郭佳妮，向妮艷，張文才，陳忠海，劉 星,3*，丁亞麗

1.西藏大學(xué)理學(xué)院 青藏高原生態(tài)與環(huán)境研究中心極端環(huán)境生物適應(yīng)與進(jìn)化實(shí)驗(yàn)室，西藏 拉薩 850000

2.西藏大學(xué)醫(yī)學(xué)院，西藏 拉薩 850000

3.武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430072

轉(zhuǎn)錄因子是一類(lèi)重要的基因表達(dá)調(diào)控因子，通常具有DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域、反轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域、核定位信號(hào)和寡聚位點(diǎn)，能夠調(diào)控特定基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)。在轉(zhuǎn)錄因子家族中，MYB 轉(zhuǎn)錄因子數(shù)量眾多、功能多樣，是植物中最重要的轉(zhuǎn)錄因子家族之一[1]，MYB 轉(zhuǎn)錄因子家族具有高度保守的DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域，該保守結(jié)構(gòu)域由1～4 個(gè)串聯(lián)且不完全重復(fù)的R 基序組成，每一個(gè)R 基序編碼50～53 個(gè)氨基酸殘基，經(jīng)過(guò)折疊形成HTH 的螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋結(jié)構(gòu)[2]。MYB 轉(zhuǎn)錄因子依據(jù)其N(xiāo) 端含有的特有保守基序的數(shù)量劃分為 1R-MYB（MYB-related）、

2R-MYB（R2R3-MYB）、3R-MYB（R1R2R3-MYB）和4R-MYB 4 個(gè)亞家族[3]，其中2R-MYB 是植物中最常見(jiàn)和目前功能研究最多的亞家族[4-5]。MYB轉(zhuǎn)錄因子作為調(diào)控生長(zhǎng)發(fā)育、次級(jí)代謝物和脅迫響應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)控因子[6]，在植物應(yīng)對(duì)高鹽、干旱、極端溫度和營(yíng)養(yǎng)缺乏等非生物脅迫方面具有重要意義[7-8]。目前，MYB 轉(zhuǎn)錄因子在植物中得到了廣泛研究，Cao 等[9]過(guò)表達(dá)蘋(píng)果MdoMYB121 基因顯著增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因番茄和蘋(píng)果植株對(duì)高鹽、干旱和低溫脅迫的耐受性；Cao 等[10]通過(guò)外源過(guò)表達(dá)楊梅MrMYB12 基因增加了煙草中黃酮醇的積累，從而減少了花青素的合成，產(chǎn)生淡粉色和純白色的花；Zhang 等[11]發(fā)現(xiàn)在脅迫環(huán)境下，擬南芥AtMYB49基因可以調(diào)節(jié)葉片角質(zhì)層的沉積，從而調(diào)控植株的耐鹽性；Vannini 等[12]將水稻OsMYB4 基因在擬南芥中過(guò)表達(dá)顯著的提高了轉(zhuǎn)基因植株的耐寒性和抗凍性；Feng 等[13]發(fā)現(xiàn)擬南芥AtMYB68 基因在根中柱鞘細(xì)胞中的特異表達(dá)能參與調(diào)節(jié)木質(zhì)素的生成，影響植株根系發(fā)育。

