李 敏，黃 滿，邱煒玥，李煥梅，賈子民，龍 同，趙錦芳

（1.湖北工業(yè)大學(xué) 生物工程與食品學(xué)院發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實驗室，湖北武漢 430068；2.湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心，湖北 武漢 430064）

芽孢桿菌（Bacillussp.）是重要的資源微生物，具有繁殖速度快，營養(yǎng)要求簡單，抗逆性強(qiáng)，對人畜安全無害等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于生物防控[1]、飼料加工[2]、水產(chǎn)養(yǎng)殖等領(lǐng)域[3]。目前，國內(nèi)外已經(jīng)開發(fā)出許多芽孢桿菌生防產(chǎn)品，其主要通過拮抗作用抑制植物病原菌的生長繁殖，可分泌多種活性物質(zhì)，如抗菌肽[4]、酶類和抗生素（細(xì)菌素、伊枯草菌素等脂肽類化合物和聚酮類化合物）[5-7]。

2019年VILLALOBOS S D等[8]從墨西哥雅基山谷分離得到一株小麥內(nèi)生芽孢桿菌，通過全基因組測序分析，結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定、生理生化試驗，發(fā)現(xiàn)其為一種新型芽孢桿菌，命名為卡氏芽孢桿菌（Bacillus cabrialesii）TE3T。2021年該團(tuán)隊進(jìn)一步研究證實B.cabrialesiiTE3T的無細(xì)胞濾液（cell-free culture filtrate，CF）對小麥離蠕孢菌（Bipolaris sorokiniana）有顯著抑制活性，半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）為（0.1±0.01）%，最低抑菌濃度（minimum inhibitoryconcentration，MIC）為1%[9]。B.cabrialesiiTE3T的生長動力學(xué)表明，其活性代謝物質(zhì)主要在對數(shù)生長后期開始產(chǎn)生，在穩(wěn)定期達(dá)到最大值，且活性物質(zhì)穩(wěn)定性強(qiáng)，可以耐受高溫和蛋白酶K的降解，可作為生物防治和植物生長促進(jìn)劑。2021年，ZHOU L等[10]從番茄根際土壤中分離得到一株卡氏芽孢桿菌（B.cabrialesii）BH5，通過研究發(fā)現(xiàn)，其能夠抑制番茄灰霉的病原菌葡萄孢菌（Botrytis cinerea）的生長，通過高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜（high performance liquid chromatography-electrospray ionizationtandem mass spectrometry，HPLC-ESI-MS/MS）鑒定，得到一種環(huán)脂肽化合物為豐霉素H，進(jìn)一步試驗證實該化合物可引發(fā)菌絲細(xì)胞膜的缺陷。

本研究團(tuán)隊前期從湖北省恩施州鶴峰縣森林植物根際土壤樣品中分離得到一株卡氏芽孢桿（Bacillus cabrialesii）ST-1，通過研究發(fā)現(xiàn)其對植物病原真菌具有廣譜抑菌活性，對香梨腐爛病、梨輪紋病及甘薯病害均具有顯著防效，極具進(jìn)一步研究開發(fā)潛力。為了篩選到低成本、易獲得的培養(yǎng)基配方，獲得高濃度的卡氏芽孢桿菌芽孢數(shù)，本研究以芽孢數(shù)為響應(yīng)值，采用單因素試驗及響應(yīng)面試驗對Bacillus cabrialesiiST-1的培養(yǎng)基配方進(jìn)行優(yōu)化，得出其最優(yōu)培養(yǎng)基配方，以期為該菌株規(guī)?；a(chǎn)及工業(yè)化應(yīng)用提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

卡氏芽孢桿菌（Bacillus cabrialesii）ST-1：分離自湖北省恩施州鶴峰縣森林植物根際土壤樣品，保藏于湖北工業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實驗室。GenBank登錄號為ON631788.1。

