李 瑞，方忠瑩，楊梓依，方 磊*，周 潔,*

1.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355

2.濟(jì)南大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250022

山橙Melodinus suaveolensChamp.ex Benth.為夾竹桃科（Apocynaceae）山橙屬M(fèi)elodinusJ.R.et G.Forst 木質(zhì)藤本植物。山橙屬植物全世界約有53 種，主要分布于亞洲熱帶、亞熱帶地區(qū)及大西洋地區(qū)。我國有11 種，主產(chǎn)于廣西、云南、貴州以及臺灣等地區(qū)[1]。山橙屬植物在我國民間應(yīng)用歷史悠久，常用于治療小兒疝氣、小腹痛、睪丸炎、小兒腦膜炎、骨折和風(fēng)濕性心臟病等[2]。山橙屬植物中的化學(xué)成分豐富，包括生物堿、三萜、木脂素類等[3-6]。其中，生物堿類成分是該屬植物最重要的活性成分，其結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣，具有多樣的生物活性，如抗炎、抗腫瘤等[7-10]。目前，從山橙中分離得到40 余個生物堿，結(jié)構(gòu)類型包括單萜吲哚生物堿、單萜喹啉生物堿、雙吲哚生物堿等，其中單萜吲哚生物堿多具有顯著的抗腫瘤活性，具有較大的研究和開發(fā)價值[11-14]。本研究采用酸溶堿沉法富集山橙莖的乙醇提取物氯仿部位中的生物堿類成分，進(jìn)一步運(yùn)用正相硅膠柱色譜、半制備高效液相色譜等多種色譜方法從中分離得到12 個生物堿類成分，利用一維和二維核磁共振波譜、高分辨質(zhì)譜以及圓二色譜等技術(shù)分別鑒定為 melosuavine A（1）、柳葉水甘草堿（tabersonine ，2）、 3-羰基柳葉水甘草堿（3-oxotabersonine，3）、白堅木胺（quebrachamine，4）、Δ14-長春布寧（Δ14-vincamone，5）、Δ14-vincamenine（6）、3-羰基-11-甲氧基柳葉水甘草堿（3-oxo-11-methoxytabersonine，7）、alstoyunine G（8）、pachysiphine（9）、洛柯寧堿（lochnerinine，10）、土波臺文堿（tubotaiwine，11）、venalstonine（12）。結(jié)構(gòu)見圖1。其中，化合物1 為新化合物，命名為美樂蘇胺A?；衔?、11 和12 首次從該植物中分離得到。采用MTT 法評價了所得化合物的腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性，化合物2、8～10 顯示出不同程度的腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性，其中化合物10 活性最強(qiáng)。

圖1 化合物1～12 的結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of compounds 1—12

1 儀器與材料

Bruker Avance DRX600 型核磁共振波譜儀（瑞士Bruker 公司），Agilent 6250 Accurate-Mass Q-TOF高分辨質(zhì)譜儀（美國 Agilent 公司），Agilent 1260-6460 Triple Quad 液質(zhì)聯(lián)用儀（美國Agilent 公司），Chirascan 圓二色譜儀（英國 Applied Photophysics 公司），Agilent 1260 型高效液相色譜儀（美國Agilent 公司），TBE-300C 高速逆流色譜儀（上海同田生物技術(shù)有限公司），EYELA R-100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（日本EYELA 公司），YMC-Pack ODS-A 型半制備色譜柱（250 mm×10 mm，5 μm，日本YMC 公司），正相柱色譜硅膠（200～300 目，青島海洋化工廠），多功能酶標(biāo)儀（美國賽默飛公司），BP221S 型電子分析天平（北京賽多利斯天平有限公司），Milli-Q 純水儀（美國Millipore 公司），所用試劑為分析純（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）或色譜純（瑞典Oceanpak 公司）。DMEM 培養(yǎng)基、1640 培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶溶液均購自美國Gibco公司，MTT 購自Solabio 公司，順鉑（Pt 65%，上海麥克林生化科技股份有限公司）。人肺癌A549 細(xì)胞、人肝癌HepG2 細(xì)胞和人前列腺癌PC-3 細(xì)胞購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