多刺綠絨蒿Meconopsis horridulaHook.f.et Thoms.為罌粟科綠絨蒿屬一年生草本植物，葉全部基生，葉片披針形，花芽近球形，主根肥厚而延長(zhǎng)，生長(zhǎng)于海拔3600～5100 m 以上的草甸、高山和流石灘地帶，在中國(guó)主要分布于西藏、甘肅西部、青海東部至南部和四川西部等高原地區(qū)。多刺綠絨蒿作為傳統(tǒng)藏藥，具有清熱止痛、活血化瘀等功效，被藏醫(yī)廣泛用于治療頭傷、骨折和跌打損傷等疾病[14]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，多刺綠絨蒿在抗病毒、抗腫瘤及心肌保護(hù)方面也有重要療效[15-16]。李長(zhǎng)山等[17]對(duì)多刺綠絨蒿乙醇提取物進(jìn)行抗病毒活性測(cè)試，結(jié)果顯示其提取物可以抑制甲型流感病毒。郭志琴[18]發(fā)現(xiàn)多刺綠絨蒿乙醇提取物對(duì)心肌缺血導(dǎo)致的血脂紊亂和心功能下降具有一定改善作用。多刺綠絨蒿具有豐富的次級(jí)代謝產(chǎn)物，目前從多刺綠絨蒿中分離得到黃酮類(lèi)、萜類(lèi)、生物堿類(lèi)等化合物，其中黃酮類(lèi)物質(zhì)作為重要的藥效物質(zhì)，其含量與生長(zhǎng)環(huán)境密切相關(guān)[19-22]，在高原環(huán)境下黃酮類(lèi)物質(zhì)的積累，有助于植物抵御強(qiáng)輻射所造成的氧化損傷[23-24]。近年來(lái)多刺綠絨蒿的研究大多集中在化學(xué)成分鑒定及臨床醫(yī)藥方面，對(duì)其如何應(yīng)對(duì)高原極端環(huán)境的適應(yīng)性進(jìn)化及次級(jí)代謝物的調(diào)控機(jī)制卻鮮有報(bào)道[25]。

本研究基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)鑒定了多刺綠絨蒿MYB轉(zhuǎn)錄因子家族成員，對(duì)其理化性質(zhì)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、保守基序、系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系和表達(dá)模式進(jìn)行分析，并預(yù)測(cè)了部分多刺綠絨蒿MYB轉(zhuǎn)錄因子的功能，篩選出可能參與黃酮類(lèi)代謝及非生物脅迫等方面的MYB 轉(zhuǎn)錄因子，為進(jìn)一步揭示和深入研究MYB 轉(zhuǎn)錄因子在多刺綠絨蒿的生長(zhǎng)發(fā)育、次生代謝及脅迫響應(yīng)機(jī)制等方面提供理論依據(jù)和基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為藏藥多刺綠絨蒿的可持續(xù)開(kāi)發(fā)利用、生物多樣性保護(hù)及環(huán)境適應(yīng)性機(jī)制的研究提供科學(xué)依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料

多刺綠絨蒿實(shí)驗(yàn)材料采集于西藏自治區(qū)拉薩市達(dá)瓊村（89°19?57″E，30°42?97″N，4925 m）、東德措（92°94?52″E，30°99?18″N，4872 m）和奪底溝（91°11'16″E，29°43'33″N，3980 m）3 個(gè)不同海拔地點(diǎn)，每個(gè)地點(diǎn)3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)，共采集9 份葉片組織樣品，液氮速凍后，存放于超低溫冰箱（-80 ℃）；進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，共獲得60.15 Gb 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。樣品由武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院劉星教授鑒定多刺綠絨蒿M.horridulaHook.f.et Thoms.植株，標(biāo)本現(xiàn)保存于西藏大學(xué)青藏高原生態(tài)與環(huán)境研究中心極端環(huán)境生物適應(yīng)與進(jìn)化實(shí)驗(yàn)室。

2 方法

2.1 多刺綠絨蒿MYB 家族鑒定及理化性質(zhì)分析

在Pfam（http://pfam.xfam.org）網(wǎng)站中下載MYB轉(zhuǎn)錄因子的隱馬爾可夫模型（PF00249），利用HMMER3.0 軟件中hmmsearch 程序進(jìn)行鑒定；下載擬南芥已發(fā)表MYB 轉(zhuǎn)錄因子家族成員作為種子文件，利用Blast 軟件進(jìn)行blastp 比對(duì)；將hmmsearch與blastp 2 種鑒定結(jié)果進(jìn)行合并取交集作為候選基因提交至SMART（https://smart.embl.de/）、NCBI-CDD（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）、Pfam.search（http://pfam.xfam.org/） 和 PROSITE （https://prosite.expasy.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域的驗(yàn)證。

通過(guò)ExPASy（https://web.expasy.org/）網(wǎng)站對(duì)MYB 轉(zhuǎn)錄因子的基本理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)；利用CELLO[CELLO:Subcellular Localization Predictive System]網(wǎng)站（nctu.edu.tw）進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析；利用 SOPMA[NPS@:SOPMA secondary structure prediction]網(wǎng)站（ibcp.fr）對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。