1.1.2 試劑

甘露醇、葡萄糖、可溶性淀粉、麥芽糖、乙酸鈉、蔗糖、蛋白胨、牛肉膏、硝酸鉀、酵母浸粉（均為生化試劑）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；玉米粕、麩皮、米糠、豆粕、花生粕（均為生化試劑）：湖北工業(yè)大學(xué)南區(qū)菜市場。其他試劑均為國產(chǎn)分析純或生化試劑。

1.1.3 培養(yǎng)基

初始發(fā)酵培養(yǎng)基（LB液體培養(yǎng)基）[11]：蛋白胨10.0 g/L、NaCl 5.0 g/L和酵母浸粉5.0 g/L，pH自然，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。LB固體培養(yǎng)基：LB液體培養(yǎng)基中添加瓊脂粉20.0 g/L。

1.2 儀器與設(shè)備

YXQ-LS全自動數(shù)顯高壓蒸汽滅菌鍋：上海博訊實業(yè)有限公司；DNP-9022生化培養(yǎng)箱：上海精宏分析儀器制造有限公司；ZHWY-2102C恒溫?fù)u床、ZFD-5430電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海智城分析儀器制造有限公司；ZHJH-1214B潔凈工作臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司；AR-1140精密天平：梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1Bacillus cabrialesiiST-1的活化及種子液的制備

活化：將斜面保存的Bacillus cabrialesiiST-1接種于含有2%葡萄糖的LB液體培養(yǎng)基中，在30 ℃、200 r/min的條件下?lián)u床培養(yǎng)16 h。

種子液的制備：按照2%（V/V）的接種量將活化的BacilluscabrialesiiST-1接種于LB液體培養(yǎng)基，30℃、200r/min的條件下培養(yǎng)24 h，得菌株ST-1種子液。

1.3.2Bacillus cabrialesiiST-1產(chǎn)芽孢發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

（1）單因素試驗

采用單因素輪換法，在LB培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，依次考察碳源種類（甘露醇、葡萄糖、可溶性淀粉、麥芽糖、乙酸鈉、蔗糖）（碳源添加量為10.0 g/L）及最佳碳源添加量（5.0 g/L、10.0 g/L、15.0 g/L、20.0 g/L、25.0 g/L）、氮源種類（玉米粕、蛋白胨、牛肉膏、硝酸鉀、麩皮、米糠、豆粕、花生粕、酵母浸粉）（氮源添加量為10.0 g/L）及最佳氮源添加量（5.0 g/L、10.0 g/L、15.0 g/L、20.0 g/L、25.0 g/L）對Bacillus cabrialesiiST-1芽孢數(shù)的影響。

選取產(chǎn)芽孢效果好的氮源與低成本氮源進(jìn)行復(fù)配（總添加量為20.0 g/L），研究不同復(fù)配比例（1∶1、1∶2、1∶3）對卡氏芽孢桿菌ST-1芽孢數(shù)的影響。最后，在固定最適碳源及氮源的基礎(chǔ)上，以未添加無機(jī)鹽的培養(yǎng)基為對照（CK），考察無機(jī)鹽種類（磷酸二氫鉀、氯化鈉、硫酸錳、氯化鈣、七水硫酸鎂）（添加量為1.0 g/L）、磷酸二氫鉀添加量（1.5 g/L、2.0 g/L、2.5 g/L、3.0 g/L、3.5 g/L）、七水硫酸鎂添加量（0.25 g/L、0.5 g/L、0.75 g/L、1.0 g/L、1.25 g/L）對Bacillus cabrialesiiST-1芽孢數(shù)的影響。

（2）Plackett-burrnan試驗設(shè)計

在單因素試驗基礎(chǔ)上選取蔗糖（X1）、麩皮和蛋白胨（1∶2）（X2）、磷酸二氫鉀（X3）、七水硫酸鎂（X4）添加量為自變量，分別設(shè)計低水平（-1）和高水平（1），進(jìn)行n=12的Plackett-Burman（PB）試驗，快速篩選對芽孢數(shù)影響最大的組分，PB試驗設(shè)計因素及水平見表1。

