劉 洪，鐘凌云，鄧延文，童恒力，陳 浩，王 碩，盧興美

江西中醫(yī)藥大學，江西 南昌 330004

四逆湯為漢代張仲景所著《傷寒論》中用于治療心腎陽衰寒闕證的主方，由附子、干姜、炙甘草組成。四逆湯原始方以生附片入方[1]，借生附子的峻烈強心作用發(fā)揮回陽救逆的作用，但因其主成分雙酯型生物堿過高極易使機體中毒，難以把握其用藥劑量，故后續(xù)各種校訂本中多以炮制品入藥[2]。附子經(jīng)不同方法炮制后，不僅可以降低其毒性，還能改變其藥性，便于臨床根據(jù)病癥發(fā)展程度以及個體的差異選擇合適的炮制品，體現(xiàn)了中醫(yī)方劑因病而異、因人而異的治療特點。

《中國藥典》2020年版[3]中四逆湯單以淡附片入方，而林美斯等[4]使用了生附片、淡附片、白附片、黑順片、炮附片5 種附子炮制品四逆湯用于急性腦缺氧治療，結果表明淡附片入方的四逆湯在該病中療效更佳。同時，吳文笛等[5]在《傷寒論》《中國藥典》和地方名中醫(yī)使用的四逆湯治療膿毒癥的藥效學研究和急性毒性研究中，發(fā)現(xiàn)與《傷寒論》和藥典法四逆湯處方相比，地方名中醫(yī)的經(jīng)驗方四逆湯不僅具有更好的治療膿毒癥作用且毒性最小。上述研究說明，臨床在使用四逆湯用于不同病癥治療時，應選擇合適附子炮制品入方，以最大限度的提高四逆湯的療效并減少其不良作用。

四逆湯中成分是其發(fā)揮療效和產(chǎn)生不良反應的主要物質基礎。在煎煮過程中，四逆湯中不同附子炮制品可能會與方中其他藥物發(fā)生不同的反應，導致湯劑中效毒成分含量存在差異。同時，課題組前期研究發(fā)現(xiàn)江西建昌幫的單味陰附片、陽附片不僅存在效毒差異，且在改善慢性心衰大鼠的心功能時，還存在一定性別差異[6]。故以陰附片、陽附片入方四逆湯后可能會對方中的毒效成分含量產(chǎn)生不同的變化，進而影響該方臨床用藥的安全性。因此本研究首先分析了建昌幫陰附片、陽附片單藥及其入方后的效/毒成分含量差異，同時對比了陰附片四逆湯、陽附片四逆湯、生附片四逆湯和淡附片四逆湯之間的毒性差異，以期為經(jīng)典名方四逆湯擴大附子用藥品種及用藥安全提供科學依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Acquity UPLC 超高效液相色譜儀，美國Waters公司；AE240 電子分析天平，十萬分之一，梅特勒-托利多儀器上海有限公司；RE-52A/52AA 旋轉蒸發(fā)儀、SZ-93 自動雙重純水蒸餾器，上海亞榮生化儀器廠；多功能煎藥壺，潮州市潮安區(qū)順電有限公司；Konelab PRIME 30 全自動生化分析儀，美國Thermo公司；小動物超聲成像系統(tǒng)，富士膠片（中國）投資有限公司。

1.2 試劑與藥品

乙腈、甲醇為色譜純，澳大利亞Besto N 公司；水為娃哈哈純凈水；烏頭堿（批號CHB201226）、新烏頭堿（批號CHB201201）、次烏頭堿（批號CHB201109）、苯甲酰烏頭原堿（benzoylaconine，BAC，批號 CHB180309）、苯甲酰新烏頭原堿（benzoylmesaconine，BMA，批號CHB180310）、苯甲酰次烏頭原堿（bnzoylhypaconine，BHC，批號CHB180307）、甘草酸（批號CHB201104）、6-姜酚（批號CHB201111）對照品均購于成都克洛瑪生物科技有限公司；甘草苷（批號wkq19030708）對照品購于四川維克奇生物科技有限公司；所用對照品質量分數(shù)均≥98%。鹽附子（批號210315）、干姜（批號210122）、炙甘草（批號200826）均購于江西江中中藥飲片有限公司，產(chǎn)地分別為四川江油、犍為及內蒙古阿拉善左旗，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學藥學院龔千鋒教授分別鑒定為毛茛科烏頭屬植物烏頭Aconitum carmichaeliiDebx.的子根的加工品，姜科植物姜Zingiber officinaleRosc.的干燥根莖，豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.的干燥根和根莖炮制加工品，符合《中國藥典》2020年版鑒定標準。

鹽酸阿霉素，南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，批號20210525；卡托普利，山西振東安欣生物制藥有限公司，批號20211102；生理鹽水，江西科倫藥業(yè)有限公司，批號D22070306。

1.3 動物

ICR 小鼠雌雄各半共120 只，SPF 級，體質量18～22 g，購于河南斯克貝斯生物科技股份有限公司，動物合格證號：SCXK（豫）2020-0005。SD 大鼠雌雄各半共160 只，SPF 級，體質量180～200 g，購于江西中醫(yī)藥大學，動物合格證號：SCXK（贛）2018-0003。飼養(yǎng)條件：溫度20～24 ℃，相對濕度40%～70%，人工光照，12 h 明暗周期。動物飼料為大小鼠維持顆粒配合飼料，武漢市萬千佳興生物科技有限公司。本實驗獲得江西中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會批準，倫理審批號為 JZSYDWLL-20201220。