2.2 多刺綠絨蒿MYB轉(zhuǎn)錄因子基因本體（gene ontology，GO）GO 功能注釋

利用 Blast2GO （Basic 6.0 https://www.blast2go.com/）軟件對(duì)多刺綠絨蒿MYB轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行功能預(yù)測(cè)，利用軟件的Blast 工具將多刺綠絨蒿MYB轉(zhuǎn)錄因子蛋白序列與非冗余（nr）蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，并對(duì)每個(gè)MYB 轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行GO 注釋?zhuān)褂肦 軟件（version 4.2.1）繪制GO 注釋分類(lèi)圖。

2.3 多刺綠絨蒿MYB轉(zhuǎn)錄因子保守基序分析

利用MEME（MEME，V.5.4.1，http://memesuite.org/tools/meme）在線分析網(wǎng)站，對(duì)多刺綠絨蒿MYB轉(zhuǎn)錄因子家族成員進(jìn)行保守基序的鑒定，并使用TBtools 軟件（version 1.09876）對(duì)保守基序分析結(jié)果進(jìn)行可視化。

2.4 多刺綠絨蒿MYB轉(zhuǎn)錄因子系統(tǒng)發(fā)育分析

利用MEGA 軟件（version 11）內(nèi)置的Clustal W程序，將多刺綠絨蒿106 個(gè)MYB 轉(zhuǎn)錄因子和擬南芥195 個(gè)MYB 轉(zhuǎn)錄因子蛋白序列以及52 個(gè)R2R3-MYB 和擬南芥126 個(gè)R2R3-MYB 轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)序列分別進(jìn)行序列比對(duì)，選用鄰接（neighborjoining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，Bootstrap method參數(shù)取值1000，其余參數(shù)選擇默認(rèn)值，并使用iTOL網(wǎng)站（https://itol.embl.de/）進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)美化。

2.5 多刺綠絨蒿R2R3-MYB 蛋白特征結(jié)構(gòu)域分析

利用DNAMAN（version 9.0）軟件對(duì)多刺綠絨蒿R2R3-MYB 轉(zhuǎn)錄因子蛋白序列進(jìn)行多序列比對(duì)，提取其R2 和R3 保守結(jié)構(gòu)域中相應(yīng)的氨基酸殘基分布，利用WebLogo 3 網(wǎng)站（http://weblogo.Threeplusone.com/）繪制特征結(jié)構(gòu)域的序列標(biāo)識(shí)。

3 結(jié)果與分析

3.1 多刺綠絨蒿MYB轉(zhuǎn)錄因子鑒定與理化性質(zhì)分析

通過(guò)Hmmsearch 和blastp 比對(duì)在多刺綠絨蒿中共得到187 個(gè)MYB 轉(zhuǎn)錄因子，利用SMART、PROSITE、NCBI-CDD 和Pfam 數(shù)據(jù)庫(kù)篩選，去掉保守結(jié)構(gòu)域不完整的和重復(fù)的序列，最終鑒定到106 個(gè)MYB 轉(zhuǎn)錄因子，其中1RMYB 類(lèi)49 個(gè)、R2R3-MYB 類(lèi)52 個(gè)、3R-MYB 類(lèi)5 個(gè)，命名為MhMYB1～106（表1）。