表1 Plackett-Burman設(shè)計試驗因素及水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experiments design

（3）最陡爬坡試驗設(shè)計

根據(jù)Plackett-Burman試驗結(jié)果篩選顯著影響因素，并根據(jù)各顯著影響因素效應(yīng)的大小設(shè)定步長及變化方向，以便快速逼近最佳區(qū)域。根據(jù)各因素效應(yīng)的正負(fù)和大小確定取值，正效應(yīng)的因素均取較高值，負(fù)效應(yīng)的因素均取較低值。通過最陡爬坡試驗逼近最大影響因素的最佳水平。

（4）響應(yīng)面試驗設(shè)計

以最陡爬坡法試驗篩選出的3個關(guān)鍵因素蔗糖添加量（A）、麩皮+蛋白胨（1∶2）添加量（B）及磷酸二氫鉀添加量（C）的相對高水平作為中心點(diǎn)，設(shè)計3因素3水平的中心組合試驗設(shè)計（central composite design，CCD），響應(yīng)面試驗設(shè)計因素與水平見表2。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計因素及水平Table 2 Factors and levels of response surface tests design

采用軟件Design-Expert 10.0對試驗結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合分析，構(gòu)建響應(yīng)面曲面圖，擬合出各因素水平和芽孢數(shù)之間的回歸方程。

1.3.3 芽孢數(shù)的測定

采用平板計數(shù)法檢測芽孢數(shù)。取發(fā)酵芽孢懸液，釆用10倍梯度稀釋法制成適宜稀釋度的供試液。取各100 μL分別涂布于LB固體培養(yǎng)基，平行涂布3個平板，在37 ℃倒置培養(yǎng)12 h后計數(shù)。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)使用軟件SPSS 26.0和Minitab 19進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。所有試驗重復(fù)3次，實驗結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示；采用Origin 2021繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 Bacillus cabrialesii ST-1產(chǎn)芽孢培養(yǎng)基優(yōu)化單因素試驗

2.1.1 不同碳源及蔗糖添加量對菌株ST-1芽孢數(shù)的影響

不同碳源及蔗糖添加量對Bacillus cabrialesiiST-1芽孢數(shù)的影響見圖1。

圖1 碳源種類（A）及蔗糖添加量（B）對Bacillus cabrialesii ST-1芽孢數(shù)的影響Fig.1 Effect of carbon source types (A) and sucrose addition (B)on the spore number of Bacillus cabrialesii ST-1

由圖1A可知，蔗糖作為單一碳源時，芽孢數(shù)最多，達(dá)到15.96×108CFU/mL，其次是葡萄糖，芽孢數(shù)為12.74×108CFU/mL。已有研究報道證實，多種芽孢桿菌的最佳發(fā)酵碳源為蔗糖[12-13]，分析原因可能是蔗糖可為菌體發(fā)酵提供一個低滲透壓的環(huán)境[14]，故確定最佳碳源為蔗糖。由圖1B可知，隨著蔗糖添加量的升高，芽孢數(shù)呈先升高后降低的趨勢，分析原因可能是蔗糖添加量較少時，由于培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的缺乏，導(dǎo)致菌體生長受限；而當(dāng)蔗糖添加量過多時，培養(yǎng)基的滲透壓過高，從而導(dǎo)致菌體的生長受到抑制[15]。當(dāng)蔗糖添加量為10.0 g/L時，芽孢數(shù)最大為16.63×108CFU/mL。因此，選擇蔗糖的最優(yōu)添加量為10.0g/L。