2 方法與結果

2.1 附子飲片的制備

2.1.1 生附片[1]取鹽附子，刮去外皮，用清水浸漂，每日換水2～3 次，至鹽分漂盡，取出，切薄片，曬干，即得生附片（unprocessedAconitepiece，UAP）。

2.1.2 淡附片[3]取鹽附子，用清水浸漂，每日換水2～3 次，至鹽分漂盡，與甘草、黑豆加水共煮透心，至切開后口嘗無麻舌感，取出，除去甘草，黑豆，切薄片，曬干，即得淡附片（GlycyrrhizacookedAconitepiece，GCAP）。

2.1.3 陰附片[7]取鹽附子，用清水浸漂，漂至口嘗微咸為度，取出曬干。用生姜汁悶潤，以透心為度，取出。入木甑內，待鍋中水沸，隔水坐鍋，用武火蒸至藥材熟透，口嘗無或微有麻舌感時，?；鹑〕?，日攤夜悶至約七成干，內外水分均勻時，切成薄片，晾曬至干，篩去灰屑，即得陰附片（dried ginger steamedAconitepiece，DGSAP）。

2.1.4 陽附片[7]取鹽附子，刮去外皮，切成3 mm厚片，用清水浸漂，漂至口嘗味淡為度，撈起。攤開翻曬至全干。取凈砂至鍋內炒至滑利，倒入藥片，不斷翻炒，至藥片斷面鼓起，變白黃色為度，取出，篩去砂子及灰屑，攤涼，即得陽附片（sand friedAconitepiece，SFAP）。

2.2 湯劑的制備

2.2.1 附子單煎湯劑的制備[8]取單味附子飲片15 g，加飲片8 倍質量水浸泡30 min，武火（170 ℃）煮沸后改文火（120 ℃）煎煮30 min，濾出藥渣。藥渣加飲片7 倍質量水二次煎煮20 min，濾出藥渣。合并2 次濾液，抽濾后濃縮定容。

2.2.2 不同附子炮制品四逆湯湯劑的制備 取四逆湯處方飲片（附子15 g、炙甘草15 g、干姜10 g），按上法制備不同附子炮制品四逆湯湯劑（Sini Decoction ，SND），分別為生附片四逆湯（UAPSND）、淡附片四逆湯（GCAPSND）、陰附片四逆湯（DGSAPSND）、陽附片四逆湯（SFAPSND）。

2.3 供試品、對照品溶液的制備

2.3.1 供試品溶液的制備 取“2.2”項下所制湯劑10 mL 于50 mL 圓底燒瓶中，減壓揮干溶劑，乙腈溶解殘渣，轉移、定容于10 mL 量瓶，搖勻。0.25 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得各湯劑供試品溶液。

2.3.2 對照品溶液的制備 分別精密稱定烏頭堿0.865 mg、新烏頭堿0.345 mg、次烏頭堿2.02 mg、BAC 2.25 mg、BMA 4.50 mg、BHC 1.65 mg、甘草苷7.26 mg、甘草酸7.88 mg、6-姜酚2.32 mg，置于棕色量瓶中，溶于2 mL 乙腈中，搖勻，即得各對照品母液。

2.4 色譜條件

色譜柱為Waters BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相為乙腈-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫：0～8 min，10%～20%乙腈；8～15 min，20%～25%乙腈；15～20 min，25%～30%乙腈；20～30 min，30%～50%乙腈；30～40 min，50%～90%乙腈；體積流量0.2 mL/min；檢測波長為235 nm；柱溫為26 ℃；進樣量為2 μL?；旌蠈φ掌啡芤杭? 種四逆湯供試品溶液的色譜圖見圖1。

圖1 混合對照品溶液及4 種四逆湯供試品溶液的UPLC 圖Fig.1 UPLC of mixed reference substances solution and four kinds of Sini Decoction

2.5 方法學考察

2.5.1 精密度試驗 取“2.3.2”項下各對照品母液適量配成混合對照品溶液，按“2.4”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6 次，計算得到烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿、BAC、BMA、BHA、甘草苷、甘草酸、6-姜酚峰面積的RSD 分別為0.88%、1.67%、0.61%、0.99%、1.42%、0.95%、1.06%、0.72%、0.37%，表明儀器精密度良好。

2.5.2 穩(wěn)定性試驗 取“2.3.1”項下淡附片四逆湯供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h 按“2.4”項下色譜條件重復進樣3 次，計算得到烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿、BAC、BMA、BHA、甘草苷、甘草酸、6-姜酚峰面積的RSD 分別為0.35%、0.24%、0.43%、0.27%、0.30%、0.24%、0.23%、0.22%、0.27%，表明供試品溶液在24 h 內穩(wěn)定性。

2.5.3 重復性試驗 取6 份淡附片四逆湯處方重復制備6 份淡附片四逆湯供試品溶液，按“2.4”項下色譜條件重復進樣3 次，計算得到烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿、BAC、BMA、BHA、甘草苷、甘草酸、6-姜酚質量分數(shù)的RSD 分別為1.81%、0.71%、1.96%、1.75%、0.90%、1.05%、0.28%、0.88%、1.58%，表明本方法具有可重復性。