對(duì)106 個(gè)多刺綠絨蒿MYB轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行蛋白長(zhǎng)度、相對(duì)分子質(zhì)量、等電點(diǎn)和酸堿性等基本性質(zhì)預(yù)測(cè)（表 1），結(jié)果顯示其蛋白序列長(zhǎng)度為 77（MhMYB101）～976（MhMYB50）個(gè)氨基酸殘基；蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為8750（MhMYB101）～110 680（MhMYB50）；等電點(diǎn)為4.720（MhMYB78）～10.452（MhMYB101），其中53 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子蛋白等電點(diǎn)小于7，偏酸性，其中53 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子等電點(diǎn)大于7，偏堿性；蛋白疏水性為-1.12（MhMYB37）～-0.31（MhMYB17），表明多刺綠絨蒿MYB轉(zhuǎn)錄因子均為親水性蛋白質(zhì)；不穩(wěn)定系數(shù)為28.348（MhMYB29）～71.011（MhMYB9），其中MhMYB77、MhMYB47、MhMYB44、MhMYB25、MhMYB30、MhMYB94 和MhMYB29 的不穩(wěn)定系數(shù)系小于40 為穩(wěn)定蛋白，其余蛋白序列不穩(wěn)定系數(shù)均大于40，表明多刺綠絨蒿MYB轉(zhuǎn)錄因子以不穩(wěn)定蛋白為主。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示106個(gè)MYB 轉(zhuǎn)錄因子有97個(gè)預(yù)測(cè)到細(xì)胞核（nuclear）中，8 個(gè)預(yù)測(cè)到線粒體（mitochondrial）中，1 個(gè)預(yù)測(cè)到細(xì)胞質(zhì)（cytoplasmic）中，表明MYB 轉(zhuǎn)錄因子蛋白主要在細(xì)胞核中發(fā)揮作用。

為明確多刺綠絨蒿MYB轉(zhuǎn)錄因子的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)組成，對(duì)MhMYBs 蛋白序列進(jìn)行了二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)（表1），結(jié)果顯示多刺綠絨蒿MYB轉(zhuǎn)錄因子家族二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由4 種類(lèi)型組成，其中無(wú)規(guī)則卷曲（random coil）占比為29.07%～73.45%；α-螺旋結(jié)構(gòu)（alpha helix）占比為11.43%～60.47%；β-轉(zhuǎn)角（beta turn）占比為1.02%～14.61%；延伸鏈（extend strand）占比為0～20.45%。

表1 多刺綠絨蒿MYB 蛋白基本信息及理化性質(zhì)預(yù)測(cè)Table 1 Basic information and physicochemical properties prediction of MYB protein of M.horridula

續(xù)表1

3.2 多刺綠絨蒿MYB轉(zhuǎn)錄因子GO 功能注釋

多刺綠絨蒿MYB轉(zhuǎn)錄因子GO 功能預(yù)測(cè)結(jié)果顯示（圖1），多刺綠絨蒿MYB轉(zhuǎn)錄因子蛋白主要注釋在細(xì)胞成分（cellular component，CC）、生物過(guò)程（biological process，BP）、和分子功能（molecular function，MF）3 大類(lèi)。GO 富集分析結(jié)顯示，MYB轉(zhuǎn)錄因子蛋白功能在細(xì)胞成分（cellular component，CC）方面主要富集在細(xì)胞核（GO：0005634）、細(xì)胞上細(xì)胞器（GO：0043229）和核糖體（GO：0000786）等細(xì)胞成分；生物過(guò)程（biological process，BP）中主要富集在細(xì)胞發(fā)育過(guò)程（GO：0048869）、細(xì)胞分化（GO：0030154）和生物合成調(diào)節(jié)（GO：0048583）等方面；分子功能（molecular function，MF）方面主要富集在轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性（GO：0140110）、DNA結(jié)合（GO：0003677）和有機(jī)環(huán)化合物結(jié)合（GO：0097159）等方面。

圖1 多刺綠絨蒿MYB轉(zhuǎn)錄因子家族GO 注釋Fig.1 GO annotation of MYB transcription factor family in M.horridula

3.3 多刺綠絨蒿MYB轉(zhuǎn)錄因子保守基序分析

為進(jìn)一步說(shuō)明多刺綠絨蒿MYB轉(zhuǎn)錄因子的多樣性和進(jìn)化關(guān)系，利用MEME 網(wǎng)站進(jìn)行保守基序分析，并結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)進(jìn)行可視化（圖2）。結(jié)果顯示，多刺綠絨蒿MYB轉(zhuǎn)錄因子家族共鑒定到10 個(gè)保守基序，其中motif3（89.62%）、motif1（51.89%）和motif7（46.23%）三者出現(xiàn)的頻率較高。其中2R-MhMYBs 亞家族基序保守性強(qiáng)，大多都包含了motif2、motif3、motif5、motif1 和motif7，且都位于蛋白序列N 端。1R-MhMYBs 保守基序的數(shù)量較少且位置變化較大，大多都包含了motif3 和motif4。結(jié)合系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，同一亞家族具有相似的motif 的種類(lèi)與分布，不同亞家族在種類(lèi)與分布上具有較大差異，且處于鄰近分支的MYB 轉(zhuǎn)錄因子的保守基序的位置結(jié)構(gòu)與類(lèi)型更相近。

