素及黃芩素連接的靶點(diǎn)最多，見圖1(B)。

2.1.4 PPI網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建及核心靶點(diǎn)的篩選：PPI網(wǎng)絡(luò)共有280個(gè)節(jié)點(diǎn)，6 181條邊，見圖1(C)。對(duì)PPI圖進(jìn)行4次篩選得到核心靶點(diǎn)5個(gè)，見圖1(D)，分別為白細(xì)胞介素(IL)1β、IL-6、腫瘤壞死因子(TNF)、血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)，主要涉及炎癥因子、功能生長因子等。通過GEO數(shù)據(jù)庫對(duì)核心靶點(diǎn)的表達(dá)進(jìn)行分析，見圖1(E)，核心靶點(diǎn)的表達(dá)均具有顯著性差異。

2.1.5 GO和KEGG富集分析：GO功能富集分析主要涉及缺氧反應(yīng)、突觸后膜和質(zhì)膜等。KEGG通路富集分析主要涉及缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)1、TNF和環(huán)磷酸腺苷(cAMP)信號(hào)通路等，見圖2(A—B)。通路之間并非相互獨(dú)立，不同通路之間擁有共同靶點(diǎn)，見圖2(C)。圖2(D)為HIF-1信號(hào)通路示意圖，涉及上游信號(hào)IL-6、表皮生長因子(EGF)以及下游信號(hào)VEGFA、一氧化氮合酶(NOS3)等。

A.GO富集分析柱狀圖；B.KEGG富集分析氣泡圖；C.靶點(diǎn)-通路圖；D.HIF-1信號(hào)通路A. histogram of GO enrichment analysis; B. bubble plot of KEGG enrichment analysis; C. target-pathway network diagram; D. HIF-1 signal pathway圖2 黃連阿膠湯治療抑郁癥的核心靶點(diǎn)分析Fig 2 Analysis on core targets of Huanglian Ejiao decoction in the treatment of depression

2.1.6 分子對(duì)接結(jié)果：共得到100組配體-受體結(jié)果，見圖3(A)。所有的結(jié)合能均<-5 kJ/mol，66組結(jié)合能<-21 kJ/mol，占66%。此對(duì)接結(jié)果可以為今后藥物的篩選提供支撐。

A.分子對(duì)接結(jié)合能熱圖(單位：kJ/mol)；B.分子對(duì)接示意圖(a.N-反式-阿魏酰基酪胺與VEGFA；b.β-谷甾醇與INS；c.豆甾醇與SRC)A. binding energy heatmap for molecular docking (Unit: kJ/mol); B. schematic diagram of molecular docking(a. moupinamide and TNF; b. beta-sitosterol and INS; c. stigmasterol and SRC)圖3 小分子配體與大分子受體的分子對(duì)接Fig 3 Docking of small molecule ligands to macromolecular receptors

2.2 體外實(shí)驗(yàn)

2.2.1 皮質(zhì)酮、黃連阿膠湯對(duì)細(xì)胞活性的影響：本研究設(shè)置4種不同濃度的皮質(zhì)酮對(duì)細(xì)胞進(jìn)行刺激，如圖4(A)所示，隨著皮質(zhì)酮濃度的升高，細(xì)胞活性逐漸降低，當(dāng)皮質(zhì)酮濃度為200 μmol/L時(shí)，細(xì)胞活性為63%，因此本研究選擇該濃度進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。由圖4(B—C)可知，當(dāng)槲皮素及黃芩素的濃度分別低于60 μmol/L和80 μmol/L時(shí)對(duì)細(xì)胞活性無影響，本研究選擇該濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

A.CORT；B.槲皮素；C.黃芩素；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001A. CORT; B. quercetin; C. baicalein; *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001圖4 不同單體對(duì)細(xì)胞活性的影響Fig 4 Effects of monomers on cell viability

2.2.2 黃連阿膠湯對(duì)PC12細(xì)胞活性及核心靶點(diǎn)表達(dá)的影響：與CORT組相比，槲皮素組和黃芩素組細(xì)胞活性均有所改善，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明槲皮素及黃芩素能夠有效改善皮質(zhì)酮對(duì)PC12細(xì)胞的損傷，見圖5(A)。與對(duì)照組相比，CORT組可使炎癥因子IL-1β mRNA、IL-6 mRNA和細(xì)胞因子STAT3 mRNA表達(dá)水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而槲皮素、黃芩素能夠逆轉(zhuǎn)這種趨勢(shì)，見圖5(B—D)。

