李晗，宋玲，高云航，陳騰飛，侯紅平，彭博，張廣平，葉祖光

中國中醫(yī)科學院中藥研究所，北京 100700

蒙醫(yī)藥是蒙古族人民與疾病抗爭過程中積累的特色醫(yī)學理論與用藥方法，是我國四大民族醫(yī)藥之一。草烏為毛茛科植物北烏頭的干燥塊根[1]，作為蒙藥傳統(tǒng)藥材之一，具有殺“黏”、燥“協(xié)日烏素”及止痛功效[2]。草烏代表成分為雙酯型生物堿，主要包括烏頭堿、次烏頭堿與新烏頭堿等，這些成分既是毒性成分也是藥理成分。由于草烏具有毒效并存的特點，蒙醫(yī)藥常用訶子湯炮制法、訶子及甘草與草烏配伍等方式減毒[3-4]。訶子，蒙語“阿如拉”，為使君子科植物訶子或絨毛訶子的干燥成熟果實，具有調理體素、解毒之效，被譽為“蒙藥之王”[5]。訶子含有大量鞣質，其中具有抗炎、抗氧化、護肝作用的鞣花酸為代表成分之一[6]。甘草為豆科植物甘草、脹果甘草、光果甘草的干燥根和根莖，在中藥和蒙藥中均有解毒功效[7]。甘草苷作為甘草黃酮類代表成分之一，具有護肝、抗腫瘤等藥理作用[8]。課題組前期通過動物實驗研究草烏配伍訶子、甘草對細胞色素P450（CYP450）酶的調控作用，發(fā)現(xiàn)草烏可下調CYP1A2和CYP3A4表達，而訶子、甘草與草烏配伍后可上調其表達，減少烏頭類生物堿在體內的蓄積時間，起到減毒作用[9]。本研究觀察各藥物代表性成分烏頭堿、鞣花酸與甘草苷配伍對CYP450的調控作用，明確其減毒作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞

人肝癌HepG2細胞株，購于中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所。

1.2 藥物與試劑

烏頭堿（批號110720-200410），中國藥品生物制品檢定所；鞣花酸（批號L941795）、甘草苷（批號L468830）、CYP3A4誘導劑利福平（批號L588536）、CYP2C9誘導劑卡馬西平（批號L72556），北京百靈威科技有限公司；CYP1A2誘導劑2,3,7,8-四氯二苯并二噁英（TCDD，批號ED-901-A），美國Cerillant公司；胎牛血清（批號10099-141），美國Gibco公司；CCK8細胞增殖試劑盒（批號CK04-202107），日本Dojindo公司；Hoechst33342（批號C1022-20210331）、乳酸脫氫酶（LDH）細胞毒性試劑盒（批號20210614），上海碧云天科技有限公司；MitoTrackerTMRed CMXRos（批號2256813）、CellROX?Green Reagents染料（批號2201587），美國Invitrogen公司；反轉錄試劑盒、（批號P20329）、RT-PCR試劑盒（批號M51219），北京全式金生物技術股份有限公司；BCA蛋白定量試劑盒（批號VJ312549），美國Thermo Scientific公司；Western blot配膠試劑盒（批號CW0022M），北京康為世紀公司；CYP1A2（貨號19936-1-AP）、CYP2C9（貨號16546-1-AP）、CYP3A4（貨號18227-1-AP）一抗，美國Proteintech公司； HRP標記山羊抗兔IgG（貨號ab205718），英國Abcam公司。

1.3 儀器

HERA cell 150i細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo公司），Microfuge 22R型臺式高速離心機（美國Beckman公司），CKX53型倒置顯微鏡（日本Olympus公司），MK100-4A微孔板恒溫孵育器（上海珂淮儀器有限公司），Cytation 5細胞成像多功能檢測系統(tǒng)（美國Bio-Tek公司），NanoDrop One核酸濃度測定儀（美國Thermo公司），SpectraMax i3x型多標記酶標儀（美國Molecular Devices公司），CFX96 Touch Real-Ti型RTPCR儀（美國Bio-Rad公司），SCILOGEX 180-E搖床（杭州奧盛儀器有限公司），Amersham Imager 680凝膠成像儀（美國GE公司）。

1.4 細胞培養(yǎng)

