劉木蘭，唐白露*，曠琦穎，譚朵朵，劉 佳，何雪婷，王梓涵，周芷潔，夏 虎，2，陳中元

（1.湖南文理學(xué)院 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 常德市農(nóng)業(yè)生物大分子研究中心 水生動(dòng)物重要疫病分子免疫技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室環(huán)洞庭湖水產(chǎn)健康養(yǎng)殖及加工湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 常德 415000；2.大湖水殖股份有限公司，湖南 常德 415000）

幾丁質(zhì)和膠原蛋白都屬于難降解的有機(jī)高分子化合物。幾丁質(zhì)酶是幾丁質(zhì)生物降解的關(guān)鍵酶類，廣泛存在于各類物種中[1]。利用幾丁質(zhì)酶降解幾丁質(zhì)生產(chǎn)幾丁寡糖和殼聚糖等降解產(chǎn)物的方法具有反應(yīng)條件溫和、綠色環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)[2]。膠原蛋白酶是一類能夠在適宜條件下水解膠原蛋白，并且不損傷其他蛋白和結(jié)構(gòu)的酶類[3]。利用膠原蛋白酶水解膠原蛋白，產(chǎn)物多為多肽和L-氨基酸，具有反應(yīng)條件溫和、耗時(shí)短、無污染、產(chǎn)品營養(yǎng)價(jià)值高、產(chǎn)物易于消化吸收等優(yōu)點(diǎn)[4]。并且微生物胞外酶還具有來源廣、可分泌到胞外、生產(chǎn)周期短、易發(fā)酵、易提取、操作性強(qiáng)、經(jīng)濟(jì)效益好等優(yōu)點(diǎn)，在醫(yī)學(xué)、食品、化工和飼料等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景和現(xiàn)實(shí)意義[5-6]。

目前比較常見的產(chǎn)幾丁質(zhì)酶細(xì)菌有氣單胞菌屬、沙雷氏菌屬、弧菌屬和芽孢桿菌屬[7]。有研究表明，來自枯草芽孢桿菌的幾丁質(zhì)酶在將廢棄的粗制蟹殼轉(zhuǎn)化為N-乙酰葡糖胺時(shí)的效果優(yōu)于作為商業(yè)化產(chǎn)品的灰色鏈霉菌的幾丁質(zhì)酶，轉(zhuǎn)化率可達(dá)60%[8]。LI Z K等[9]研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的珊瑚球菌EGB和鏈霉菌DA11對(duì)植物病原體米曲霉、黑曲霉和白色念珠菌有抑制效果。此外，有研究者通過優(yōu)化菌株發(fā)酵生產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的工藝來制備幾丁寡糖或幾丁單糖[10-11]。目前研究較多的產(chǎn)膠原蛋白酶細(xì)菌主要有溶組織梭菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌和溶藻弧菌[12]，其制備的膠原蛋白酶已作為商品酶進(jìn)行出售。來自假交替單胞菌SM9913的膠原蛋白酶MCP-01在肉味改善和肉質(zhì)嫩化方面表現(xiàn)出良好的應(yīng)用潛力[13]。但細(xì)菌在應(yīng)用過程中可能會(huì)存在一定的安全風(fēng)險(xiǎn)，如某飼料添加劑中的蠟狀芽孢桿菌因攜帶含四環(huán)素耐藥基因（tetracyclin resistant gene B，tetB）的質(zhì)粒，存在潛在的安全風(fēng)險(xiǎn)而被停用[14]。

