木朝宇，張曉梅，范德勝,2，劉培明，姚慧琳

慢性丙型病毒性肝炎(chronic viral hepatitis C，CHC) 是一種由丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)感染引起的病毒性肝炎，可導(dǎo)致肝臟慢性炎癥壞死和纖維化，部分病人可發(fā)展為肝硬化甚至肝細(xì)胞癌，已成為嚴(yán)重的社會(huì)和公共衛(wèi)生的問(wèn)題[1-2]。我國(guó)HCV的感染約有1 000萬(wàn)例[3]。HCV基因易變異，在已報(bào)道的HCV 7個(gè)基因型中，中國(guó)發(fā)現(xiàn)的有1、2、3和6型[4]。HCV基因型及亞型的檢測(cè)是直接抗病毒藥物(direct antiviral agent，DAA) 治療方案的基礎(chǔ)，即不同HCV基因型病人所采用的DAAs治療方案以及療程不相同[3]。因此，HCV基因型及亞型的檢測(cè)在直接抗病毒治療方案中具有重要意義。隨著DAAs藥物的廣泛應(yīng)用，尤其是單藥應(yīng)用時(shí)，部分病人出現(xiàn)耐藥相關(guān)突變(ristance-associated substitutions，RASs)，而且未經(jīng)過(guò)任何抗病毒治療的丙型肝炎病人體內(nèi)也存在DAAs耐藥突變株，即天然耐藥突變[5]。本研究旨在分析安徽省淮北地區(qū)HCV感染者基因亞型的分布情況，同時(shí)檢測(cè)主要流行亞型NS3/4A、NS5A和NS5B的DAAs靶點(diǎn)RASs，以了解該地區(qū)HCV基因亞型的流行特征及主要亞型的天然耐藥情況，為本地區(qū)HCV感染防控和臨床個(gè)體化抗病毒治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019-2022年就診于淮北礦工總醫(yī)院住院的HCV-RNA陽(yáng)性HCV感染者(未經(jīng)任何DAAs治療)血清130例。其中男82例，女48例，年齡25～88歲。以上所有CHC診斷符合我國(guó)《丙型肝炎防治指南(2019版)》[3]。排除合并感染HIV或其他病毒性肝炎、酒精性肝病、自身免疫性疾病等病人。血清標(biāo)本-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 HCV-RNA抽提 采用中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司提供的核酸柱提取試劑盒，操作步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.2.2 RT-PCR 采用Thermo Fisher Scientific公司生產(chǎn)的RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(貨號(hào)：K1622)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.2.3 HCV基因分型、RASs檢測(cè) 采用巢式PCR進(jìn)行HCV基因分型、RASs檢測(cè)。PCR引物見(jiàn)表1，擴(kuò)增條件均參考文獻(xiàn)[4,7-8]，其中NS5B區(qū)PCR條件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min、35個(gè)循環(huán)，72 ℃ 5 min;第二輪與第一輪PCR條件相同；NS3/4A區(qū)PCR條件：第一輪94 ℃ 5 min，94 ℃ 1 min、55 ℃ 60 s、72 ℃ 70 s、35個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min，第二輪94 ℃ 5 min，94 ℃ 1 min、52 ℃ 60 s、72 ℃ 70 s、35個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min；NS5A區(qū)PCR條件：第一輪94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 2 min、35個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min，第二輪94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s、65 ℃ 30 s、72 ℃ 1.5 min、35個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物在2.5%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳后測(cè)序。PCR引物合成及產(chǎn)物測(cè)序均由上海生工生物工程股份有限公司完成。

表1 HCV基因各亞型引物名稱及序列

1.2.4 序列比對(duì)與分析 從GenBank下載HCV 1b型標(biāo)準(zhǔn)序列株(AJ238799.1)，采用Mega.11軟件進(jìn)行NS5B、NS5A及NS3/4A區(qū)的序列比對(duì)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 HCV基因亞型分布特征 130例HCV感染者中有102例樣本NS5B區(qū)擴(kuò)增成功，擴(kuò)增成功率為78.46%，NS5B區(qū)段擴(kuò)增PCR產(chǎn)物片段大小377 bp，電泳結(jié)果見(jiàn)圖1A。PCR產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序分析后，其中1b型70例(68.63%)，2a型30例(29.41%)，3a型2例(1.96%)，其他型別未檢出。1b型為HCV流行的優(yōu)勢(shì)亞型，2a型次之；HCV 1b、2a型男女感染分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見(jiàn)表2)。