HepG2細胞用含10%胎牛血清、1%非必需氨基酸和1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細胞融合至70%～80%時，以1∶3比例傳代，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.5 CCK8法測定細胞活力

HepG2細胞以2×105個/孔接種于96孔板，常規(guī)培養(yǎng)，待細胞融合至80%時，換為空白DMEM培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)12 h，將細胞分為烏頭堿組、鞣花酸組、甘草苷組、烏頭堿+鞣花酸組、烏頭堿+甘草苷組、烏頭堿+鞣花酸+甘草苷組，各藥物終濃度分別為10、20、50、100 μmol/L，另設空白組（只接種細胞、不加藥）和調零組（不接種細胞、加入空白培養(yǎng)基），分別培養(yǎng)24、48 h后，加入CCK8 10 μL繼續(xù)孵育30～60 min，測定光密度（OD值），計算細胞存活率。細胞存活率（%）=（OD實驗組-OD調零組）÷（OD空白組-OD調零組）×100%。

1.6 LDH法檢測細胞毒性

將細胞按“1.5”項下方法處理，另設空白組和最大酶活性組（均接種細胞、不加藥），繼續(xù)培養(yǎng)24、48 h，于24、48 h前1 h取出培養(yǎng)板，向最大酶活性組加入原液總體積10%的LDH釋放試劑，繼續(xù)孵育至24、48 h，吸取上清液，向上清液中加入檢測工作液60 μL，室溫避光振搖30 min，測定OD值，計算細胞死亡率。細胞死亡率（%）=（OD實驗組-OD空白組）÷（OD最大酶活性組-OD空白組）×100%。

1.7 高內涵分析

HepG2細胞以2×105個/孔接種于黑色板壁透明板底96孔板，常規(guī)培養(yǎng)，待細胞融合至80%時，分別加入20 μmol/L烏頭堿（烏頭堿組）和20 μmol/L烏頭堿+鞣花酸+甘草苷（配伍組），另設空白組（只接種細胞、不加藥），培養(yǎng)48 h后棄去原培養(yǎng)基，PBS洗細胞2次。將Hoechst33342、CellROX?Green Reagents、Mito TrackerTMRed CMXRos染料加入各孔內（100 μL/孔），37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育45 min，棄染料混合液，PBS清洗，每孔加PBS 100 μL，上機檢測，第一通道波長350、461 nm，第二通道波長485、520 nm，第三通道波長579、599 nm。采用Gen5軟件進行分析，細胞數(shù)目為第一通道熒光數(shù)目，細胞核內DNA含量為第一通道熒光強度，活性氧（ROS）含量為第二通道細胞質與細胞核的熒光強度，線粒體膜電位（MMP）為第三通道細胞質熒光強度。

1.8 RT-PCR檢測

HepG2細胞以1.2×106個/孔接種于6孔板，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細胞融合至80%時，換為空白DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h，將細胞分為誘導劑組（5 nmol/L TCDD+10 μmol/L卡馬西平+10 μmol/L利福平）、烏頭堿組（20 μmol/L）、鞣花酸組（20 μmol/L）、甘草苷組（20 μmol/L）和配伍組（烏頭堿+鞣花酸+甘草苷，均為20 μmol/L），分別處理細胞48 h。提取總RNA，測定RNA濃度和純度，將RNA反轉錄為cDNA，采用SYBER Green法進行RT-PCR。反應條件：94 ℃預變性30 s，94 ℃、5 s，60 ℃、30 s，72 ℃、10 s，共40個循環(huán)。2-ΔΔCt法計算mRNA相對表達量。引物序列見表1。

表1 各基因PCR引物序列

1.9 Western blot檢測

將細胞按“1.8”項下方法處理，收集細胞，加入預冷RIPA裂解液100 μL，冰上裂解30 min，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，BCA法進行蛋白定量，100 ℃變性5 min，50 μg蛋白經8%SDS-PAGE，將蛋白轉移至PVDF膜，室溫脫脂牛奶封閉1 h，分別加入CYP1A2、CYP2C9、CYP3A4一抗（均為1∶1 000）和GAPDH一抗（1∶2 000），4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，滴加二抗（1∶2 000），室溫孵育1 h，ECL發(fā)光顯影，采用Image J軟件計算蛋白灰度值，以目的蛋白與GAPDH灰度值比值表示目的蛋白相對表達量。