前期實(shí)驗(yàn)從環(huán)洞庭湖水系的3個(gè)淡水湖漁場(chǎng)的表層底泥中篩選得到5株降解有機(jī)高分子化合物的細(xì)菌，其中2株為產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌株，3株為產(chǎn)膠原蛋白酶菌株，但尚不了解這5株產(chǎn)酶菌株的生物安全性。本研究以篩選到的2株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌株及3株產(chǎn)膠原蛋白酶菌株為研究對(duì)象，對(duì)其酶活力進(jìn)行分析，對(duì)菌株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，并通過藥敏實(shí)驗(yàn)、溶血性實(shí)驗(yàn)、氨基酸脫羧酶活性和硝酸還原酶活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)對(duì)其安全性進(jìn)行評(píng)價(jià)，以期為產(chǎn)酶菌株的開發(fā)和利用奠定科學(xué)基礎(chǔ)，更好地實(shí)現(xiàn)產(chǎn)酶菌株的工業(yè)化應(yīng)用，并充分開發(fā)菌株的利用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

2株降解幾丁質(zhì)的菌株：菌株AL1分離自漢壽縣安樂湖表層底泥，菌株BM1分離自澧縣北民湖表層底泥；3株降解膠原蛋白的菌株：菌株ALJ1分離自漢壽縣安樂湖表層底泥，菌株BMJ1分離自澧縣北民湖表層底泥，菌株DJ2分離自華容縣東湖表層底泥。所有菌株都保存于本實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 試劑

1.1.3 培養(yǎng)基

血瓊脂平板培養(yǎng)基：江門市凱林貿(mào)易有限公司；LB液體/固體培養(yǎng)基：按照文獻(xiàn)[15]配制；明膠發(fā)酵培養(yǎng)基：按照文獻(xiàn)[16]配制。上述培養(yǎng)基均采用115 ℃高壓蒸汽滅菌30 min。

氨基酸脫羧酶測(cè)定培養(yǎng)基：0.5%蛋白胨，0.3%酵母粉，0.1%葡萄糖，0.1%1.6%溴甲酚紫-乙醇溶液，0.5%L-賴氨酸/L-精氨酸/L-鳥氨酸（對(duì)照組不加氨基酸），pH 6.8，115 ℃高壓蒸汽滅菌10 min。

膠體幾丁質(zhì)發(fā)酵培養(yǎng)基：0.2%蛋白胨、0.1%葡萄糖、0.2%酵母粉、0.03%KH2PO4、0.07%K2HPO4、0.002%FeSO4、0.05% MgSO4·7H2O、0.001% ZnSO4、0.3%膠體幾丁質(zhì)，蒸餾水配制，pH 7.5，115 ℃高壓蒸汽滅菌30 min。

1.2 儀器與設(shè)備

THZ-98C恒溫振蕩器：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；5417R臺(tái)式冷凍離心機(jī)：德國艾本德股份公司；Synergy HTX酶標(biāo)儀：美國伯騰儀器有限公司；TC-96/G/H（b）C基因擴(kuò)增儀：杭州博日科技有限公司；SPX-250生化培養(yǎng)箱：北京中興偉業(yè)儀器有限公司；KW-1000DC HH恒溫水浴鍋：金壇市中大儀器廠；JY96-IIN超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 有機(jī)高分子化合物降解菌產(chǎn)酶活力的測(cè)定

（1）幾丁質(zhì)酶活測(cè)定

菌液按1%接種量接種于膠體幾丁質(zhì)發(fā)酵培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)3 d，取發(fā)酵液上清，采用DNS法[17]進(jìn)行幾丁質(zhì)酶活測(cè)定。以N-乙酰葡糖胺濃度（μmol/mL）（X）為橫坐標(biāo)，OD550nm值（Y）為縱坐標(biāo)繪制N-乙酰葡糖胺標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程Y=0.789X-0.145。根據(jù)回歸方程計(jì)算篩選菌株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶活。

幾丁質(zhì)酶活單位定義：在28 ℃、pH 7.5的條件下，1 mL酶液每小時(shí)催化產(chǎn)生1 μmol還原糖所需的酶量為一個(gè)酶活單位（U）。

（2）膠原蛋白酶活測(cè)定

菌液按0.1%接種量接種于明膠發(fā)酵培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)1 d。取發(fā)酵液上清，采用甘氨酸-茚三酮顯色法[18]進(jìn)行膠原蛋白酶活測(cè)定。以甘氨酸質(zhì)量濃度（μg/mL）（X）為橫坐標(biāo)，OD570nm值（Y）為縱坐標(biāo)，繪制甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程Y=0.006 86X+0.026 09。根據(jù)回歸方程計(jì)算篩選菌株產(chǎn)膠原蛋白酶活。