山橙釆自云南普洱，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)李佳教授鑒定為夾竹桃科植物山橙M.SuaveolensChamp.ex Benth.的枝葉，樣品標(biāo)本（201512TM03）保存于濟(jì)南大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院標(biāo)本室。

2 提取與分離

山橙藥材（16.8 kg）粉碎后，用8 倍體積95%乙醇滲漉提取3 次，合并濾液，減壓濃縮得到乙醇浸膏。將乙醇浸膏加水分散，用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH 為1～2，用醋酸乙酯萃取3 次，合并有機(jī)相，減壓濃縮得到非生物堿相。水相用氨水調(diào)節(jié)pH 為9～10，用氯仿萃取5 次，合并氯仿相，減壓濃縮得到氯仿相即總生物堿相（149 g）。然后將總生物堿相進(jìn)行硅膠柱色譜分離，以二氯甲烷-甲醇（200∶1～5∶1）為流動相梯度洗脫，經(jīng)TLC 分析后合并為6 個部位（Fr.1～6）。

Fr.3 利用高速逆流色譜分離，以石油醚-醋酸乙酯-甲醇-水為溶劑體系，經(jīng)HPLC 分析合并得到6個組分Fr.3.1～3.6。Fr.3.1 經(jīng)半制備HPLC（甲醇-水85∶15）分離得到化合物2（12.0 mg，tR＝20 min）；Fr.3.2 利用Sephadex LH-20（甲醇）進(jìn)行分離，進(jìn)一步通過半制備HPLC（甲醇-水65∶35）得到化合物3（5.2 mg，tR＝22 min）、7（10.4 mg，tR＝25 min）和8（2.6 mg，tR＝30 min）；Fr.3.3 經(jīng)硅膠柱色譜（石油醚-醋酸乙酯30∶1～1∶1）進(jìn)行分離，進(jìn)一步通過半制備HPLC（甲醇-水83∶17）得到化合物9（2.5 mg，tR＝20 min）和10（12.1 mg，tR＝25 min）；Fr.3.4 利用硅膠柱色譜（石油醚-醋酸乙酯30∶1～1∶1）進(jìn)行分離，進(jìn)一步通過半制備HPLC（甲醇-水80∶20）得到化合物11（4.0 mg，tR＝20 min）和12（1.1 mg，tR＝25 min）；Fr.3.5 利用Sephadex LH-20（甲醇）分離后，通過半制備HPLC（甲醇-水90∶10）分離純化到化合物4（2.0 mg，tR＝16 min）。

Fr.4 以石油醚-醋酸乙酯-甲醇-水為溶劑體系，使用高速逆流色譜進(jìn)行分離，經(jīng)HPLC 分析合并得到6 個組分Fr.4.1～4.6。Fr.4.2 經(jīng)硅膠柱色譜（石油醚-醋酸乙酯30∶1）、Sephadex LH-20（甲醇）分離后，進(jìn)一步通過半制備HPLC（甲醇-水65∶35）純化得到化合物1（2.0 mg，tR＝20 min）。