2.5.4 線性關系考察 精密吸取“2.3.2”項下各對照品母液適量，乙腈定容至刻度線，即得系列對照品混合對照品溶液，其中烏頭堿質量濃度梯度為173.0、86.5、51.9、34.6、17.3、4.3 μg/mL，新烏頭堿質量濃度梯度為172.5、86.3、60.4、43.1、25.9、8.6 μg/mL，次烏頭堿質量濃度梯度為303.0、202.0、121.2、80.8、40.4、20.2 μg/mL，BAC 質量濃度梯度為225.0、112.5、78.8、56.3、33.8、11.3 μg/mL，BMA質量濃度梯度為337.5、225.0、112.5、67.5、45.0、11.3 μg/mL，BHA 質量濃度梯度為165.0、82.5、57.8、41.3、33.0、8.3 μg/mL，甘草苷質量濃度梯度為2 904.0、1 452.0、726.0、435.6、290.4、145.2 μg/mL，甘草酸質量濃度梯度為7 880.0、1 576.0、788.0、472.8、315.2、157.6 μg/mL，6-姜酚質量濃度梯度為928.0、464.0、232.0、139.2、92.8、46.4 μg/mL。分別按“2.4”項下色譜條件下重復進樣3 次，測定峰面積，以對照品質量濃度為橫坐標（X），峰面積積分值為縱坐標（Y）進行線性回歸，得回歸方程：烏頭堿Y＝4 833 273X－4815，R2＝0.999 2，線性范圍4.3～173.0 μg/mL；新烏頭堿Y＝7 219 118X－22 610，R2＝0.999 4，線性范圍8.6～172.5 μg/mL；次烏頭堿Y＝10 886 051X－969 865，R2＝0.999 1，線性范圍20.2～303.0 μg/mL；BACY＝8 275 542X－32 905，R2＝0.999 1，線性范圍11.3～225.0 μg/mL；BMAY＝8 377 833X－27 689，R2＝1.000 0，線性范圍11.3～337.5 μg/mL；BHAY＝7 820 481X－32 430，R2＝0.999 2，線性范圍8.3～165.0 μg/mL；甘草苷Y＝15 955 936X＋24 414，R＝0.999 5，線性范圍145.2～2 904.0 μg/mL；甘草酸Y＝3 574 140X＋294 369，R2＝0.999 4，線性范圍157.6～7 880.0 μg/mL；6-姜酚Y＝6 217 676X－5000，R2＝1.000 0，線性范圍46.4～928.0 μg/mL；結果表明9 個對照品在各自范圍內線性關系良好。

2.5.5 加樣回收率試驗 取半份淡附片四逆湯處方飲片（附子7.5 g，炙甘草7.5 g，干姜5 g），加入各等量對照品粉末，按“2.2.2”項制備淡附片四逆湯加樣溶液，并按“2.3.1”項下制備淡附片四逆湯加樣供試品溶液，經(jīng)0.25 μm 微孔濾膜濾過。按“2.4”項下色譜條件進樣測定，計算得到烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿、BAC、BMA、BHA、甘草苷、甘草酸、6-姜酚的平均加樣回收率分別為100.18%、93.45%、101.29%、102.89%、101.40%、91.97%、102.80%、94.21%、103.06%，RSD 分別為1.69%、0.99%、1.08%、1.73%、1.11%、1.56%、1.28%、1.68%、1.87%，說明本方法具有良好的回收率。

2.6 含量測定結果

4 種附子炮制品單煎湯劑及四逆湯處方湯劑含量測定結果見表1。在附子單煎湯劑中雙酯型生物堿含量方面，烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿含量及其總量高低排序為生附片＞陰附片＞陽附片＞淡附片；單酯型生物堿含量方面，苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿含量及其總量高低為陰附片＞陽附片＞淡附片＞生附片。在四逆湯全方湯劑中雙酯型生物堿含量方面，烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿含量及其總量高低排序為生附片四逆湯＞陰附片四逆湯＞陽附片四逆湯＞淡附片四逆湯；單酯型生物堿含量方面，苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿含量及其總量高低為陰附片四逆湯＞陽附片四逆湯＞淡附片四逆湯＞生附片四逆湯。4 種附子炮制品單煎湯劑和四逆湯全方湯劑含量比較發(fā)現(xiàn)，四逆湯全方湯劑中3 種雙酯型生物堿含量要顯著性低于相應附子單煎湯劑，單酯型生物堿含量卻要顯著性高于相應附子單煎湯劑。

表1 不同附子炮制品四逆湯湯劑中含量測定結果Table 1 Results of content determination of components in different Aconite processed products Sini Decoction

2.7 化學計量學分析

2.7.1 系統(tǒng)聚類分析（hierarchical cluster analysis，HCA） 液相可以測定4 種附子炮制品四逆湯9 種化學成分含量，進行差異性分析，HCA 分別以雙酯型生物堿和單酯型生物堿為分類點，進行宏觀類別差異性分析，二者互相補充。

運用SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件進行HCA，其中樣本1～3 為生附片四逆湯3 次數(shù)據(jù)，4～6 為淡附片四逆湯3 次數(shù)據(jù)，7～9 為陰附片四逆湯3 次數(shù)據(jù)，10～12 為陽附片四逆湯3 次數(shù)據(jù)，共12 樣本量。分別以12 樣本量中雙酯型生物堿（烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿）和單酯型生物堿（苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿）峰面積為變量，采用組間聯(lián)接法及皮爾遜相關性作為分類依據(jù)，進行個案HCA[9]，結果分別見圖2、3。結果顯示，以雙酯型生物堿（烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿）進行分類時，12 個樣本中分為生附片四逆湯3個樣本可單為一類，淡附片四逆湯、陰附片四逆湯和陽附片四逆湯共9 個樣本可歸為同一類。以單酯型生物堿（苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿）進行分類，12 個樣本中生附片四逆湯3 個樣本可單為一類，淡附片四逆湯、陰附片四逆湯和陽附片四逆湯共9 個樣本可歸為同一類。表明無論是以雙酯型生物堿總量還是以單酯型生物堿總量進行分類分析時，生附片四逆湯與淡附片四逆湯、陰附片四逆湯、陽附片四逆湯三者成分差異較大，淡附片四逆湯、陰附片四逆湯、陽附片四逆湯成分含量差異相對較小。