2.1.2 不同單一氮源及蛋白胨添加量對菌株ST-1芽孢數(shù)的影響

不同單一氮源及蛋白胨添加量對Bacillus cabrialesiiST-1芽孢數(shù)的影響見圖2。由圖2A可知，采用蛋白胨為單一氮源時，Bacillus cabrialesiiST-1的芽孢數(shù)最多，達(dá)18.56×108CFU/mL。有研究表明，不同種屬的芽孢桿菌的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基存在差異[16-17]。由圖2B可知，隨著蛋白胨添加量的增加，芽孢數(shù)呈先升高后下降的趨勢，當(dāng)?shù)鞍纂颂砑恿繛?0.0 g/L時，發(fā)酵液中的芽孢數(shù)最多，達(dá)到23.64×108CFU/mL。

圖2 氮源種類（A）及蛋白胨添加量（B）對Bacillus cabrialesii ST-1芽孢數(shù)的影響Fig.2 Effect of nitrogen source types (A) and peptone addition (B)on the spore number of Bacillus cabrialesii ST-1

2.1.3 不同氮源配比對菌株ST-1芽孢數(shù)的影響

麩皮為單一氮源時，Bacillus cabrialesiiST-1芽孢數(shù)為5.81×108CFU/mL。麩皮是一種工業(yè)副產(chǎn)品，來源廣泛、成本低，其粗蛋白含量豐富，同時含有纖維素、淀粉及維生素、無機(jī)鹽和生長因子[18]，可進(jìn)一步循環(huán)再利用。本研究選用產(chǎn)芽孢效果好的蛋白胨與低成本麩皮進(jìn)行復(fù)配，考察復(fù)合氮源（添加量為20.0 g/L）對Bacillus cabrialesiiST-1發(fā)酵產(chǎn)芽孢的影響，結(jié)果見表3。

表3 不同復(fù)合氮源比例對Bacillus cabrialesii ST-1芽孢數(shù)的影響Table 3 Effect of different nitrogen sources ratio on the spore number of Bacillus cabrialesii ST-1

由表3可知，當(dāng)復(fù)合氮源為麩皮＋蛋白胨（1∶2）時，芽孢數(shù)最大，為28.50×108CFU/mL，顯著高于麩皮與蛋白胨配比為1∶1、1∶3的復(fù)合氮源。分析主要原因可能是，芽孢桿菌在氮源充足的條件下，能夠快速生長增殖并發(fā)酵產(chǎn)生多種水解酶，而麩皮本身除含有粗蛋白外，還含有較高的纖維、淀粉、維生素及生長因子等物質(zhì)[18]，水解酶能夠進(jìn)一步分解其中的營養(yǎng)物質(zhì)，促使芽孢桿菌生長繁殖，當(dāng)二者以合適比例復(fù)配時，有利于Bacillus cabrialesiiST-1的發(fā)酵產(chǎn)孢。因此，選擇麩皮與蛋白胨最適配比為1∶2。