Fr.5 利用石油醚-醋酸乙酯-甲醇-水為溶劑體系，通過高速逆流色譜分離得到6 個組分Fr.5.1～5.6。Fr.5.2 進(jìn)一步通過硅膠柱色譜（石油醚-醋酸乙酯20∶1）、Sephadex LH-20（甲醇）分離后，然后利用半制備HPLC（甲醇-水80∶20）純化得到化合物6（1.7 mg，tR＝35 min）；Fr.5.3 經(jīng)Sephadex LH-20（甲醇）、半制備HPLC（甲醇-水75∶35）分離純化到化合物5（1.0 mg，tR＝23 min）。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：白色粉末（甲醇）；HR-ESI-MS 顯示準(zhǔn)分子離子峰[M＋H]+m/z365.1497（計算值365.149 6），結(jié)合1H-NMR 和13C-NMR 數(shù)據(jù)，確定其分子式為C21H20N2O4，不飽和度為13。1H-NMR譜（表1）可以明顯看出一組1,2-二取代苯環(huán)信號δH6.72(1H,d,J= 7.8 Hz,H-12),7.14(1H,t,J= 7.8 Hz,H-11),7.24(1H,d,J= 7.8 Hz,H-9),7.25(1H,t,J= 7.8 Hz,H-10)；2 組烯烴信號δH5.65(1H,dt,J=10.0,2.0 Hz,H-14),5.69(1H,d,J= 10.0 Hz,H-15)和δH5.00(1H,d,J= 10.9 Hz,H-18a),4.94(1H,d,J= 17.6 Hz,H-18b),5.72(1H,dd,J= 17.6,10.9 Hz,H-19)；1 組連氮亞甲基信號δH4.50(1H,dd,J= 18.0,4.5 Hz,H-3a),3.39(1H,dd,J= 18.0,2.0 Hz,H-3b)；2組脂肪族亞甲基信號δH3.08(1H,d,J= 18.6 Hz,H-6a),2.62(1H,d,J= 18.6 Hz,H-6b)和3.00(1H,d,J= 13.9 Hz,H-17a),2.50(1H,d,J= 13.9 Hz,H-17b)，1 個連氮次甲基信號δH3.92(1H,s,H-21)，1 個甲氧基信號δH3.65(3H,s,OCH3)。13C-NMR 數(shù)據(jù)（表1）中，除了與上述基團(tuán)對應(yīng)的碳信號外，還顯示2 個芳香族季碳信號δC126.6(C-8),134.3(C-13)，3 個脂肪族季碳信號δC53.4(C-7),63.9(C-16),47.9(C-20)以及3 個羰基碳信號δC166.8(C-2),170.6(C-5),169.5(CO2CH3)，見圖1。

表1 化合物1 的1H-和13C-NMR 數(shù)據(jù)(600/150 MHz,CDCl3)Table 1 1H-and 13C-NMR data of compound 1(600/150 MHz,CDCl3)

1H-1H COSY 譜顯示化合物1 中存在3 個自旋偶合系統(tǒng)H-9/H-10/H-11/H-12、H-3/H-14/H-15 和H-18/H-19，結(jié)合HMBC 譜中顯示的遠(yuǎn)程相關(guān)信號：H-3/C-5,C-21、H-6/C-7,C-8、H-9/C-8,C-7、H-12/C-13、H-15/C-20,C-21、H-17/C-2,C-16、H-19/C-17,C-20 和H-21/C-7,C-16，可推斷出1 與已知化合物scandine 具有相同的結(jié)構(gòu)骨架[15]。進(jìn)一步通過HMBC 遠(yuǎn)程關(guān)信號H-3,H-6/C-5 和高分辨質(zhì)譜推斷出，1 與scandine 相比，5 位亞甲基碳變?yōu)轸驶?，由此確定了化合物1 的平面結(jié)構(gòu)。在ROESY譜中，通過H-9/H-21、H-6/H-OCH3以及H-21/H-19的相關(guān)信號，表明H-6/H-OCH3、H-21/H-19 位于同側(cè)，與scandine 型生物堿的相對構(gòu)型一致[16]。以上2D-NMR 譜中主要相關(guān)信號見圖2。