圖2 多刺綠絨蒿MYB轉(zhuǎn)錄因子蛋白保守motifFig.2 Motif analysis of MYB transcription factors in M.horridula

3.4 多刺綠絨蒿MYB轉(zhuǎn)錄因子家族系統(tǒng)進(jìn)化分析

對(duì)106 個(gè)多刺綠絨蒿MYB轉(zhuǎn)錄因子與擬南芥195 個(gè)MYB 轉(zhuǎn)錄因子的蛋白序列進(jìn)行多序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化分析（圖3）。結(jié)果顯示，多刺綠絨蒿MYB轉(zhuǎn)錄因子不同亞家族成員均能與擬南芥相應(yīng)類(lèi)型的轉(zhuǎn)錄因子聚類(lèi)到一起，該結(jié)果與結(jié)構(gòu)域鑒定分類(lèi)結(jié)果基本一致，說(shuō)明MhMYBs 的鑒定及分類(lèi)結(jié)果可靠，表明多刺綠絨蒿和擬南芥的MYB 轉(zhuǎn)錄因子家族具有相似的進(jìn)化過(guò)程，具有比較高的保守性。

圖3 多刺綠絨蒿和擬南芥MYB 轉(zhuǎn)錄因子家族系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of MYB transcription factors in M.horridula and A.thaliana

為研究多刺綠絨蒿R2R3-MhMYB 的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，對(duì)多刺綠絨蒿與擬南芥R2R3-MYB 轉(zhuǎn)錄因子構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖 4），并結(jié)合擬南芥R2R3-MYB 蛋白亞組的分類(lèi)依據(jù)[3]，將多刺綠絨蒿R2R3-MYB 轉(zhuǎn)錄因子分為了24 個(gè)亞組（C1～C24），其中有18 個(gè)亞組能與擬南芥已分類(lèi)亞組聚為一支，包括C1（S4）、C6（S1）和C10（S6）等，C3、C12 和C14 等6 個(gè)多刺綠絨蒿亞組包含擬南芥未分類(lèi)的轉(zhuǎn)錄因子，有S3、S10、S12、S15和S16 這5 個(gè)擬南芥亞組未能與多刺綠絨蒿MYB轉(zhuǎn)錄因子聚類(lèi)。多刺綠絨蒿與擬南芥R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子的聚類(lèi)結(jié)果表明，聚類(lèi)在一起的轉(zhuǎn)錄因子具有較高的同源性與序列相似性，并可能具有類(lèi)似的功能，多刺綠絨蒿與擬南芥物種后期朝不同的進(jìn)化方向發(fā)展，也導(dǎo)致了部分R2R3-MYB 轉(zhuǎn)錄因子的特異性分化。

圖4 多刺綠絨蒿與擬南芥R2R3-MYB 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree of R2R3-MYB of M.horridula and A.thaliana