圖2 4 種四逆湯以雙酯型生物為變量聚類分析樹狀圖Fig.2 Dendrogram of cluster analysis of four kinds of Sini Decoction with diester alkaloids as variable

圖3 4 種四逆湯以單酯型生物為變量聚類分析樹狀圖Fig.3 Dendrogram of cluster analysis of four kinds of Sini Decoction with monoester alkaloids as variables

2.7.2 主成分分析（pricipal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘-判別分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）為了印證HCA 的結果，進行PCA。將3 批4 種四逆湯湯劑中9 個指標成共有峰峰面積導入SIMCA 14.1 軟件，施行無監(jiān)督模式的PCA[10]，觀察樣品間自然聚集，結果見圖4。PCA 得分圖顯示，4 種四逆湯湯劑各自聚集，可分為生附片四逆湯、淡附片四逆湯、陰附片四逆湯和陽附片四逆湯4 類，其中生附片四逆湯與其他四逆湯相聚較遠，可自為一類，淡附片四逆湯、陰附片四逆湯與陽附片四逆湯的點較接近，可歸為一類。PCA 與HCA 結果一致。

圖4 不同附子炮制品四逆湯PCA 得分圖Fig.4 PCA scores of different Aconite processed products Sini Decoction

為了進一步印證PLS-DA 的結果。在PCA 的基礎上，將4 種四逆湯3 次數(shù)據(jù)結果中9 個指標成分共有峰峰面積導入SIMCA 14.1 軟件進行OPLSDA[10]，進一步分析4 種附子炮制品四逆湯的差異性，樣本得分矩陣見圖5。該模型解釋率參數(shù)RY2為0.969，預測能力參數(shù)Q2為0.959，表明建立的數(shù)學模型穩(wěn)定且預測能力較強。OPLS-DA 得分圖顯示，4 種四逆湯聚類效果較好，其中陰附片四逆湯和陽附片四逆湯相距較近，生附片四逆湯、淡附片四逆湯相聚較遠。與HCA 和PCA 距離為2 時結果一致，進一步印證HCA 和PCA 的結果。同時根據(jù)變量重要性投影（variable importance projection，VIP）值＞1 的原則，篩選差異組分，見圖6。結果顯示，共找到了4 個關鍵差異成分，VIP 值大小排序依次為8（甘草酸）、1（烏頭堿）、2（新烏頭原堿）、9（6-姜酚）號峰是引起不同附子炮制品四逆湯成分差異的主要標志性成分。

圖5 不同附子炮制品四逆湯OPLS-DA 得分圖Fig.5 OPLS-DA score chart of different Aconite processed products Sini Decoction

圖6 不同附子炮制品四逆湯OPLS-DA VIP 圖Fig.6 OPLS-DA VIP Chart of different Aconite processed products Sini Decoction

2.8 毒性實驗

2.8.1 小鼠急性毒性實驗 4 種附子單煎湯劑小鼠急性毒性預試驗顯示，小鼠給予4 種附子單煎生藥量梯度120、100、80、60、40 g/kg 后，發(fā)現(xiàn)僅有生附片單煎組中小鼠出現(xiàn)死亡，尤其是給藥量為120 g/kg 時小鼠100%死亡。其他單味附子炮制品未見小鼠死亡情況，未找到小鼠100%死亡劑量。故只進行生附片半數(shù)致死量（median lethal dose，LD50）實驗。取健康ICR 小鼠50 只，雌雄各半，根據(jù)體體質和性別隨機分為5 組，每組雌雄各5 只。實驗前小鼠禁食不禁水16 h，按體質量ig，各組小鼠分別給予劑量140.0、98.0、68.8、48.0、33.6 g/kg 生藥量生附片湯劑。連續(xù)觀察24 h，并記錄小鼠死亡數(shù)。給藥后小鼠自發(fā)活動減少，靜伏，少動，死亡之前抽搐。死亡時間主要集中在給藥后0.5～1 h 內，4 h 后動物再無死亡。

動物反應及死亡情況見表2，按Bliss 法計算生附片單煎湯劑LD50值為71.3 g/kg 生藥量，95%置信區(qū)間為60.0～84.6 g/kg 生藥量。

表2 生附片湯劑小鼠ig 動物反應及死亡情況Table 2 Animal response and death of UAP decoction rats by gavage

2.8.2 小鼠最大給藥量實驗 經(jīng)4 種四逆湯小鼠急性毒性預試驗結果顯示，小鼠給予4 種四逆湯生藥量梯度120、100、80、60、40 g/kg 后，發(fā)現(xiàn)4 種四逆湯小鼠在給藥體積最大量，給藥梯度達120 g/kg時，4 種四逆湯均無小鼠死亡情況發(fā)生，僅有生附片四逆湯組小鼠有輕微毒性反應，但均未找到4 種四逆湯給藥后小鼠100%死亡劑量，無法測出LD50。故改測4 種四逆湯小鼠1 d 最大給藥量實驗。