圖2 化合物的關(guān)鍵和相關(guān)信號Fig.2 Key and ROESYcorrelations of compound 1

化合物1 的絕對構(gòu)型是通過通過計算ECD 和實(shí)驗(yàn)ECD 比較來確定的?；衔? 可能存在1a 和1b 兩種絕對構(gòu)型，通過比較其ECD 實(shí)驗(yàn)譜圖與計算ECD 的數(shù)據(jù)確定1 的絕對構(gòu)型（圖3）。實(shí)驗(yàn)表明，化合物1 的實(shí)驗(yàn)ECD 譜（MeOH）在207 nm（Δε ＋37.5）和257 nm（Δε ＋7.3）處有正性Cotton效應(yīng)，與1a 的計算ECD 的譜圖（MeOH）基本吻合，從而確定了 1 的絕對構(gòu)型與 1a 一致，為7S,16R,20R,21S，命名為美樂蘇胺A（melosuavine A）。

圖3 化合物1 的2 種可能絕對構(gòu)型及其實(shí)驗(yàn)和計算ECD 譜Fig.3 Two possible absolute configurations and experimental and calculated ECD spectra of compound 1

化合物2：白色粉末；ESI-MSm/z337.1 [M＋H]+。1H-NMR(600 MHz,CDCl3)δ:8.99(1H,s,NH),7.23(1H,d,J= 7.6 Hz,H-9),7.14(1H,t,J= 7.6 Hz,H-10),6.82(1H,d,J= 7.6 Hz,H-12),6.87(1H,t,J= 7.6 Hz,H-11),5.79(1H,m,H-14),5.71(1H,m,H-15),3.77(3H,s,OCH3),3.46(1H,m,H-3a),3.19(1H,d,J= 15.0 Hz,H-17a),3.05(1H,m,H-3b),2.71(1H,m,H-5a),2.68(1H,s,H-21),2.55(1H,d,J= 15.0 Hz,H-17b),2.44(1H,m,H-6a),2.07(1H,m,H-5b),1.80(1H,m,H-6b),0.99(1H,m,H-19a),0.86(1H,m,H-19b),0.64(3H,t,J= 7.5 Hz,H-18)；13C-NMR(150 MHz,CDCl3)δ:167.0(C-2),51.1(C-3),50.7(C-5),44.7(C-6),55.3(C-7),138.2(C-8),121.6(C-9),120.7(C-10),127.8(C-11),109.4(C-12),43.3(C-13),125.0(C-14),133.3(C-15),92.3(C-16),27.1(C-17),7.6(C-18),28.6(C-19),41.5(C-20),70.2(C-21),51.1(COOCH3),169.2(COOCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道基本一致[17]，故鑒定化合物2 為柳葉水甘草堿。

化合物3：無色油狀物；ESI-MSm/z373.1 [M＋Na]+。1H-NMR(600 MHz,CDCl3)δ:9.04(1H,s,NH),7.23(1H,t,J= 7.2 Hz,H-11),7.23(1H,d,J=7.2 Hz,H-9),6.95(1H,t,J= 7.2 Hz,H-10),6.89(1H,d,J= 7.2 Hz,H-12),6.45(1H,d,J= 10.0 Hz,H-15),5.96(1H,d,J= 10.0 Hz,H-14),4.31(1H,m,H-5a),3.98(1H,s,H-21),3.79(3H,s,OCH3),3.38(1H,m,H-5b),2.62(1H,d,J= 15.5 Hz,H-17a),2.07(1H,d,J= 15.5 Hz,H-17b),1.95(1H,m,H-6a),1.89(1H,m,H-6b),1.09(1H,m,H-19a),1.00(1H,m,H-19b),0.72(3H,t,J= 7.4 Hz,H-18)；13C-NMR(150 MHz,CDCl3)δ:165.5(C-2),161.6(C-3),43.5(C-5),43.5(C-6),56.8(C-7),135.7(C-8),128.8(C-9),121.4(C-10),121.6(C-11),110.0(C-12),143.0(C-13),123.0(C-14),145.3(C-15),90.3(C-16),26.1(C-17),7.5(C-18),27.3(C-19),40.6(C-20),66.7(C-21),51.4(COOCH3),168.5(COOCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道基本一致[18]，故鑒定化合物3 為3-羰基柳葉水甘草堿。