3.5 多刺綠絨蒿R2R3-MYB 轉(zhuǎn)錄因子特征結(jié)構(gòu)域分析

為研究多刺綠絨蒿R2R3-MYB 轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)域同源性特征，進(jìn)一步展示在特定位置的保守性，分別對(duì)多刺綠絨蒿和擬南芥R2R3-MYB 蛋白序列進(jìn)行多序列比對(duì)分析，并對(duì)R2 和R3 保守結(jié)構(gòu)域特征進(jìn)行可視化（圖5）。結(jié)果顯示多刺綠絨蒿R2R3-MYB 蛋白與擬南芥R2R3-MYB 蛋白相似，在R2 和R3 重復(fù)序列中存在多個(gè)保守的氨基酸，尤其是特征色氨酸（W），且都具有［-W-（X19）-W-（X19）-W-］和［-F-（X18）-W-（X18）-W-］結(jié)構(gòu)域；其中R2 結(jié)構(gòu)包括3 個(gè)極度保守的色氨酸（W），每2 個(gè)色氨酸殘基間隔19 個(gè)氨基酸殘基；R3 結(jié)構(gòu)包括2 個(gè)極度保守的色氨酸（W），第1 個(gè)色氨酸被苯丙氨酸（F）、異亮氨酸（I）及亮氨酸（L）取代，第2 個(gè)色氨酸和第3 個(gè)色氨酸殘基間隔18 個(gè)氨基酸殘基；除高度保守的色氨酸（W）外，R2 和R3 結(jié)構(gòu)中也存如賴(lài)氨酸（K）、蘇氨酸（T）、精氨酸（R）、天冬酰胺（N）、甘氨酸（G）和谷氨酸（E）等保守氨基酸殘基，這類(lèi)保守氨基酸殘基通常出現(xiàn)在各重復(fù)區(qū)的后半部分，即第2 和第3 個(gè)的保守色氨酸之間的區(qū)域，且在每個(gè)重復(fù)區(qū)中與前2 個(gè)螺旋區(qū)域相比第3 個(gè)螺旋區(qū)保守性更高，表明這類(lèi)保守氨基酸殘基具有維持MYB 結(jié)構(gòu)域的HTH 結(jié)構(gòu)的作用。

圖5 多刺綠絨蒿和擬南芥R2R3-MYB 轉(zhuǎn)錄因子特征結(jié)構(gòu)域序列標(biāo)識(shí)Fig.5 Conserved domain logos of R2R3-MYB transcription factors in M.horridula and A.thaliana

3.6 多刺綠絨蒿MYB轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)分析

MYB 轉(zhuǎn)錄因子在非生物脅迫及植物黃酮類(lèi)代謝方面具有重要調(diào)節(jié)作用，多刺綠絨蒿生長(zhǎng)于青藏高原高海拔地區(qū)，生長(zhǎng)環(huán)境惡劣多變，為探究多刺綠絨蒿MYB轉(zhuǎn)錄因子在不同海拔間的潛在關(guān)系，研究多刺綠絨蒿R2R3-MYB 轉(zhuǎn)錄因子與黃酮類(lèi)合成途徑和非生物脅迫相關(guān)基因在不同海拔的表達(dá)特異性，對(duì)多刺綠絨蒿MYB轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行表達(dá)模式分析（圖6）。結(jié)果顯示，106 個(gè)MYB 轉(zhuǎn)錄因子中，有28 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)量隨海拔升高而升高，11 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量隨海拔升高而降低。52 個(gè)R2R3-MYB 轉(zhuǎn)錄因子中，14個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)量變化與海拔變化一致，5 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量與海拔變化相反。其中MhMYB90、MhMYB84和MhMYB62分別聚類(lèi)到擬南芥黃酮類(lèi)代謝物相關(guān)的S4、S6、S7 亞組，表達(dá)量均與海拔呈正相關(guān)；MhMYB 81、MhMYB 82，MhMYB63、MhMYB56、MhMYB55，MhMYB83，MhMYB101，MhMYB 58分別聚類(lèi)到擬南芥非生物脅迫相關(guān)的S2、S13、S21、S22、S23 亞組，其中MhMYB81，MhMYB63、MhMYB56、MhMYB55，MhMYB83，MhMYB101，MhMYB58 表達(dá)量變化與海拔變化一致，MhMYB82 表達(dá)量變化與海拔變化相反。

圖6 不同海拔梯度下多刺綠絨蒿MYB轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)量分析Fig.6 Expression profiles of MYB transcription factors of M.horridula in different altitude gradients