當小鼠給藥120 g/kg 時，四逆湯質量濃度為3.0 g/mL，四逆湯已接近浸膏狀態(tài)，難以再次濃縮，故以3.0 g/mL 作為最大質量濃度。

（1）動物分組及給藥：取健康ICR 小鼠50 只，雌雄各半，根據(jù)體質量和性別隨機分為空白組、生附片四逆湯組、淡附片四逆湯組、陰附片四逆湯組、陽附片四逆湯組，每組雌雄各5 只。取4 種四逆湯飲片制備四逆湯湯劑，并濃縮至3.0 g/mL。實驗前小鼠禁食不禁水16 h，按體質量ig，各組小鼠分別給予劑量120 g/kg 生藥量，空白組給予等體積生理鹽水。

（2）觀察及臟器指數(shù)：各組小鼠經(jīng)ig 后即刻觀察小鼠毒性反應情況，包括外觀體征、行為活動、精神狀態(tài)、食欲、大小便及顏色、被毛、膚色、呼吸，以及鼻、眼、口腔、生殖器等有無異常分泌物。并給藥當天記錄小鼠恢復自由活動、飲水、飲食時長。此后每天觀察1 次，每日稱定質量，記錄期間動物死亡情況，并進行尸體解剖，觀察心、肝、脾、肺、腎等重要臟器有無病變。實驗第14 天處死、解剖小鼠，觀察其心、肝、腎、肺及脾等臟器和組織的體積、顏色和質地等變化，肝臟和腎臟拍照稱定質量，計算臟器指數(shù)。

（3）最大給藥量測定：按公式計算該劑量下小鼠給藥相當于人臨床每日推薦用藥量的倍數(shù)。

小鼠的最大給藥量倍數(shù)＝每只小鼠最大給藥量×成人平均體質量/(小鼠平均體質量×成人每日用量)

（4）結果：給藥后14 d 內各組小鼠均無死亡現(xiàn)象，各組小鼠給藥過程具體體態(tài)情況見表3。第14天進行小鼠稱定質量，4 種附子炮制品四逆湯小鼠在給藥14 d后和空白組比較雌雄體質量增長均無顯著性差異。臟器指數(shù)結果顯示，第14 天處死、解剖小鼠，觀察其心、肝、腎、肺及脾等臟器，發(fā)現(xiàn)4 種附子炮制品四逆湯均不會引起小鼠肝臟、腎臟腫大以及病理學改變。經(jīng)計算，4 種四逆湯組小鼠給藥后雌雄肝臟、腎臟器指數(shù)和空白組比較均無顯著性差異，見表4，說明4 種附子炮制品四逆湯均系屬無毒。

表3 各組小鼠體態(tài)情況Table 3 Body posture of rats in each group

表4 各組雌雄小鼠體質量變化及臟器指數(shù)Table 4 Weight change and organ index of male and female rats in each group

四逆湯人1 d 用量36 g 生藥量，生附片四逆湯、淡附片四逆湯、陰附片四逆湯、陽附片四逆湯組小鼠最大給藥量分別為2.28、2.28、2.28、2.27 g 生藥量，平均體質量分別為19.0、19.0、19.0、18.9 g。生附片四逆湯、淡附片四逆湯、陰附片四逆湯、陽附片四逆湯小鼠最大給藥量倍數(shù)經(jīng)公式計算均相當于人臨床每日用藥量的200 倍。

2.8.3 大鼠長期毒性實驗 根據(jù)《中國藥典》2020年版規(guī)定四逆湯人口服量為30～60 mL/d，劑量范圍為342.9～685.7 mg/(kg·d)。以藥典人口服劑量中間值45 mL 為中劑量，3∶6∶12 設置低、中、高劑量，按等效體表面積折算大鼠給藥低、中、高劑量分別為1.586 5、 3.173 2、6.346 4 g/kg。經(jīng)預實驗發(fā)現(xiàn)大鼠給藥劑量為6.346 4 g/kg，大鼠體態(tài)恢復及心衰指標恢復效果最佳。故在后續(xù)試驗中以高劑量作為大鼠給藥劑量。

（1）造模：大鼠適應性喂養(yǎng)1 周。按課題組前期研究[6]造模，阿霉素用生理鹽水溶液稀釋，按體質量進行ip，大鼠給藥梯度劑量及頻率分別為1 mg/kg 第1 天，2 mg/kg 第4 天，3 mg/kg 第7 天，4 mg/kg 第11 天，3 mg/kg 第15 天，模型組注射阿霉素，空白組注射生理鹽水，每次造模后1 d 應用小動物專用彩色超聲影像系統(tǒng)檢測各組大鼠心功能。M-Mode 模式測量3 個心動周期的左室射血分數(shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF），取均值計算LVEF≤40%為模型成功。

（2）分組及給藥：將心衰模型成功的大鼠按體質量隨機分為模型組、 生附片四逆湯組（UAPSND）、淡附片四逆湯組（GCAPSND）、陰附片四逆湯組（DGSAPSND）、陽附片組四逆湯組（SFAPSND）、陽性藥組（卡托普利）。每組12 只，雌雄各半。各給藥組按體質量6.346 4 g/kg 給予相應湯劑，陽性藥組給予成人臨床等效劑量10 mg/kg卡托普利，空白組和模型組給予等體積生理鹽水。連續(xù)給藥2 周。