化合物4：淡黃色粉末；ESI-MSm/z305.1 [M＋Na]+，分子式為C19H26N2。1H-NMR(600 MHz,CDCl3)δ:7.70(1H,s,NH),7.48(1H,d,J= 7.3 Hz,H-9),7.29(1H,d,J= 7.3 Hz,H-12),7.07(1H,m,H-10),7.07(1H,m,H-11),3.25(1H,m,H-3a),2.94(1H,m,H-6a),2.84(1H,m,H-6b),2.74(1H,m,H-16a),2.68(1H,m,H-16b),2.45(1H,s,H-21a),2.44(1H,m,H-5a),2.33(1H,m,H-5b),2.25(1H,s,H-21b),1.92(1H,m,H-17a),1.61(1H,m,H-17b),1.59(1H,m,H-15a),1.50(1H,m,H-3b),1.30(1H,m,H-14a),1.23(1H,m,H-15b),1.22(1H,m,H-19a),1.15(1H,m,H-19b),1.12(1H,m,H-14b),0.85(3H,t,J= 7.6 Hz,H-18)；13C-NMR(150 MHz,CDCl3)δ:140.0(C-2),56.8(C-3),53.4(C-5),22.1(C-6),108.8(C-7),129.1(C-8),117.5(C-9),118.8(C-10),120.3(C-11),110.1(C-12),134.9(C-13),34.9(C-14),22.9(C-15),22.6(C-16),33.6(C-17),8.0(C-18),32.2(C-19),37.3(C-20),55.2(C-21)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道基本一致[19]，故鑒定化合物4 為白堅木胺。

化合物5：淡黃色粉末；ESI-MSm/z293.5[M＋H]+。1H-NMR(600 MHz,CD3OD)δ:8.20(1H,m,H-12),7.44(1H,m,H-9),7.25(1H,m,H-10),7.26(1H,m,H-11),5.61(1H,m,H-14),5.55(1H,d,J=10.5 Hz,H-15),4.23(1H,s,H-21),3.51(1H,m,H-3a),3.43(1H,m,H-5a),3.36(1H,m,H-5b),3.13(1H,m,H-3b),3.07(1H,m,H-6a),2.96(1H,d,J=16.5 Hz,H-17a),2.68(1H,d,J= 16.5 Hz H-17b),2.56(1H,m,H-6b),1.98(1H,m,H-19a),1.74(1H,m,H-19b),1.03(3H,t,J= 7.6 Hz,H-18)；13C-NMR(150 MHz,CD3OD)δ:134.2(C-2),44.7(C-3),50.2(C-5),17.1(C-6),133.9(C-7),131.5(C-8),119.2(C-9),125.3(C-10),125.0(C-11),116.8(C-12),135.5(C-13),127.7(C-14),128.6(C-15),169.1(C-16),43.8(C-17),8.6(C-18),34.6(C-19),42.2(C-20),57.2(C-21)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道基本一致[20]，故鑒定化合物5 為Δ14-長春布寧。

化合物6：淡黃色粉末；ESI-MSm/z277.5[M＋H]+。1H-NMR(600 MHz,CDCl3)δ:7.45(1H,d,J=8.0 Hz,H-9),7.32(1H,d,J= 8.0 Hz,H-12),7.17(1H,t,J= 8.0 Hz,H-10),7.09(1H,t,J= 8.0 Hz,H-11),6.95(1H,d,J= 7.9 Hz,H-16),5.52(1H,m,H-15),5.35(1H,m,H-14),4.97(1H,d,J= 7.9 Hz,H-17),4.38(1H,s,H-21),3.49(1H,m,H-3a),3.37(1H,m,H-3b),3.10(1H,m,H-5a),2.66(1H,m,H-6a),2.55(1H,m,H-5b),2.18(1H,m,H-6b),1.76(1H,m,H-19a),1.75(1H,m,H-19b),1.04(3H,t,J= 7.6 Hz,H-18)；13C-NMR(150 MHz,CDCl3)δ:133.8(C-2),43.6(C-3),50.6(C-5),16.8(C-6),113.4(C-7),129.2(C-8),108.8(C-9),113.2(C-10),121.9(C-11),107.4(C-12),133.7(C-13),122.8(C-14),127.6(C-15),118.6(C-16),120.1(C-17),9.3(C-18),33.6(C-19),39.0(C-20),64.6(C-21)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道基本一致[21]，故鑒定化合物6 為Δ14-vincamenine。