膠原蛋白酶活單位定義：在28 ℃、pH 7.5的條件下，1 mL酶液每分鐘水解膠原蛋白產(chǎn)生相當(dāng)于1 μg甘氨酸的酶量為一個(gè)酶活單位（U）。

1.3.2 分子生物學(xué)鑒定

16S rDNA基因序列的擴(kuò)增：以上述DNA為模板，使用細(xì)菌通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'）進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增體系和PCR擴(kuò)增程序參考文獻(xiàn)[19]中的方法。

16S rDNA基因序列的測(cè)序及分析：將擴(kuò)增得到的DNA片段送至擎科生物科技有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果通過美國國家生物技術(shù)信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫和Eztaxon數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行比對(duì)。隨后將菌株及其近緣種的16SrRNA基因序列通過分子進(jìn)化遺傳分析（molecular evolutionarygenetics analysis，MEGA）7.0軟件的Clutal W程序進(jìn)行比對(duì)，在MEGA 7.0中使用鄰接（neighbor joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。用Bootstrap值分析（1 000個(gè)重復(fù)）來評(píng)估進(jìn)化樹的拓?fù)潢P(guān)系，并使用Jukes和Cantor提出的模型對(duì)進(jìn)化距離進(jìn)行計(jì)算。

1.3.3 菌株的安全性評(píng)價(jià)

（1）抗生素敏感性檢測(cè)

采用常規(guī)紙片擴(kuò)散法（Kirby-Bauer，K-B）對(duì)5株降解有機(jī)高分子化合物的細(xì)菌進(jìn)行抗生素敏感性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)[20]。依據(jù)抑菌圈直徑大小結(jié)合《藥敏試驗(yàn)紙片法的抑菌范圍解釋標(biāo)準(zhǔn)》判斷菌株對(duì)20種抗生素的敏感性[21]?？股孛舾行钥杀砻骶甑挚雇鈦硭幬锔蓴_的能力及抗性基因轉(zhuǎn)移的潛在風(fēng)險(xiǎn)。

（2）溶血性檢測(cè)

使用血瓊脂平板，通過劃線法檢測(cè)菌株的溶血性。用無菌接種環(huán)沾取少量菌液于血瓊脂平板表面，通過四區(qū)劃線法于血平板上劃出目標(biāo)菌株的單菌落。將血瓊脂平板放入恒溫培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)1～2 d，觀察菌落周圍有無溶血現(xiàn)象出現(xiàn)，結(jié)果判斷依據(jù)Luis-Villasenor的方法[22]。若菌落周圍出現(xiàn)草綠色環(huán)，則為α-溶血；若菌落周圍出現(xiàn)透明溶血環(huán)，則為β-溶血；若菌落周圍無任何變化，則為γ-溶血，即不溶血。

（3）氨基酸脫羧酶活性檢測(cè)

分別設(shè)置無氨基酸的菌株組和分別含L-賴氨酸、L-精氨酸或L-鳥氨酸的菌株組。取50 μL OD600nm值約為1.0的5株待測(cè)菌的菌液分別接種到5 mL氨基酸脫羧酶測(cè)定培養(yǎng)基，向試管中加入無菌液體石蠟覆蓋液面，液體石蠟的高度為3～6 mm，從而形成一個(gè)密封的無氧環(huán)境。每組設(shè)3次重復(fù)，在28 ℃下靜置培養(yǎng)48 h后觀察培養(yǎng)基顏色變化[23]。當(dāng)指示劑呈紫色為陽性結(jié)果，呈黃色為陰性結(jié)果，無氨基酸的菌株組為對(duì)照組，應(yīng)呈黃色。

（4）硝酸還原酶活性檢測(cè)