4 討論

MYB 轉(zhuǎn)錄因子具有特有的MYB DNA 結(jié)合域，能夠特異結(jié)合基因啟動(dòng)子區(qū)域的作用元件，根據(jù)植物生長(zhǎng)發(fā)育及環(huán)境變化調(diào)控相關(guān)的基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，是植物生長(zhǎng)過(guò)程中的重要調(diào)節(jié)因子[26]，對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育具有重要意義。目前已在擬南芥、小麥、大豆、刺梨、柑橘和楊梅等多個(gè)物種中被鑒定[27-30]。本研究基于多刺綠絨蒿轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)鑒定獲得了106個(gè)MYB 轉(zhuǎn)錄因子，其中包含49 個(gè)1R-MYB、52個(gè)R2R3-MYB 和5 個(gè)3R-MYB，通過(guò)對(duì)多刺綠絨蒿MYB轉(zhuǎn)錄因子理化性質(zhì)預(yù)測(cè)顯示，多刺綠絨蒿MYB轉(zhuǎn)錄因子均為親水性蛋白質(zhì)，53 個(gè)蛋白偏酸性，53 個(gè)蛋白偏堿性。不穩(wěn)定系數(shù)顯示多刺綠絨蒿MYB轉(zhuǎn)錄因子中除了7 個(gè)為穩(wěn)定蛋白，其余99 個(gè)都為不穩(wěn)定蛋白，這與王靜文等[31]對(duì)細(xì)葉百合的研究結(jié)果相類(lèi)似。在亞細(xì)胞定位中預(yù)測(cè)到細(xì)胞核、線粒體和細(xì)胞質(zhì)3 種類(lèi)型，且主要在細(xì)胞核中發(fā)揮作用，這與Cao 等[32]分析MYB 轉(zhuǎn)錄因子在中國(guó)梨的細(xì)胞核中發(fā)揮重要作用相似。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明多刺綠絨蒿MYB轉(zhuǎn)錄因子家族成員存在4 種二級(jí)結(jié)構(gòu)，其中α-螺旋結(jié)構(gòu)和無(wú)規(guī)則卷曲占比較高，蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)與蛋白質(zhì)的功能息息相關(guān)，表明這2種結(jié)構(gòu)更有助于MYB 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)形成，這與張耐等[33]對(duì)甘草MYB 的研究及李明明等[34]對(duì)谷子MYB-CC 研究結(jié)果相一致。

多刺綠絨蒿保守基序分析表明，各亞家族motif組成相對(duì)保守，聚類(lèi)到同一分支的MYB 因子具有更為相似的motif 組成和分布類(lèi)型，而不同分支間則有所差異，這與谷佳等[35]對(duì)三色堇MYB 轉(zhuǎn)錄因子的研究相一致。保守基序分析能夠展現(xiàn)該家族進(jìn)化過(guò)程中的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，為其功能研究提供理論基礎(chǔ)，相似的保守基序組成和分布表明其可能在多刺綠絨蒿的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中具有相似的功能作用，而距離較遠(yuǎn)的分支其保守基序的位置與結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)差異可能是造成轉(zhuǎn)錄因子功能分化的重要因素[36]。對(duì)多刺綠絨蒿R2R3-MYB 特征結(jié)構(gòu)域分析表明，該亞家族轉(zhuǎn)錄因子均含有［-W-（X19）-W-（X19）-W-］和［-F-（X18）-W-（X18）-W-］的2 個(gè)相鄰的典型結(jié)構(gòu)域，這與Liu 等[37]對(duì)秈稻R2R3-MYB 的研究結(jié)果一致，表明多刺綠絨蒿R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子在DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域上具有較高的保守性，且在序列比對(duì)中發(fā)現(xiàn)在重復(fù)序列的第一個(gè)螺旋區(qū)及其臨近區(qū)域的保守性相對(duì)較低，常會(huì)發(fā)生氨基酸插入和缺失情況，推測(cè)該區(qū)域可能是該基因家族進(jìn)化和功能分化的活躍區(qū)域，而色氨酸與其余保守度較高的氨基酸殘基對(duì)共同維持HTH 結(jié)構(gòu)具有重要意義。