2.1.4 不同無機(jī)鹽及添加量對菌株ST-1芽孢數(shù)的影響

無機(jī)鹽在微生物生長繁殖過程中有維持細(xì)胞內(nèi)外滲透壓，參與細(xì)胞代謝等功能[19]。5種無機(jī)鹽離子（添加量為1.0 g/L）對Bacillus cabrialesiiST-1芽孢數(shù)的影響，結(jié)果見圖3A。由圖3A可知，添加磷酸二氫鉀和七水硫酸鎂時，Bacillus cabrialesiiST-1的芽孢數(shù)較多，分別為29.48×108CFU/mL和27.69×108CFU/mL。磷酸鹽在生物發(fā)酵過程中既能促進(jìn)菌體的基礎(chǔ)代謝，又能影響許多代謝產(chǎn)物的生物合成[20]。Mg2+作為三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）的輔助因子參與生物的各種生理生化反應(yīng)，還是許多酶的活化劑[21]。金華等[22]研究發(fā)現(xiàn)，鎂離子對丁酸梭狀芽孢桿菌（Clostridium butyricum）Z-10芽孢的形成具有顯著的促進(jìn)作用；林陳強(qiáng)等[23]研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中添加適量的鎂離子對芽孢桿菌CHB201的菌體生長和芽孢形成有顯著影響。因此，選用磷酸二氫鉀與七水硫酸鎂進(jìn)行后續(xù)試驗，分別研究其添加量對Bacillus cabrialesiiST-1產(chǎn)芽孢數(shù)的影響，結(jié)果分別見圖3B和3C。由圖3B和3C可知，隨著磷酸二氫鉀添加量或七水硫酸鎂添加量的增加，芽孢數(shù)均呈先升高后下降的趨勢。當(dāng)磷酸二氫鉀添加量為3.0 g/L時，芽孢數(shù)達(dá)到最大，為35.73×108CFU/mL；當(dāng)七水硫酸鎂添加量為0.50 g/L時，芽孢數(shù)達(dá)到最大，為34.14×108CFU/mL。分析原因可能是，磷酸鹽添加量過少時，可能影響生物細(xì)胞代謝，添加過高的磷酸鹽可能影響芽孢桿菌細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓，CONRAD R等[24]通過放射性同位素標(biāo)記試驗研究發(fā)現(xiàn)，磷酸鹽≥20 mmol/L對微生物具有明顯抑制作用。七水硫酸鎂含量較低時能夠促進(jìn)多種酶的活化，高含量的七水硫酸鎂可能影響細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓[25]。

圖3 無機(jī)鹽種類（A）及磷酸二氫鉀（B）、七水硫酸鎂（C）添加量對Bacillus cabrialesii ST-1芽孢數(shù)的影響Fig.3 Effect of inorganic salt types (A),potassium dihydrogen phosphate (B) and magnesium sulphate heptahydrate (C)addition on the spore number of Bacillus cabrialesii ST-1

磷酸二氫鉀與七水硫酸鎂對Bacillus cabrialesiiST-1產(chǎn)芽孢無顯著性差異，因此后續(xù)PB試驗進(jìn)一步考察磷酸二氫鉀與七水硫酸鎂對BacilluscabrialesiiST-1產(chǎn)芽孢的影響。

2.2 菌株ST-1產(chǎn)芽孢培養(yǎng)基優(yōu)化PB試驗

PB試驗設(shè)計及結(jié)果見表4，主效應(yīng)分析結(jié)果見表5。

表4 Plackett-Burman試驗設(shè)計及結(jié)果Table 4 Design and results of Plackett-Burman experiments

續(xù)表

表5 Plackett-Burman試驗主效應(yīng)分析結(jié)果Table 5 Main effect analysis results of Plackett-Burman experiments

由表5可知，培養(yǎng)基中對Bacillus cabrialesiiST-1芽孢數(shù)有顯著影響的因素包括蔗糖、麩皮與蛋白胨比例（1∶2）、磷酸二氫鉀，其中蔗糖對Bacillus cabrialesiiST-1芽孢數(shù)的影響為正效應(yīng)，麩皮和蛋白胨（1∶2）以及磷酸二氫鉀對Bacillus cabrialesiiST-1芽孢數(shù)的影響為負(fù)效應(yīng)，七水硫酸鎂對Bacillus cabrialesiiST-1產(chǎn)芽孢的影響不顯著（P＞0.05）。

2.3 菌株ST-1產(chǎn)芽孢培養(yǎng)基優(yōu)化最陡爬坡試驗

根據(jù)Plackett-Burman試驗結(jié)果設(shè)計最陡爬坡試驗，試驗設(shè)計及結(jié)果見表6。

表6 最陡爬坡試驗設(shè)計及結(jié)果Table 6 Design and results of the steepest climb experiments