化合物7：白色粉末；ESI-MSm/z403.1 [M＋Na]+。1H-NMR(600 MHz,CDCl3)δ:9.00(1H,s,NH),7.11(1H,d,J= 8.0 Hz,H-14),6.46(1H,dd,J=7.8,2.0 Hz,H-10),6.45(1H,d,J= 7.8 Hz,H-9),6.43(1H,brs,H-12),6.00(1H,d,J= 10.0 Hz,H-15),4.30(1H,m,H-5a),3.93(1H,s,H-21),3.80(3H,s,COOCH3),3.78(3H,s,OCH3),3.35(1H,m,H-5b),2.60(1H,d,J= 15.5 Hz,H-17a),2.05(1H,d,J= 15.5 Hz,H-17b),1.93(1H,m,H-6a),1.86(1H,m,H-6b),1.09(1H,m,H-19a),1.01(1H,m,H-19b),0.72(3H,t,J= 7.4 Hz,H-18)；13C-NMR(150 MHz,CDCl3)δ:166.0(C-2),161.6(C-3),43.6(C-5),43.4(C-6),56.2(C-7),128.1(C-8),123.0(C-9),105.7(C-10),160.8(C-11),97.3(C-12),144.3(C-13),123.0(C-14),145.3(C-15),90.6(C-16),26.0(C-17),7.5(C-18),27.3(C-19),40.7(C-20),66.8(C-21),55.7(OCH3),51.5(COOCH3),168.5(COOCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道基本一致[22]，故鑒定化合物7 為3-羰基-11-甲氧基柳葉水甘草堿。

化合物8：淡黃色粉末；ESI-MSm/z419.1 [M＋Na]+。1H-NMR(600 MHz,CDCl3)δ:8.95(1H,s,NH),7.10(1H,d,J= 8.0 Hz,H-9),6.48(1H,d,J=2.1 Hz,H-12),6.43(1H,dd,J= 8.0,2.1 Hz,H-10),4.43(1H,m,H-5a),3.81(3H,s,COOCH3),3.79(3H,s,OCH3),3.62(1H,s,H-21),3.61(1H,d,J= 3.8 Hz,H-14),3.47(1H,d,J= 3.8 Hz,H-15),3.20(1H,m,H-5b),2.66(1H,d,J= 16.0 Hz,H-17a),1.85(1H,d,J= 16.0 Hz,H-17b),1.73(1H,m,H-6a),1.68(1H,m,H-6b),1.28(1H,m,H-19a),1.09(1H,m,H-19b),0.78(3H,t,J= 7.2 Hz,H-18)；13C-NMR(150 MHz,CDCl3)δ:166.3(C-2),164.8(C-3),43.4(C-5),41.9(C-6),56.7(C-7),127.5(C-8),121.8(C-9),105.5(C-10),160.7(C-11),97.2(C-12),143.9(C-13),51.1(C-14),57.1(C-15),88.9(C-16),22.2(C-17),7.2(C-18),26.2(C-19),40.6(C-20),63.3(C-21),55.5(11-OCH3),51.2(COOCH3),168.2(COOCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道基本一致[23]，故鑒定化合物8 為alstoyunine G。

