林琰杰，于嘉智，魏傳銀

(1淄博市第一醫(yī)院，山東淄博 255200；2濟(jì)南市兒童醫(yī)院)

骨肉瘤常發(fā)生于兒童和青少年，患者預(yù)后較差，病死率高[1]。目前骨肉瘤的治療多采用外科手術(shù)聯(lián)合化療，患者的5年生存率可達(dá)70%，但化療的不良反應(yīng)較多，常影響治療計(jì)劃的完成及治療效果[2]。青藤堿是一種生物堿，為中藥青風(fēng)藤提取物，已被證實(shí)具有抗腫瘤、抗炎、鎮(zhèn)痛、降壓、抗心律失常等藥理作用[3,4]。目前青藤堿對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖的影響及其抑瘤作用的相關(guān)研究鮮見。為此，我們于2017年1月～2018年1月進(jìn)行了如下研究，以期為骨肉瘤的治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 細(xì)胞：人骨肉瘤細(xì)胞株MG-63(以下稱骨肉瘤細(xì)胞)購于上海拜力生物科技有限公司。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)Balb/c裸鼠20只，6周齡，均為雄性，體質(zhì)量(20±3)g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(滬)2012-0005。藥物：青藤堿購自美國Selleck公司。主要試劑：DMEM培養(yǎng)液、FBS、胰蛋白酶均購自美國Gibco公司，MTT細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒購自日本同仁公司，實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒、TRIzol試劑、TaqMan均購自上海吉?jiǎng)P生物科技有限公司，MTT試劑盒以及脂質(zhì)體2000均購自杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司，Krappel 樣因子4(KLF4) 及GAPDH抗體均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，雙氧水以及檸檬酸鈉抗原修復(fù)液均購自杭州昊鑫生物科技股份有限公司，DAB顯色盒購自北京中杉金橋有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 青藤堿對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖能力及KLF4表達(dá)影響的觀察

2.1.1 細(xì)胞分組及青藤堿干預(yù) 將骨肉瘤細(xì)胞培養(yǎng)于含10% FBS、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞融合至80%～90%時(shí)進(jìn)行消化傳代。取傳至3～7代的細(xì)胞，隨機(jī)分為空白組、50 mmol/L青藤堿組、100 mmol/L青藤堿組、200 mmol/L青藤堿組?？瞻捉M不予處理，50 mmol/L青藤堿組、100 mmol/L青藤堿組、200 mmol/L青藤堿組分別予50、100、200 mmol/L青藤堿干預(yù)24 h。

2.1.2 細(xì)胞增殖能力檢測(cè) 采用MTT法。取干預(yù)24 h的各組細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液，將細(xì)胞密度調(diào)整為1×104個(gè)/mL。取100 μL接種于96孔板，37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。各組分別于培養(yǎng)12、24、36、48 h，每孔加入MTT溶液20 μL，檢測(cè)各組450 nm處的光密度(OD)值，以此表示細(xì)胞增殖能力。結(jié)果顯示，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，各組細(xì)胞增殖能力均呈逐漸升高趨勢(shì)。培養(yǎng)12、24 h時(shí)四組細(xì)胞增殖能力比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；培養(yǎng)36、48 h時(shí)對(duì)照組、50 mmol/L青藤堿組、100 mmol/L青藤堿組、200 mmol/L青藤堿組細(xì)胞增殖能力依次降低，組間比較P均<0.05。見表1。

表1 四組細(xì)胞增殖能力比較

2.1.3 細(xì)胞KLF4蛋白相對(duì)表達(dá)量檢測(cè) 采用Western blotting法。取作用24 h的各組細(xì)胞，加入500 μL蛋白裂解液，離心去后上清液，采用BCA法檢測(cè)蛋白濃度。取40 μg總蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)至PVDF膜，室溫下5% BSA脫脂奶粉封閉30 min。加入KLF4、GAPDH一抗(稀釋倍數(shù)均為1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜；加入兔二抗(稀釋倍數(shù)均為1∶5 000)，室溫下孵育2 h，TBST洗膜。加入ECL液進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)并曝光。采用Quantity One軟件分析條帶灰度值，以KLF4與GAPDH條帶灰度值的比值計(jì)算KLF4蛋白相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示，空白組、50 mmol/L青藤堿組、100 mmol/L青藤堿組、200 mmol/L青藤堿組KLF4蛋白相對(duì)表達(dá)量依次降低，分別為0.96±0.15、0.91±0.08、0.55±0.08、0.24±0.09，兩組間比較P均<0.05。

2.2 青藤堿對(duì)裸鼠骨肉瘤模型的抑瘤作用及其對(duì)腫瘤組織KLF4 表達(dá)影響的觀察

2.2.1 裸鼠骨肉瘤模型建立 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液，將細(xì)胞密度調(diào)整為1×107個(gè)/mL。取SPF級(jí)Balb/c裸鼠20只，于其背部皮下注射骨肉瘤細(xì)胞懸液100 μL。注射后無菌條件下飼養(yǎng)。注射后16周，20只裸鼠全部成瘤，成瘤率100%。