1.10 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 烏頭堿配伍鞣花酸、甘草苷對HepG2細胞活性的影響

培養(yǎng)24、48 h時，隨著藥物濃度增加，烏頭堿、鞣花酸、甘草苷組細胞存活率較空白組均有下降趨勢，其中100 μmol/L烏頭堿組差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01，P<0.001）；鞣花酸、甘草苷與烏頭堿配伍給藥后，在濃度為100 μmol/L時細胞存活率顯著降低（P<0.001），見表2。因此，選擇各藥物濃度為20 μmol/L進行后續(xù)實驗。

表2 各組HepG2細胞存活率比較（±s，%）

表2 各組HepG2細胞存活率比較（±s，%）

注：空白組細胞存活率以100%計；與空白組比較，**P<0.01，***P<0.001

時間24 h 48 h組別烏頭堿組鞣花酸組甘草苷組烏頭堿+鞣花酸組烏頭堿+甘草苷組烏頭堿+鞣花酸+甘草苷組烏頭堿組鞣花酸組甘草苷組烏頭堿+鞣花酸組烏頭堿+甘草苷組烏頭堿+鞣花酸+甘草苷組n 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 10 μmol/L 103.20±8.61 105.42±3.36 105.27±3.63 104.25±7.37 100.24±5.30 103.24±2.48 105.00±5.43 99.20±2.52 105.01±4.79 106.64±2.04 106.25±6.54 105.78±2.87 20 μmol/L 103.40±8.81 109.21±3.69 103.42±4.24 105.90±6.47 98.88±6.47 102.27±2.36 105.70±3.39 104.80±2.82 98.74±4.51 97.09±6.97 104.34±6.77 104.36±2.71 50 μmol/L 100.90±6.67 108.14±4.25 99.38±2.14 99.24±5.34 95.65±4.02 94.68±3.92 94.77±4.23 104.09±2.97 98.31±3.68 97.43±5.81 97.55±7.73 93.83±5.58 100 μmol/L 93.40±2.12**105.24±4.08 96.40±7.86 96.00±8.27 92.51±2.52 87.35±4.48***87.36±3.11***99.69±3.53 95.39±3.32 95.25±2.96 90.23±4.25 84.52±5.77***

2.2 烏頭堿配伍鞣花酸、甘草苷對HepG2細胞毒性的影響

培養(yǎng)24、48 h時，與空白組比較，隨著藥物濃度增加，烏頭堿、鞣花酸與甘草苷組細胞死亡率呈上升趨勢，其中100 μmol/L烏頭堿組、100 μmol/L烏頭堿+甘草苷組、100 μmol/L烏頭堿+鞣花酸+甘草苷組細胞死亡率顯著升高（P<0.05，P<0.01，P<0.001）；100 μmol/L烏頭堿+鞣花酸組48 h細胞死亡率顯著升高（P<0.01）。結果見表3。

表3 各組HepG2細胞死亡率比較（±s，%）

表3 各組HepG2細胞死亡率比較（±s，%）

注：空白組細胞死亡率以0%計；與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

時間24 h 48 h組別烏頭堿組鞣花酸組甘草苷組烏頭堿+鞣花酸組烏頭堿+甘草苷組烏頭堿+鞣花酸+甘草苷組烏頭堿組鞣花酸組甘草苷組烏頭堿+鞣花酸組烏頭堿+甘草苷組烏頭堿+鞣花酸+甘草苷組n 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 10 μmol/L 0.779±0.426-3.076±2.192-1.316±0.491-2.880±0.351-2.559±1.533-3.178±0.345-0.991±0.178-1.794±1.595-2.638±1.182-2.828±1.464-2.874±1.656-3.307±1.048 20 μmol/L-0.923±0.339 0.539±0.771-1.302±0.492-2.002±1.249-2.224±1.801-1.541±1.685-2.732±1.218-2.004±1.349-2.554±1.498-2.914±0.501-2.534±1.884-2.448±2.048 50 μmol/L 0.338±0.590 0.927±0.462 0.138±0.930 0.922±3.436 0.749±3.108-1.244±4.413-1.878±1.093 1.692±1.190 0.315±0.642 0.817±4.155 2.543±3.201 0.865±3.851 100 μmol/L 4.314±2.105***2.044±2.694 1.367±3.318 3.283±1.776 4.733±2.871*8.517±2.406**5.256±2.166***3.058±1.512 2.094±1.962 7.905±2.070**6.784±0.948**8.386±3.140**