化合物9：淡黃色粉末；ESI-MSm/z353.1 [M＋H]+。1H-NMR(600 MHz,CDCl3)δ:8.93(1H,s,NH),7.14(1H,t,J= 7.6 Hz,H-10),7.14(1H,t,J= 7.6 Hz,H-11),6.86(1H,d,J= 7.6 Hz,H-9),6.81(1H,d,J=7.6 Hz,H-12),3.79(3H,s,COOCH3),3.75(1H,m,H-5a),3.56(1H,m,H-3a),3.51(1H,m,H-14),3.49(1H,m,H-5b),3.48(1H,m,H-15),3.11(1H,s,H-21),2.88(1H,m,H-17a),2.85(1H,m,H-3b),2.48(1H,m,H-17b),1.94(1H,m,H-6a),1.71(1H,m,H-6b),1.13(1H,m,H-19a),0.89(1H,m,H-19b),0.74(3H,t,J=7.5 Hz,H-18)；13C-NMR(150 MHz,CDCl3)δ:167.8(C-2),50.3(C-3),51.2(C-5),44.9(C-6),54.1(C-7),137.6(C-8),121.6(C-9),120.8(C-10),127.9(C-11),109.6(C-12),143.1(C-13),50.8(C-14),50.3(C-15),90.8(C-16),23.4(C-17),7.4(C-18),24.5(C-19),41.2(C-20),67.7(C-21),51.3(COOCH3),169.0(COOCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道基本一致[24]，故鑒定化合物9 為pachysiphine。

化合物10：白色粉末；ESI-MSm/z383.0 [M＋H]+。1H-NMR(600 MHz,CDCl3)δ:8.90(1H,s,NH),7.01(1H,d,J= 8.1 Hz,H-12),6.40(1H,d,J= 2.2 Hz,H-9),6.38(1H,dd,J= 8.1,2.2 Hz,H-10),3.79(3H,s,OCH3),3.77(3H,s,COOCH3),3.50(1H,m,H-3a),3.49(1H,m,H-14),3.48(1H,m,H-15),3.11(1H,m,H-3b),2.87(1H,m,H-5a),2.86(1H,m,H-17a),2.85(1H,s,H-21),2.57(1H,m,H-5b),2.45(1H,m,H-6a),2.44(1H,m,H-17b),1.92(1H,m,H-6b),1.14(1H,m,H-19a),0.75(1H,m,H-19b),0.74(3H,t,J= 7.5 Hz,H-18)；13C-NMR(150 MHz,CDCl3)δ:168.3(C-2),50.8(C-3),51.3(C-5),44.9(C-6),54.1(C-7),130.1(C-8),121.9(C-9),105.1(C-10),160.2(C-11),97.0(C-12),144.3(C-13),54.4(C-14),57.4(C-15),91.0(C-16),23.3(C-17),7.4(C-18),24.5(C-19),41.2(C-20),67.8(C-21),57.4(OCH3),50.8(COOCH3),169.0(COOCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道基本一致[25]，故鑒定化合物10 為洛柯寧堿。

化合物11：白色粉末；ESI-MSm/z325.2 [M＋H]+。1H-NMR(600 MHz,CDCl3)δ:8.85(1H,s,NH),7.13(1H,d,J= 7.3 Hz,H-9),7.09(1H,m,H-11),6.87(1H,t,J= 7.3 Hz,H-10),6.79(1H,d,J= 7.7 Hz,H-12),3.79(1H,m,H-21),3.76(3H,s,COOCH3),3.03(1H,m,H-17),3.01(1H,m,H-5a),2.94(1H,m,H-6a),2.89(1H.m.H-3a),2.83(1H,m,H-5b),2.44(1H,m,H-3b),1.96(1H,m,H-20),1.79(1H,m,H-6b),1.78(1H,m,H-14a),1.77(1H,m,H-14b),0.81(2H,m,H-19),0.69(3H,t,J= 7.3 Hz,H-18)；13C-NMR(150 MHz,CDCl3)δ:170.9(C-2),45.4(C-3),54.2(C-5),44.2(C-6),55.3(C-7),137.4(C-8),119.7(C-9),121.1(C-10),127.3(C-11),109.8(C-12),143.8(C-13),28.7(C-14),95.8(C-16),31.1(C-17),11.7(C-18),24.1(C-19),41.4(C-20),65.8(C-21),51.3(COOCH3),169.1(COOCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道基本一致[26]，故鑒定化合物11 為土波臺文堿。