（3）生物樣本采集：最后1 次給藥結束后，禁食不禁水12 h，2%戊巴比妥鈉（3 mL/kg）ip 麻醉，腹主動脈取血，室溫靜置40 min，于3000 r/min 離心10 min 取上清液得血清樣本，并置于-80 ℃保存?zhèn)溆?。取血結束后取心臟、腎臟和肝臟，用生理鹽水沖洗表面并用濾紙吸干多余的水分，稱定質量后泡于10%多聚甲醛中，室溫保存。

（4）肝腎損傷生化指標測定：采用全自動生化儀測定血清中肝腎功能指標，包括總膽紅素、丙氨酸氨基轉移酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、尿素、肌酐。

（5）HE 染色觀察組織病理：肝腎組織經(jīng)10%多聚甲醛固定24 h，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片，二甲苯I和II脫蠟，梯度水化，蘇木素染色，蒸餾水沖洗，含1%鹽酸的70%乙醇水化，蒸餾水漂洗，70%和80%乙醇浸泡后，90%伊紅醇溶液染色，脫水，透明，中性樹膠封片，顯微攝影成像系統(tǒng)×200 下拍片，記錄結果。

（6）大鼠體質量變化：在造模及給藥過程中正常組小鼠體質量呈穩(wěn)步上升趨勢，而模型組大鼠在第3 次造模后體質量逐步下降，直至第3 天給藥后各給藥組大鼠體質量恢復，雄性大鼠升高趨勢更加明顯。其中淡附片四逆湯組大鼠體質量上升趨勢遠低于其他給藥組。各組大鼠造模及給藥過程體質量見表5、6。

表5 大鼠造模期間體質量變化Table 5 Changes in body weight of rats during modeling

表6 大鼠給藥期間體質量變化Table 6 Changes in body weight of male rats during administration

（7）臟器指數(shù)：與空白組比較，模型組肝、腎臟器指數(shù)顯著增加；與模型組相比，4 種四逆湯可顯著降低肝、腎臟器指數(shù)，其中雌性大鼠中以陰附片四逆湯作用效果最為顯著，雄性大鼠中以淡附片四逆湯和陽附片四逆湯作用效果更為顯著。各組雌雄大鼠臟器指數(shù)見表7。

表7 各組雌雄大鼠臟器指數(shù)Table 7 Organ index of male and female rats in each group

（8）大鼠血清肝、腎功能指標的影響：與空白組比較，模型組大鼠血清中總膽紅素、ALT、AST、尿素、肌酐指標有升高趨勢。與模型組相比，4 種四逆湯大鼠血清中總膽紅素、ALT、AST、尿素、肌酐有下降趨勢，總體與空白組相比沒有顯著性差異。見表8。

表8 各組雌雄大鼠血清肝腎功能指標含量Table 8 Indexes of liver and kidney function in serum of male and female rats in each group

（9）對大鼠肝、腎組織病理的影響：各組大鼠肝臟組織HE 染色并無明顯區(qū)別，見圖7。其中各組肝組織整體結構均基本正常，組織肝細胞結構飽滿，未見肝細胞明顯疏松水腫壞死等變性，肝細胞如黃色箭頭所示，組織中央靜脈清晰，肝竇沿著中央靜脈呈放射狀排列，紅色箭頭所示為肝竇巨噬細胞，組織未見明顯炎癥細胞浸潤。

圖7 各組雌雄大鼠肝臟HE 染色圖(♀雌性,♂雄性,×200)Fig.7 HE staining of liver of male and female rats in each group(♀female,♂male,× 200)

各組大鼠腎臟組織HE 染色并無明顯區(qū)別，見圖8。其中各組腎組織整體結構均基本正常，腎小球結構清晰未見明顯萎縮壞死等變性，黃色箭頭所示為腎小球，組織腎小管上皮細胞未見明顯水腫脫落壞死，腎小管未見明顯擴張管型等變性，紅色箭頭所示為腎小管，組織未見明顯炎癥細胞浸潤。

圖8 各組大鼠腎臟HE 染色圖(♀雌性,♂雄性,×200)Fig.8 HE staining of kidney of male and female rats in each group(♀female,♂male,× 200)

2.9 統(tǒng)計方法

采用SPSS 25.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析和系統(tǒng)聚類分析，實驗結果以±s表示，P＜0.05 表示有顯著性差異；采用SIMCA 14.1 軟件對數(shù)據(jù)進行PCA 和OPLS-DA。

3 討論

3.1 成分差異性分析

研究認為4 種附子炮制品四逆湯其化學成分差異性的原因主要與附子的炮制方法有關。一方面4種四逆湯在僅改變附子飲片種類的前提下，其湯劑中9 個指標成分含量高低順序與4 種附子炮制品單煎湯劑一致；另一方面，4 種附子炮制品由同一批鹽附子炮制而成，4 種附子因其炮制方法的不同而致使4 種附子炮制品單煎湯劑中9 個指標成分存在差異。

4 種附子炮制品均有浸漂流程，不同的是生附片僅浸漂流程，淡附片經(jīng)浸漂后有加甘草黑豆的煮制過程，陰附片有浸漂后加干姜的蒸制過程，陽附片則是浸漂后加砂的炒制過程。在本實驗中控制4種附子炮制品的浸漂時間一致，浸漂過程對附子中雙酯型生物堿影響程度相當。而淡附片、陰附片和陽附片的后續(xù)煮制、蒸制、炒制過程均可促使附子中雙酯型生物堿酯鍵水解斷裂使其含量下降[7,11-12]，故陰附片、陽附片、淡附片中的雙酯型生物堿均要顯著性低于生附片。