2.3 烏頭堿配伍鞣花酸、甘草苷對HepG2細胞數(shù)目、DNA含量、活性氧含量和線粒體膜電位的影響

與空白組比較，烏頭堿組細胞ROS含量顯著增加，MMP顯著降低（P<0.05），細胞數(shù)目和DNA含量差異無統(tǒng)計學意義，配伍組細胞數(shù)目、DNA和ROS含量、MMP差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05），見圖1、表4。

表4 各組HepG2細胞高內涵分析比較（±s）

表4 各組HepG2細胞高內涵分析比較（±s）

注：與空白組比較，*P<0.05

組別空白組烏頭堿組配伍組n 9 9 9細胞數(shù)目19 033±1 120.0 17 054±2 119.5 17 460±1 848.0 DNA含量4 213.0±74.2 3 771.0±87.5 3 836.0±91.4 ROS含量9 923.0± 69.7 10 341.6±179.8*10 125.0±104.9 MMP 3 687.0± 78.8 3 435.0±247.2*3 622.0±340.3

圖1 各組HepG2細胞高內涵分析（×20）

2.4 烏頭堿配伍鞣花酸、甘草苷對HepG2細胞CYP1A2、CYP2C9、CYP3A4 mRNA表達的影響

與空白組比較，誘導劑組細胞CYP1A2、CYP2C9、CYP3A4 mRNA表達顯著升高（P<0.001），烏頭堿組細胞CYP1A2、CYP3A4 mRNA表達顯著降低（P<0.05），鞣花酸組細胞CYP1A2、CYP2C9 mRNA表達降低，CYP3A4 mRNA表達升高，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），甘草苷組細胞CYP1A2、CYP2C9、CYP3A4 mRNA表達顯著升高（P<0.01，P<0.05），配伍組細胞CYP1A2、CYP2C9、CYP3A4 mRNA表達升高，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；與烏頭堿組比較，配伍組細胞CYP1A2、CYP2C9、CYP3A4 mRNA表達顯著升高（P<0.01，P<0.05）。結果見表5。

表5 各組HepG2細胞CYP1A2、CYP2C9、CYP3A4 mRNA表達比較（±s）

表5 各組HepG2細胞CYP1A2、CYP2C9、CYP3A4 mRNA表達比較（±s）

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；與烏頭堿組比較，#P<0.05，##P<0.01

組別空白組誘導劑組烏頭堿組鞣花酸組甘草苷組配伍組n 3 3 3 3 3 3 CYP1A2 1.00±0.25 3.55±0.69***0.67±0.02*0.83±0.32 2.05±0.39**1.60±0.15##CYP2C9 1.00±0.30 2.66±0.48***0.82±0.12 0.89±0.25 1.24±0.14*1.55±0.10##CYP3A4 1.00±0.13 3.32±0.68***0.87±0.15*1.25±0.04 1.64±0.25*1.12±0.14#

2.5 烏頭堿配伍鞣花酸、甘草苷對HepG2細胞CYP1A2、CYP2C9、CYP3A4蛋白表達的影響

與空白組比較，誘導劑組細胞CYP1A2、CYP2C9、CYP3A4蛋白表達顯著升高（P<0.001），烏頭堿組細胞CYP1A2、CYP3A4蛋白表達顯著降低（P<0.05），鞣花酸組細胞CYP1A2、CYP2C9蛋白表達降低，CYP3A4蛋白表達升高，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），甘草苷組細胞CYP1A2、CYP2C9、CYP3A4蛋白表達顯著升高（P<0.01，P<0.05），配伍組細胞CYP1A2、CYP3A4蛋白表達顯著升高（P<0.01，P<0.05）；與烏頭堿組比較，配伍組細胞CYP1A2、CYP3A4蛋白表達顯著升高（P<0.001）。見圖2、表6。