化合物12：白色粉末；ESI-MSm/z337.2[M＋H]+。1H-NMR(600 MHz,CDCl3)δ:7.08(1H,d,J=7.8 Hz,H-12),7.02(1H,t,J= 7.8 Hz,H-10),6.75(1H,t,J= 7.8 Hz,H-11),6.70(1H,d,J= 7.8 Hz,H-9),5.72(1H,m,H-14),5.70(1H,m,H-15),3.74(3H,s,COOCH3),3.46(2H,m,H-3),3.09(1H,m,H-5a),2.89(1H,m,H-5b),2.88(1H,m,H-16),2.71(1H,s,H-21),2.68(1H,m,H-17a),2.57(1H,m,H-6a),1.90(1H,m,H-18a),1.66(1H,m,H-17b),1.35(1H,m,H-6b),1.33(1H,m,H-19a),1.25(1H,m,H-19b),1.23(1H,m,H-18b)；13C-NMR(150 MHz,CDCl3)δ:66.7(C-2),49.3(C-3),50.1(C-5),36.5(C-6),56.3(C-7),149.3(C-8),111.2(C-9),126.8(C-10),119.4(C-11),121.4(C-12),139.9(C-13),127.1(C-14),132.8(C-15),43.6(C-16),31.7(C-17),34.3(C-18),29.7(C-19),35.3(C-20),67.0(C-21),51.9(COOCH3),174.1(COOCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道基本一致[27]，故鑒定化合物12 為venalstonine。

4 細(xì)胞毒活性

采用MTT 法[10]評價了化合物1～12 對3 種人源型腫瘤細(xì)胞（A549、HepG2 和PC-3）的體外細(xì)胞增殖抑制活性，以順鉑為陽性對照。結(jié)果表明，化合物1、3～7、11 和12 均無活性；化合物2、8～10 顯示出不同程度的腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性（表2）；化合物10 對A549、HepG2 和PC-3 腫瘤細(xì)胞具有顯著的增殖抑制活性，半數(shù)抑制濃度（median inhibition concentration，IC50）分別為7.11、0.84、3.78 μmol/L。

表2 抗腫瘤活性評價(±s,n=3)Table 2 Anti-tumor screening results(±s,n=3)

表2 抗腫瘤活性評價(±s,n=3)Table 2 Anti-tumor screening results(±s,n=3)

化合物 IC50/(μmol·L-1)A549 HepG2 PC-3 2 60.80±3.68 26.74±3.68 25.07±2.71 8 28.94±3.47 1.18±0.34 2.44±1.72 9 40.67±10.14 9.45±2.96 19.42±3.85 10 7.11±0.99 0.84±0.80 3.78±1.83順鉑 57.26±3.34 14.35±0.85 40.75±9.58

5 討論

本研究運(yùn)用多種色譜手段，從山橙屬植物山橙莖的乙醇提取物氯仿部位中分離得到12 個生物堿類成分，其中化合物1 為新化合物，化合物4、11和12 首次從該植物中分離得到，并對以上化合物進(jìn)行了細(xì)胞毒活性測試。化合物2、8～10 顯示出不同程度的腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性，又以化合物10抗腫瘤活性最強(qiáng)，推測14、15 位的環(huán)氧結(jié)構(gòu)、11位的甲氧基和20 位的乙基是這類生物堿具備顯著活性的必要條件，上述推測需獲得更多該類成分進(jìn)行驗(yàn)證。綜上，本研究進(jìn)一步豐富了山橙屬植物生物堿類化學(xué)成分，也為此類成分進(jìn)一步的抗腫瘤作用研究提供了參考和依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突