同時由于生附片僅有浸漂過程，對單酯型生物堿的生成影響較小，難以促使雙酯型生物堿轉化為單酯型生物堿，所以生附片中單酯型生物堿含量極低；陽附片的高溫炒制環(huán)境易使附子中的雙酯型生物堿轉化為中間產(chǎn)物焦烏頭堿類[12]，再進一步酯鍵斷裂轉化為單酯型生物堿量和胺醇型生物堿[13]，進而提高單酯型生物堿含量作用；陰附片的高溫蒸制環(huán)境在促進雙酯型生物堿水解為單酯型生物堿的同時，干姜中6-姜烯酚、6-姜酚等成分還具有增加單酯型生物堿溶出的作用[7]，進而提高單酯型生物堿含量作用；而淡附片在其炮制過程中輔料甘草中含有大量甘草酸、甘草次酸等酸性成分，營造一個酸性環(huán)境，使附子中6 種生物堿指標成分斷裂酯鍵，還通過生成絡合物或“酸堿中和成鹽”沉淀的形式降低附子生物堿含量作用[14]，同時高溫煮制環(huán)境也可促進雙酯型生物堿的水解轉化，在水解雙酯型生物堿的同時，單酯型生物堿也會被水解為毒性最低的胺醇型生物堿[15]，所以淡附片中雙酯型生物堿和單酯型生物堿均要低于其他炮制品。故在本研究單味附子煎劑比較部分，陰附片中單酯型生物堿苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿含量及其總量＞陽附片＞淡附片＞生附片。

當四種附子炮制品應用于四逆湯時，因4 種附子四逆湯僅改變附子種類，煎煮過程以及方劑處方對指標成分的影響程度一致，故4 種附子炮制品四逆湯湯劑中指標成分含量高低與4 種附子單味煎液中指標成分含量高低一致。表現(xiàn)為雙酯型生物堿含量在生附片四逆湯中最高，單酯型生物堿含量在陰附片四逆湯中最高。

3.2 分類差異性分析

4 種附子炮制品四逆湯在進行HCA、PCA 和PLS-DA 時，雖分析方法不同，但結果一致。無論是以雙酯型生物堿進行分類分析，還是以雙酯型生物堿進行分類分析，亦或者以全體指標成分含量進行分析，生附片四逆湯與其他3 種四逆湯差異較大，常單為一類；淡附片四逆湯、陰附片四逆湯、陽附片四逆湯差異較小，可歸為同一類。導致4 種四逆湯主要分為兩類的原因可能與4 種四逆湯9 個指標成分含量有關，尤其是雙酯型生物堿和單酯型生物堿。因生附片僅有浸漂流程，對雙酯型生物堿和單酯型生物堿影響相對較小，而淡附片、陰附片、陽附片在浸漂后還有后續(xù)加工炮制過程，對雙酯型生物堿和單酯型生物堿影響較大，故生附片單為一類。同時與生附片相比，淡附片、陰附片、陽附片此三種炮制品影響程度相差無幾，故在本研究中淡附片、陰附片、陽附片可歸為同一類。

同時研究發(fā)現(xiàn)甘草酸、烏頭堿、新烏頭原堿和6-姜酚是引起不同附子炮制品四逆湯成分差異的主要標志性成分。分析其原因主要為甘草酸在四逆湯中主要發(fā)揮解毒作用，常水解為2 分子葡萄糖醛酸與1 分子甘草次酸，營造一個酸性環(huán)境，可以和雙酯型生物堿過生成絡合物或“酸堿中和成鹽”沉淀的形式降低附子生物堿含量作用，降低其含量以達解毒作用[16]，同時甘草中甘草次酸具有腎上腺皮質激素樣作用，可降低機體對各種有毒物質的反應，提高機體對毒性物質的耐受力[17]，在體內也可發(fā)揮拮抗烏頭堿所致心律失常作用[18]，同時甘草次酸亦可減少由附子生物堿所致的氧自由基（reactive oxygen species，ROS）蓄積，增強機體清除自由基的能力，降低氧化損傷[19]，降低四逆湯中附子毒性作用，可作為四逆湯中解毒標志物；而烏頭堿、新烏頭堿為四逆湯中主要引起毒性反應的成分，通過抑制機體細胞色素P450 2J3（cytochrome P450 2J3，CYP2J3）的表達水平，使心肌細胞鈉鈣交換異常[20]，改變細胞中鈉、鉀、鈣離子濃度進而影響細胞內環(huán)境穩(wěn)態(tài)，脂質過氧化反應致細胞能量代謝障礙[21]，誘導心肌細胞凋亡[22]，從而致使機體出現(xiàn)中毒反應，甚至心律不齊導致死亡，其含量高低與四逆湯致死性息息相關，二者可作為四逆湯中毒性標志物；6-姜酚在四逆湯中主要發(fā)揮增效作用，通過提高四逆湯中主要功效成分單酯型生物堿的含量，與單味附子煎劑能顯著增加實驗心衰大鼠的心輸出量、增強心肌舒縮力、改善其血液動力學[23]，增強四逆湯中附子強心作用，其可作為四逆湯中增效標志物。