圖2 各組HepG2細胞CYP1A2、CYP2C9、CYP3A4蛋白免疫印跡

表6 各組HepG2細胞CYP1A2、CYP2C9、CYP3A4蛋白表達比較（±s）

表6 各組HepG2細胞CYP1A2、CYP2C9、CYP3A4蛋白表達比較（±s）

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；與烏頭堿組比較，###P<0.001

組別空白組誘導劑組烏頭堿組鞣花酸組甘草苷組配伍組n3 3 3 3 3 3 CYP1A2 1.00±0.00 2.13±0.08***0.81±0.09*0.82±0.22 1.51±0.14**1.49±0.16**###CYP2C9 1.00±0.00 2.23±0.28***0.85±0.15 0.81±0.18 1.41±0.38*1.14±0.05 CYP3A4 1.00±0.00 2.51±0.18***0.72±0.07*1.14±0.11 1.58±0.16**1.38±0.10*###

3 討論

草烏又稱“泵嘎”，蒙醫(yī)理論認為其味辛，性溫、效輕，有大毒，具有治療“赫依”“赫如虎”“陶賴”、脖頸僵直與游痛癥等功效，臨床多用于治療肺心病、腦萎縮、腦血管病、急慢性腸刺痛及丹毒等。藥理研究發(fā)現(xiàn)，草烏具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、強心、擴張血管及鎮(zhèn)痛等作用[10]。根據(jù)《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準·蒙藥分冊》記載，在145個蒙藥中含草烏成分的有20個（13.79%）[11]。查閱相關蒙醫(yī)藥歷史文獻發(fā)現(xiàn)，草烏配伍解毒方法可追溯至公元前200年。臨床除外用生草烏外，蒙醫(yī)多以炮制品入藥，即選擇與訶子配伍或以訶子湯炮制[12]。19世紀《蒙藥正典》指出，含草烏的方劑必須搭配訶子[13]。在中醫(yī)與蒙醫(yī)理論中，甘草均具有調和眾藥與降低毒性作用，因此臨證多將草烏等有毒藥材與訶子、甘草進行配伍使用[14-15]?，F(xiàn)階段關于訶子、甘草解草烏之毒的機制研究頗多，其熱點多集中于藥物配伍比例[16]、配伍后物質基礎變化[17-18]及胃腸道吸收動力改變[19]等，然而相關作用機制尚未明確。本實驗從CYP450角度出發(fā)，選取草烏、訶子、甘草的代表性成分烏頭堿、鞣花酸與甘草苷，通過檢測其對HepG2細胞CYP1A2、CYP2C9、CYP3A4 mRNA和蛋白表達的影響，探討烏頭堿配伍鞣花酸、甘草苷減毒的作用機制。

CYP450是其基因超家族編碼的一群蛋白酶，作為重要的Ⅰ相代謝酶，參與多種內源物與外源物的生物轉化。大部分CYP450酶分布于肝臟，因此肝臟成為藥物代謝最重要的器官[20]。肝臟與藥物代謝密切相關的酶為CYP1、CYP2、CYP3[21]。研究發(fā)現(xiàn)，若一種藥物對CYP450酶活性產生影響，受影響的CYP450酶能使其本身或其他藥物代謝發(fā)生改變，影響藥物之間相互作用，進而參與藥物減毒增效機制的關鍵環(huán)節(jié)[22]。同時，相較于酶誘導產生的不良反應，因酶抑制而引發(fā)的不良反應占比更高[20]。

烏頭類生物堿作為草烏最具代表性的毒效并存成分，在人及嚙齒類動物體內主要通過水解代謝、脫甲基代謝、脫氫代謝和羥化代謝等途徑代謝，此部分代謝主要由CYP1A、CYP2C、CYP3A介導[23-25]。本研究結果顯示，烏頭堿能下調CYP1A2和CYP3A4表達，使有毒的烏頭類生物堿在體內蓄積時間延長，毒性增加。而與鞣花酸、甘草苷配伍后，CYP1A2和CYP3A4表達上調，減少烏頭堿在體內蓄積時間，從而起到減毒作用。因此，我們推測草烏配伍訶子、甘草減毒的機制主要是烏頭堿配伍鞣花酸、甘草苷后，上調CYP450相關mRNA轉錄及蛋白翻譯，使烏頭堿在體內代謝加快，減少蓄積毒性。本研究可為草烏的合理應用提供實驗基礎，并為傳統(tǒng)民族醫(yī)藥現(xiàn)代化研究提供新思路。