A.槲皮素及黃芩素對(duì)細(xì)胞的活性影響；B—D.槲皮素及黃芩素對(duì)IL-1β、IL-6及STAT3表達(dá)的影響A. effects of quercetin and baicalein on activity of model cells; B-D. effects of quercetin and baicalein on expression of IL-1β, IL-6 and STAT3圖5 槲皮素和黃芩素對(duì)細(xì)胞活性及靶點(diǎn)表達(dá)的影響Fig 5 Effects of quercetin and baicalein on cell activity and target expression

3 討論

3.1 黃連阿膠湯治療抑郁癥的理論基礎(chǔ)

抑郁癥屬于中醫(yī)學(xué)“郁癥”“臟燥”和“百合病”等范疇，其病因主要為氣機(jī)郁滯、氣血陰陽失調(diào)等，主要表現(xiàn)為肝腎陰虧、陰虛內(nèi)熱，導(dǎo)致神明失養(yǎng)，產(chǎn)生焦慮及抑郁的精神癥狀。因此，國醫(yī)大師阮士怡認(rèn)為可以通過“滋陰補(bǔ)腎”對(duì)抑郁癥進(jìn)行治療[3-4]。黃連阿膠湯中，味苦的黃連與黃芩能夠泄心火，使心氣下交于腎，達(dá)到除陽目的[5]；其他3味藥白芍、阿膠和雞子黃能夠滋腎陰，使腎水上濟(jì)于心，達(dá)到補(bǔ)陰的目的；所有藥物合用，心腎交合，水升火將，滋陰瀉火，正與抑郁癥的病因相克，故在臨床中黃連阿膠湯治療抑郁癥取得了良好的效果。

3.2 黃連阿膠湯治療抑郁癥的成分分析

由成分-靶點(diǎn)通路圖可知，槲皮素及黃芩素可能在黃連阿膠湯治療抑郁癥中發(fā)揮重要作用。槲皮素作為黃連的主要成分之一，具有抗氧化、抗炎和神經(jīng)保護(hù)等作用。有研究結(jié)果表明，槲皮素可以改善模型小鼠的抑郁樣行為，提高海馬區(qū)腦因子1、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)等表達(dá)水平，增強(qiáng)神經(jīng)細(xì)胞的可塑性[6]。Mehta等[7]研究了槲皮素對(duì)抑郁模型小鼠大腦內(nèi)氧化應(yīng)激及神經(jīng)炎癥的影響，結(jié)果表明，槲皮素可以顯著降低海馬區(qū)氧化應(yīng)激及神經(jīng)炎癥，減輕抑郁癥狀。

黃芩素具有抗氧化應(yīng)激、抗炎和促進(jìn)神經(jīng)保護(hù)因子表達(dá)等多種藥理作用，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)疾病具有良好的預(yù)防及治療作用[8-9]。Xiong等[10]研究了黃芩素對(duì)抑郁癥動(dòng)物的治療作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過注射黃芩素，可以顯著降低小鼠強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)與懸尾試驗(yàn)的不動(dòng)時(shí)間，逆轉(zhuǎn)海馬細(xì)胞外BDNF表達(dá)水平的降低，加強(qiáng)神經(jīng)可塑性。

3.3 黃連阿膠湯治療抑郁癥的靶點(diǎn)分析

由PPI圖可知，黃連阿膠湯治療抑郁癥的核心靶點(diǎn)主要包括IL-1β、IL-6、STAT3、蛋白激酶B(Akt)1、TNF和VEGFA。其中IL-1β、IL-6和TNF屬于炎癥因子，有研究結(jié)果表明，在抑郁癥中，炎癥反應(yīng)會(huì)激活HPA軸，HPA軸的刺激會(huì)導(dǎo)致促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α的釋放[11]。K?hler等[12]對(duì)抑郁癥患者及健康患者的細(xì)胞因子及趨化因子進(jìn)行統(tǒng)計(jì)回顧及Meta分析，結(jié)果表明，與健康者相比，抑郁癥患者體內(nèi)IL-1β、IL-6和TNF-α水平顯著增加，說明炎癥因子與抑郁癥密切相關(guān)。

Akt1作為磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)通路下游的產(chǎn)物，與抑郁癥密切相關(guān)[13]。Akt1以性別特異性的方式影響焦慮樣行為，Akt1KO雄性小鼠增加了焦慮樣行為[14]。PIK3CA-Akt1信號(hào)通路的激活在抑郁的嗅球切除大鼠模型中發(fā)揮抗抑郁樣作用[15]。有研究結(jié)果表明，Akt可以調(diào)節(jié)抗抑郁藥的功能，并有助于突觸可塑性和神經(jīng)傳遞的形成[9]。