3.3 毒性差異性分析

在4 種附子炮制品小鼠急性毒性試驗中：生附片單味煎液LD50值為71.3 g/kg 生藥量，95%可信區(qū)間為60.0～84.6 g/kg 生藥量。其他3 種炮制品單味煎液未發(fā)現(xiàn)100%死亡率，無法計算LD50值。雙酯型生物堿為附子中主要毒性成分，單酯型生物堿為附子中主要功效成分[21]，當小鼠給予生附片LD50值時，雙酯型生物堿攝入含量為28.8 μg/mL。生附片單味煎液中毒性成分雙酯型生物堿含量為48.5 μg/mL，遠高于生附片LD50值，表現(xiàn)出生附片的毒性和致死性。而淡附片、陰附片、陽附片中雙酯型生物堿總量與生附片LD50雙酯型生物堿含量相近，小鼠理應有毒性反應和死亡現(xiàn)象，但在觀察中淡附片、陰附片、陽附片組小鼠僅有輕微毒性反應但卻無死亡現(xiàn)象，推斷其原因為淡附片、陰附片、陽附片中雙酯型生物堿含量雖和生附片LD50值雙酯型生物堿含量相近，但淡附片中中甘草酸、陰附片中6-姜酚等在體內也發(fā)揮著減毒作用，故淡附片、陰附片、陽附片組小鼠僅有輕微毒性反應，卻無致死性，很好的體現(xiàn)炮制減毒特性。

在4 種附子炮制品四逆湯最大給藥量試驗中：當4 種四逆湯給予最大給藥體積和最高濃度時，4種四逆湯均不會對小鼠產(chǎn)生致死性，有且僅有生附片四逆湯組小鼠產(chǎn)生輕微毒性反應。出現(xiàn)這一結果的原因可能是淡附片四逆湯、陰附片四逆湯和陽附片四逆湯中雙酯型生物堿總量均要低至 19.6 μg/mL，毒性成分含量很低，使得小鼠無毒性反應，更無致死性。而生附片四逆湯中毒性成分雙酯型生物堿總量為31.9 μg/mL，毒性成分含量相對較高，小鼠理應有毒性反應和死亡現(xiàn)象。但四逆湯是一種處方湯劑，湯劑中除含有毒性成分雙酯型生物堿外，還含有一些解毒成分，各成分之間相互影響，相互制約，可以制約降低生附片四逆湯的毒性，如6-姜酚可以減少附子次烏頭堿的吸收[24]，甘草次酸可以上調核因子E2 相關因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）和血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）信號通路抑制氧化應激、線粒體功能障礙和細胞凋亡[25]，上調細胞色素P450 酶3A（cytochrome P450 3A，CYP3A）的表達，促進烏頭類成分的代謝，降低腦利鈉肽（b-type natriuretic peptide，BNP）、血管緊張素II（angiotensin II，AngII）、醛固酮（aldosterone，ALD）的含量[26]，減少機體心臟毒性，使得生附片四逆湯僅表現(xiàn)出輕微毒性反應，沒有死亡現(xiàn)象發(fā)生。同時受試物濃度和體積限制，當小鼠給予相當于人臨床每日用藥量的200 倍四逆湯劑量時，小鼠仍均無明顯毒性反應和致死性。表明古籍和現(xiàn)代四逆湯處方中以生附片和淡附片入方具有合理性和可行性，同時也表明陰附片、陽附片入方四逆湯也具有合理性和可行性。

在4 種附子炮制品四逆湯長期毒性試驗中：4種四逆湯可恢復因造模而致體質量下降，與模型組相比，4 種四逆湯給藥組多可顯著降低肝腎臟器指數(shù)，其中雌性大鼠中以陰附片四逆湯作用效果最為顯著，雄性大鼠中以淡附片四逆湯和陽附片四逆湯作用效果更為顯著。同時與模型組和空白組相比，4 種四逆湯有降低肝腎功能指標總膽紅素、ALT、AST、尿素、肌酐含量趨勢，4 種四逆湯組大鼠HE染色肝組織整體結構均基本正常，組織肝細胞結構飽滿，未見肝細胞明顯疏松水腫壞死等變性，組織未見明顯炎癥細胞浸潤；腎組織整體結構均基本正常，腎小球結構清晰未見明顯萎縮壞死等變性，組織腎小管上皮細胞未見明顯水腫脫落壞死，腎小管未見明顯擴張管型等變性，組織未見明顯炎癥細胞浸潤。說明慢性心衰大鼠長期給藥4 種四逆湯后不會引起肝腎損傷，無肝腎毒性，甚至在臟器指數(shù)方面有一定的保肝護腎作用。

4 結論

毒性實驗是評價臨床用藥安全性的重要方法之一。歸納急性毒性試驗、最大給藥量試驗、長期肝腎毒性試驗結果，證實陰附片和陽附片入方四逆湯均系安全無毒，可行，可安全開展后續(xù)陰附片四逆湯和陽附片四逆湯對慢性心衰大鼠的藥效學研究。

含量測定是4 種附子炮制品四逆湯研究基礎，毒性實驗是評價臨床用藥安全性的重要方法。綜合分析4 種附子炮制品四逆湯成分差異性、分類差異性以及急性毒性試驗、最大給藥量試驗、長期肝腎毒性差異性，證明《傷寒論》中四逆湯原始方選擇生附片以及《中國藥典》四逆湯選擇淡附片入方四逆湯的合理可行性，證實在以建昌幫法陰附片、陽附片入方四逆湯亦具有合理可行性，甚至相比淡附片和生附片在降低毒性成分含量、增加功效成分含量上要更具優(yōu)勢，其中陰附片最佳，可安全開展后續(xù)陰附片四逆湯和陽附片四逆湯對慢性心衰大鼠的藥效學研究。因此下一階段將開展不同附子炮制品四逆湯的抗心衰藥效學研究，為陰附片、陽附片入方四逆湯用于慢性心衰治療提供一定的科學依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突