由表6可知，第4組試驗，即在蔗糖添加量13.81g/L，麩皮＋蛋白胨（1∶2）添加量17 g/L，磷酸二氫鉀添加量1.8 g/L條件下，菌株ST-1的芽孢數(shù)最高，為54.45×108CFU/mL。故采用蔗糖添加量13.81 g/L，麩皮＋蛋白胨（1∶2）添加量17 g/L，磷酸二氫鉀添加量1.8 g/L為后續(xù)響應(yīng)面試驗的中心點(diǎn)。

2.4 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

試驗設(shè)計及結(jié)果見表7，回歸模型方差分析見表8。

表8 回歸模型方差分析Table 8 Variance analysis of regression model

采用Design-Expert 10.0軟件對表7試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行多元二次回歸擬合分析，得出二次多項回歸方差為：Y=59.700-0.350A-0.062B-0.438C-1.150A2-1.525B2-1.875C2+0.325AB-0.675AC-1.250BC。

表7 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 7 Design and results of response surface tests design

由表8可知，模型P=0.014＜0.05，表明模型對結(jié)果影響顯著（P＜0.05）；失擬項對結(jié)果影響不顯著（P＞0.05），表明模型能對Bacillus cabrialesiiST-1芽孢數(shù)進(jìn)行較好的分析和預(yù)測。決定系數(shù)R2=0.917 7，表明預(yù)測有8.23%的變異情況不能由該模型解釋。調(diào)整決定系數(shù)R2adj=0.843 6，表明剔除自變量個數(shù)對R2的影響后系數(shù)為0.843 6。由P值可知，交互項BC及二次項A2對結(jié)果影響極顯著（P＜0.01），交互項AC對結(jié)果影響顯著（P＜0.05），其他項對結(jié)果影響不顯著（P＞0.05）。各因素間交互作用對芽孢數(shù)影響的響應(yīng)面及等高線圖見圖4。

圖4 各因素間交互作用對Bacillus cabrialesii ST-1芽孢數(shù)影響的響應(yīng)曲面及等高線Fig.4 Response surfaces plots and contour lines of effects of interaction between each factor on the spore number of Bacillus cabrialesii ST-1

由圖4可知，響應(yīng)面呈明顯的凸面，等高線均呈橢圓形，說明交互作用AC、BC對結(jié)果影響顯著，與表8方差分析結(jié)果一致。采用Design-Expert 10.0軟件對回歸方程進(jìn)行最優(yōu)求解，得到最優(yōu)培養(yǎng)基配方為蔗糖添加量13.1 g/L，麩皮＋蛋白胨添加量（1∶2）17.0 g/L，磷酸二氫鉀添加量2.0 g/L，在此優(yōu)化條件下，Bacillus cabrialesiiST-1芽孢數(shù)理論值達(dá)到最大，為5.97×109CFU/mL，通過發(fā)酵驗證，得到芽孢數(shù)實際值為5.96×109CFU/mL，與理論值5.97×109CFU/mL相近。說明模型預(yù)測可靠。

3 結(jié)論

本研究以芽孢數(shù)為響應(yīng)值，通過單因素試驗和響應(yīng)面試驗得到Bacillus cabrialesiiST-1產(chǎn)芽孢的最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基配方為蔗糖13.1 g/L，麩皮+蛋白胨（1∶2）17.0 g/L，磷酸二氫鉀2.0g/L。在此優(yōu)化條件下，BacilluscabrialesiiST-1的芽孢數(shù)為5.96×109CFU/mL，是優(yōu)化前芽孢數(shù)（1.85×108CFU/mL）的32.21倍。本研究結(jié)果為菌株ST-1后續(xù)小試及工業(yè)化生產(chǎn)提供了數(shù)據(jù)參考，同時也為利用Bacillus cabrialesiiST-1開發(fā)生防制劑奠定了基礎(chǔ)。在后續(xù)研究中，將對Bacillus cabrialesiiST-1培養(yǎng)條件及方式進(jìn)行研究，進(jìn)一步提高其芽孢數(shù)。