2.2.2 青藤堿的抑瘤作用觀察 將20只骨肉瘤模型裸鼠隨機(jī)分為青藤堿組和對(duì)照組各10只，分別腹腔注射青藤堿20 mg/kg和等體積生理鹽水。3周后處死兩組裸鼠，剝離皮下腫瘤稱重并測(cè)量其長(zhǎng)徑、短徑，測(cè)量瘤體質(zhì)量(測(cè)量后腫瘤組織于液氮中凍存)，計(jì)算兩組瘤體體積及青藤堿抑瘤率。瘤體體積=(腫瘤長(zhǎng)徑×腫瘤短徑)/2。青藤堿抑瘤率=(1-青藤堿組平均瘤體質(zhì)量/對(duì)照組平均瘤體質(zhì)量)×100%。 結(jié)果青藤堿組和對(duì)照組瘤體質(zhì)量分別為(0.24±0.03)、(0.64±0.05)g，瘤體體積分別為(0.31±0.05)、(0.98±0.11)cm3；青藤堿組瘤體質(zhì)量、瘤體體積均低于對(duì)照組(P均<0.05)；青藤堿抑瘤率為62.51%。

2.2.3 青藤堿對(duì)腫瘤組織KLF4表達(dá)的影響 ①KLF4 mRNA檢測(cè)：采用real-time PCR法。取青藤堿組和對(duì)照組液氮凍存的腫瘤組織，研磨后采用TRIzol法提取總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。KLF4上游引物：5′-ACAGGCCGGGACAAGTGCAATA-3′，下游引物：5′-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3′；以U6作為內(nèi)參，上游引物：5′-GTGCTCGCTTCGGCAGCACAT-3′，下游引物：5′-AAAAATATGGAACGCTCAC-3′。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min， 95 ℃變性15 s， 60 ℃退火60 s，共40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算KLF4 mRNA相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示，青藤堿組和對(duì)照組腫瘤組織KLF4 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.69±0.09、1.65±0.14，青藤堿組明顯低于對(duì)照組，P<0.05。② KLF4蛋白表達(dá)檢測(cè)：采用Western blotting法。取出青藤堿組和對(duì)照組液氮凍存的腫瘤組織，研磨后加入蛋白裂解液，參照2.1.3的方法及步驟檢測(cè)KLF4蛋白相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示，青藤堿組和對(duì)照組腫瘤組織KLF4蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為1.28±0.14、2.42±0.54；青藤堿組明顯低于對(duì)照組，P<0.05。

3 討論

目前對(duì)青藤堿藥理作用的研究多集中在其鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)咳、局麻、降血壓、抗炎等方面[5]。近年研究表明，青藤堿在多種惡性腫瘤中具有抗腫瘤活性[6]。Zhang等[7]研究表明，青藤堿能抑制乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)，減少乳腺癌轉(zhuǎn)移，改善化療和腫瘤免疫。Lu等[8]研究表明，青藤堿能通過促進(jìn)細(xì)胞周期阻滯和誘導(dǎo)凋亡抑制肝細(xì)胞癌增殖。Li等[9]研究表明，青藤堿可誘導(dǎo)血管正?；?，對(duì)乳腺癌具有抗腫瘤和抗轉(zhuǎn)移作用。Ghaleb等[10]報(bào)道，青藤堿可通過調(diào)控CXCR4-STAT3通路抑制骨肉瘤新生血管形成和骨質(zhì)溶解，從而抑制骨肉瘤細(xì)胞侵襲。本研究體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，青藤堿干預(yù)培養(yǎng)36、48 h時(shí)對(duì)照組、50 mmol/L青藤堿組、100 mmol/L青藤堿組、200 mmol/L青藤堿組細(xì)胞增殖能力依次降低；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，青藤堿組瘤體質(zhì)量、瘤體體積均低于對(duì)照組，青藤堿抑瘤率為62.51%。證實(shí)青藤堿能抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖及骨肉瘤組織生長(zhǎng)。

KLF4是真核鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞增殖分化、血管生成和腫瘤轉(zhuǎn)移進(jìn)展等多種生理、病理過程中具有重要作用[10]。研究表明，KLF4在食管癌、肺癌、胰腺癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌、B淋巴細(xì)胞和膀胱癌等腫瘤組織中的表達(dá)降低，起抑癌基因作用[11,12]；但其在乳腺癌和口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中表達(dá)升高，具有促癌基因作用[13]。KLF4在骨肉瘤組織中表達(dá)的報(bào)道較多。Martins-Neves等[14]報(bào)道，骨肉瘤細(xì)胞中KLF4蛋白過度表達(dá)可能導(dǎo)致骨肉瘤的進(jìn)展。Qi等[15]報(bào)道，KLF4在骨肉瘤中表現(xiàn)為促癌基因作用。Zhang等[16]研究表明，KLF4通過上調(diào)CRYAB表達(dá)而促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞增殖和侵襲，KLF4蛋白是治療骨肉瘤的潛在靶點(diǎn)。林琰杰等[17,18]報(bào)道，抑制miR-133可通過抑制骨肉瘤細(xì)胞中KLF4表達(dá)而降低其增殖能力。本研究體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組、50 mmol/L青藤堿組、100 mmol/L青藤堿組、200 mmol/L青藤堿組KLF4蛋白相對(duì)表達(dá)量依次降低；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，青藤堿組裸鼠腫瘤組織KLF4 mRNA和蛋白表達(dá)均低于對(duì)照組；說明青藤堿能抑制骨肉瘤組織KLF4表達(dá)，此可能是青藤堿抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖和骨肉瘤組織生長(zhǎng)的分子機(jī)制之一。

綜上所述，青藤堿可抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖，其作用呈濃度依賴性；還可抑制骨肉瘤組織生長(zhǎng)。下調(diào)腫瘤細(xì)胞或組織KLF4表達(dá)是其可能的機(jī)制。本研究為骨肉瘤發(fā)病機(jī)制的研究以及中藥治療骨肉瘤提供了新的思路。