2.2 HCV基因亞型分布與年齡的關(guān)系 本研究中HCV感染者按年齡分為<55歲和≥55歲組，HCV基因型在2個(gè)年齡組中的分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。HCV 1b型的CHC病人多見(jiàn)于≥55歲年齡組中。HCV 1b型與非1b型在2個(gè)年齡組中分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見(jiàn)表3)。

2.3 HCV 1b型NS5B、NS5A及NS3/4A區(qū)RASs發(fā)生情況 70例1b亞型樣本中，NS5B區(qū)全部擴(kuò)增成功(見(jiàn)圖1A)，擴(kuò)增成功率100.00%，70例均檢出NS5B相關(guān)耐藥位點(diǎn)突變，突變率100%；NS5A區(qū)擴(kuò)增成功42例(產(chǎn)物大小1 712 bp，見(jiàn)圖1B)，占60.00%，其中28例檢出NS5A相關(guān)耐藥位點(diǎn)突變，突變率66.67%；NS3/4A區(qū)擴(kuò)增成功68例(產(chǎn)物大小1 018 bp，見(jiàn)圖1C)，擴(kuò)增成功率97.14%，64例檢出NS3/4A相關(guān)耐藥位點(diǎn)突變，突變率94.12%。NS5B區(qū)主要RASs類型：C316N(70例，100.00%)；NS5A區(qū)主要RASs類型：Q54H(17例，40.47%)、Y93H(8例，19.05%)；NS3/4A區(qū)RASs類型：Q86P(21例，30.88%)、I71V+Q86P(13例，19.12%)、V170I+Q86P(10例，14.71%)及T72I/A+Q86P(9例，13.24%)(見(jiàn)表4、5)。其中NS3/4A區(qū)突變頻率較高的RASs依次為：Q86P(53.78%)、I71V/S(15.97%)、V170I(10.92%)及T72I/A(10.08%)；NS5A區(qū)突變頻率較高的RASs依次為：Q54H(60.00%)、Y93H(33.33%)；NS5B區(qū)突變頻率較高的為C316N(100.00%)。

表2 102例HCV感染者基因亞型分布[n；百分率(%)]

表3 HCV基因亞型在年齡中的分布情況[n；百分率(%)]

3 討論

本研究明確了淮北市HCV亞型流行特征：以1b型為主，2a型次之，此外首次檢出3a型(2例，1.96%)。這與國(guó)內(nèi)HCV亞型的流行情況基本相符[3]。HCV亞型的分布在性別、年齡上無(wú)明顯差異(P>0.05)，與國(guó)內(nèi)的報(bào)道[9]不盡相同，其中HCV 1b型的HCV感染者多見(jiàn)于≥55歲年齡組中，2a型在2個(gè)年齡組中均常見(jiàn)。2例3a型的病人均分布在<55歲年齡組。