STAT3在5-羥色胺能神經(jīng)元系統(tǒng)中起著至關(guān)重要的作用，是控制情緒反應(yīng)的分子介質(zhì)[16]。STAT3的激活可以反映與神經(jīng)功能相關(guān)的上游調(diào)節(jié)因子的作用，包括生長因子、激素和內(nèi)源性大麻素等[17]。Kwon等[18]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小膠質(zhì)細(xì)胞中STAT3的功能障礙增強(qiáng)了巨噬細(xì)胞集落刺激因子對(duì)神經(jīng)功能的作用，并通過抗抑郁途徑上調(diào)BDNF表達(dá)，從而減輕了與抑郁相關(guān)的行為。

VEGFA是一種多功能生長因子[19]。有研究結(jié)果表明，VEGFA在神經(jīng)保護(hù)和神經(jīng)發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用，并且可能參與某些神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機(jī)制[20]。Cui等[21]研究了抑郁模型大鼠海馬組織和血清中VEGFA的表達(dá)變化，結(jié)果表明，其海馬區(qū)及外周血的VEGFA mRNA和蛋白的表達(dá)均降低，揭示VEGFA的下調(diào)參與大鼠抑郁癥的病理過程。

3.4 黃連阿膠湯治療抑郁癥的通路分析

由KEGG通路富集分析可知，黃連阿膠湯通過多條通路對(duì)抑郁癥進(jìn)行治療，主要涉及HIF-1、TNF和cAMP信號(hào)通路。

HIF-1信號(hào)通路是維持氧平衡的重要通路，與其他通路交叉，形成細(xì)胞低氧應(yīng)答的特異性和多樣性。Li等[22]研究了FG-4592對(duì)抑郁的治療作用，結(jié)果表明，F(xiàn)G-4592可以通過HIF-1介導(dǎo)的神經(jīng)發(fā)生與突觸可塑性改善大鼠的抑郁樣行為。TNF是炎癥的重要通路，其中TNF-α可以破壞血腦屏障，使得小鼠出現(xiàn)抑郁樣行為[23-24]。Xu等[25-26]從小膠質(zhì)細(xì)胞的激活與神經(jīng)炎癥2個(gè)方面研究了牛蒡子苷元(Arctigenin)對(duì)抑郁的治療作用，結(jié)果表明，慢性不可預(yù)測輕度應(yīng)激通過激活小膠質(zhì)細(xì)胞TNF-α/TNF受體1(TNFR1)信號(hào)通路、增加核因子κB的磷酸化和核轉(zhuǎn)位以及誘導(dǎo)炎癥使得小鼠出現(xiàn)抑郁樣行為，而Arctigenin可以有效逆轉(zhuǎn)這種趨勢(shì)并減少炎癥引起的抑郁樣行為。cAMP是研究最早、最為深入的抗抑郁信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。Fujita等[27]研究了抑郁癥患者使用5-羥色胺再攝取抑制劑前后大腦中cAMP信號(hào)傳導(dǎo)的變化，結(jié)果表明，未服藥的患者表現(xiàn)出cAMP級(jí)聯(lián)反應(yīng)活性顯著降低，2個(gè)月的5-羥色胺再攝取抑制劑治療顯著增加了cAMP活性。

通過以上分析，本研究推測黃連阿膠湯可能通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激、炎癥因子和神經(jīng)營養(yǎng)因子對(duì)抑郁癥產(chǎn)生治療作用，見圖6。

圖6 黃連阿膠湯治療抑郁癥的機(jī)制圖Fig 6 Mechanism diagram of Huanglian Ejiao decoction in treating depression

綜上所述，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，黃連阿膠湯通過多成分、多靶點(diǎn)和多途徑的協(xié)同作用來緩解抑郁癥。本研究推測黃連阿膠湯可能通過HIF-1通路、TNF通路和cAMP通路，IL-1β、IL-6、TNF、Akt1和STAT3靶點(diǎn)調(diào)節(jié)氧平衡、炎癥因子和神經(jīng)營養(yǎng)因子，從而對(duì)抑郁癥發(fā)揮治療作用。本研究揭示了黃連阿膠湯治療抑郁癥的作用機(jī)制，為中醫(yī)藥的進(jìn)一步應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。