在植物中MYB 家族有選擇性地?cái)U(kuò)張，其中R2R3-MYB 是植物中存在最廣泛的一類(lèi)MYB 轉(zhuǎn)錄因子，該亞家族成員因在植物生命活動(dòng)中發(fā)揮的重要作用而被廣泛研究[38]。在多刺綠絨蒿中R2R3-MYB 轉(zhuǎn)錄因子可劃分為24 個(gè)亞組，其中有18 個(gè)亞組中含有不同數(shù)量已分類(lèi)亞組的AtMYB 和MhMYB 蛋白，說(shuō)明MYB 轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)化過(guò)程相對(duì)保守[8]。擬南芥作為模式物種，MYB 轉(zhuǎn)錄因子的功能研究較多，以擬南芥AtMYBs 的功能作為參考，結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系和表達(dá)分析，為探討多刺綠絨蒿MYB轉(zhuǎn)錄因子的功能探究提供重要參考。聚類(lèi)結(jié)果表明，MhMYB61 與擬南芥S9 的AtMYB16 聚類(lèi)在一支，擬南芥AtMYB16 有助于花瓣表皮細(xì)胞的形成的功能[39]；MhMYB77 與AtMYB20 聚類(lèi)到一支，擬南芥AtMYB20 參與調(diào)控?cái)M南芥次生細(xì)胞壁形成過(guò)程中木脂素和苯丙氨酸的生物合成[40]。在多刺綠絨蒿中有4 個(gè)（MhMYB72、MhMYB100、MhMYB75、MhMYB90）、2 個(gè)（MhMYB84、MhMYB95）和2 個(gè)（MhMYB62、MhMYBS54）轉(zhuǎn)錄因子分別與擬南芥中黃酮類(lèi)化合物的調(diào)控機(jī)制以及花青素積累相關(guān)的S4、S6 和S7 亞組聚類(lèi)為一支[41-43]，推測(cè)此類(lèi)多刺綠絨蒿轉(zhuǎn)錄因子也具有相似功能，表達(dá)量分析顯示其中MhMYB72、MhMYB75、MhMYB90、MhMYB84 和MhMYB62 這5 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子在兩個(gè)高海拔居群中的表達(dá)量均高于低海拔居群，這可能與高海拔居群植株會(huì)生成黃酮類(lèi)物質(zhì)應(yīng)對(duì)強(qiáng)光輻射以及干旱環(huán)境相關(guān)。擬南芥S4 亞組中的AtMYB4、AtMYB32 和AtMYB7 調(diào)控和表達(dá)能夠增強(qiáng)植物應(yīng)對(duì)強(qiáng)紫外線脅迫的能力[44]，聚類(lèi)到同支的多刺綠絨蒿轉(zhuǎn)錄因子在高海拔居群中的上調(diào)表達(dá)可能也在多刺綠絨蒿應(yīng)對(duì)紫外線脅迫中發(fā)揮重要作用。擬南芥S1、S11、S13、S21、S22、S23 亞組主要與抗旱抗寒等非生物脅迫相關(guān)[45-48]，在多刺綠絨蒿的聚類(lèi)和表達(dá)分析顯示共有15 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子分別聚類(lèi)在S1、S11、S13、S21、S22 和S23 這類(lèi)亞組當(dāng)中，其中有10 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子在高海拔地區(qū)表達(dá)量上調(diào)，說(shuō)明多刺綠絨蒿在應(yīng)對(duì)更高海拔惡劣環(huán)境時(shí)會(huì)通過(guò)抗逆相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)來(lái)調(diào)控次級(jí)代謝通路以應(yīng)對(duì)脅迫環(huán)境，維持自身正常的生命活動(dòng)。

目前，多刺綠絨蒿MYB轉(zhuǎn)錄因子的相關(guān)研究還非常欠缺，MYB 轉(zhuǎn)錄因子在多刺綠絨蒿生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控及非生物脅迫的響應(yīng)機(jī)制還不清楚，本研究通過(guò)生物信息學(xué)方法，鑒定了多刺綠絨蒿的MYB 轉(zhuǎn)錄因子，并系統(tǒng)地對(duì)該家族成員進(jìn)行了基本理化性質(zhì)、系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系和表達(dá)模式等分析。為今后深入研究MYB 轉(zhuǎn)錄因子在多刺綠絨蒿生長(zhǎng)發(fā)育中的作用和應(yīng)對(duì)高原極端環(huán)境的調(diào)控機(jī)制提供了參考基礎(chǔ)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突