目前NS5A、NS5B及NS3/4A區(qū)域是DAAs治療的主要靶點(diǎn)。隨著DAAs廣泛應(yīng)用，有部分丙肝病人體內(nèi)存在針對(duì)NS5A、NS5B及NS3/4A抑制劑的天然耐藥位點(diǎn)突變，會(huì)影響抗病毒治療的療效[6-8,10-11]。NS5A抑制劑主要有Daclatasvir、Ledipasvir、Qmbitasvir、Elbasvir及Velpatasvir等，主要RASs包括L31M和Y93H突變，其中L31M主要是對(duì)Ledipasvir耐藥，對(duì)Daclatasvir可能耐藥，而Y93H對(duì)Daclatasvir、Ledipasvir和Qmbitasvir均明顯耐藥。H58P和P58S主要針對(duì)Daclatasvir耐藥，Q54H主要是Daclatasvir和ABT-267的耐藥[8]；本研究中HCV1b型NS5A相關(guān)耐藥位點(diǎn)突變率66.67%，遠(yuǎn)高于伍菲菲等[8，12]報(bào)道的46.0%、22.4%，推測(cè)以上結(jié)果可能是HCV基因型分布的地域差異性導(dǎo)致。NS5A區(qū)主要突變?yōu)镼54H(40.47%)、Y93H(19.05%)，其中Y93H突變率遠(yuǎn)高于SUN等[12]報(bào)道的6.6%、15.5%的結(jié)果。此外，不同的是，本研究未檢測(cè)出L31M突變，檢出的聯(lián)合突變?yōu)镼54H+Y93H、P58S+Y93H。這些聯(lián)合突變是否會(huì)增加抗病毒藥物療效的影響，還有待于進(jìn)一步研究。

NS5B抑制劑主要包括核苷類聚合酶抑制劑Sofosbuvir和非核苷類聚合酶抑制劑Dasabuvir，RASs主要包括S282T、C316N等；其中S282T是索磷布韋的重要耐藥位點(diǎn)，C316N被認(rèn)為是引起病人未達(dá)到持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答的原因之一[6]。本研究中HCV 1b亞型NS5B區(qū)域C316N為100.00%，均未發(fā)現(xiàn)S282T，這與國(guó)內(nèi)的相關(guān)報(bào)道[6]一致。而HCV C316N出現(xiàn)選擇性變異與HCV-796治療的病人后迅速出現(xiàn)病毒反彈有關(guān)[11]，提示日后應(yīng)用該藥時(shí)易出現(xiàn)耐藥，也提示聯(lián)合藥物治療的必要性。

表4 68例HCV感染者NS3/4A耐藥相關(guān)突變情況[n;百分率(%)]

表5 42例HCV感染者NS5A耐藥相關(guān)突變情況[n;百分率(%)]

NS3/4A抑制劑主要有Telaprevir、Roceprevir、ITMN191、SCH900518及TMC435等，主要RASs包括V36G、V55F、I71V/L、T72I/A/L、Q80N、Q86P、V170A/T及M175L等，其中V36、V55F及V170A/T與Telaprevir、Roceprevir耐藥相關(guān)，M175L與Boceprevir耐藥相關(guān)，Q80N與TMC435耐藥相關(guān)等[7,10]。

本研究中HCV lb型NS3/4A耐藥相關(guān)位點(diǎn)突變率為94.12%,遠(yuǎn)高于國(guó)內(nèi)李展翼等[10]報(bào)道的38.33%。68例HCV型樣本中NS3/4A區(qū)以聯(lián)合突變?yōu)橹鳎疃嗫蛇_(dá)五重突變，均存在Q86P變異。NS3/4A區(qū)RASs主要為低-中度耐藥的變異，如V36L、T54S、Q80P、Vl70I等，未檢出致高度耐藥的主要變異Al56S及Rl55Q[7,10]，多位點(diǎn)耐藥聯(lián)合突變的現(xiàn)象是否會(huì)增加對(duì)抗病毒藥物的影響還需進(jìn)一步研究。此外，本研究還提示淮北市HCV 1b型突變頻率較高的天然耐藥突變位點(diǎn)依次為：C316N(100.00%)、Q54H(60.00%)、Q86P(53.78%)、Y93H(33.33%)及I71V/S(15.97%)。這提示該地區(qū)感染HCV 1b型病人DAAs替換治療時(shí)候應(yīng)對(duì)以上位點(diǎn)耐藥相關(guān)的藥物引起注意，避免和減少耐藥的發(fā)生。

綜上所述，淮北市未經(jīng)過(guò)抗病毒治療HCV感染病人以1b型為主，2a型次之，3a型較少。其主要流行的1b型存在天然耐藥位點(diǎn)突變。DAAs抗病毒治療時(shí)，需要先進(jìn)行基因型和RASs的檢測(cè)，再制定適合的治療方案。