有些細(xì)菌具有硝酸還原酶活性，可將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽。按照硝酸還原酶活性測(cè)定試劑盒的說明書進(jìn)行菌株硝酸還原酶活性的測(cè)定[23]。

2 結(jié)果與分析

2.1 有機(jī)高分子化合物降解菌產(chǎn)幾丁質(zhì)酶和產(chǎn)膠原蛋白酶酶活力測(cè)定結(jié)果

5株降解有機(jī)高分子化合物菌株的產(chǎn)幾丁質(zhì)酶及產(chǎn)膠原蛋白酶酶活力測(cè)定結(jié)果見圖1。

由圖1可知，菌株AL1和菌株BM1可降解幾丁質(zhì)，菌株ALJ1、菌株BMJ1和菌株DJ2可降解膠原蛋白。菌株AL1、菌株BM1的幾丁質(zhì)酶活分別為（0.54±0.01）U/mL和（0.47±0.02）U/mL。菌株ALJ1、菌株BMJ1、菌株DJ2的膠原蛋白酶活分別為（82.38±3.00）U/mL、（71.24±4.19）U/mL和（53.78±3.74）U/mL。有研究從其他環(huán)境中分離到的產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌株酶活在0.25～3.48 U/mL之間[24-25]，產(chǎn)膠原蛋白酶菌株酶活在21.19～36.80 U/mL之間[26-31]。本研究中的2株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌株酶活為0.47～0.54 U/mL，3株產(chǎn)膠原蛋白酶菌株酶活為53.78～82.38 U/mL。

圖1 5株菌株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶及產(chǎn)膠原蛋白酶酶活力測(cè)定結(jié)果Fig.1 Determination results of enzyme activities of chitinase and collagenase produced by 5 strains

2.2 有機(jī)高分子化合物降解菌的分子生物學(xué)鑒定

對(duì)5株產(chǎn)酶菌株的16SrRNA基因進(jìn)行測(cè)序，基于16SrRNA基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖2。

圖2 基于16S rRNA基因序列5株菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic trees of 5 strains based on the 16S rRNA gene sequences

由圖2可知，菌株AL1、BM1、ALJ1、BMJ1、DJ2分別與蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）ATCC 14579T（AE016877）、陰城假單胞菌（Pseudomonas umsongensis）DSM 16611T（NIWU 01000003）、地中海假單胞菌（Pseudomonas mediterranea）CFBP 5447T（AUPB01000004）、杰西尼假單胞菌（Pseudomonas jessenii）DSM 17150T（NIWT01000013）和印度微小桿菌（Exiguobacterium indicum）HHS31T（AJ846291）以≥60%的自展值在系統(tǒng)發(fā)育樹上形成一個(gè)內(nèi)分支，說明兩者之間具有較近的親緣關(guān)系。將菌株AL1、BM1、ALJ1、BMJ1、DJ2分別鑒定為Bacillussp.、Pseudomonassp.、Pseudomonassp.、Pseudomonassp.和Exiguobacteriumsp.。

2.3 安全性評(píng)價(jià)

2.3.1 耐藥性

隨著抗生素的廣泛使用，細(xì)菌耐藥性問題也日益突出，減少耐藥菌株的傳播成為維護(hù)公共衛(wèi)生安全的關(guān)鍵之一。2013年歐洲食品安全局安全資格認(rèn)證列表中將抗生素耐藥性列為微生物菌種通用安全評(píng)估項(xiàng)目[32]。采用K-B法對(duì)5株菌進(jìn)行了20種抗生素敏感性檢測(cè)，結(jié)果見表1。由表1可知，Bacillussp.AL1對(duì)13種抗生素表現(xiàn)為耐藥，對(duì)6種抗生素表現(xiàn)為中度敏感，對(duì)1種抗生素表現(xiàn)為高度敏感。Pseudomonassp.BM1對(duì)16種抗生素表現(xiàn)為耐藥，對(duì)3種抗生素表現(xiàn)為中度敏感，對(duì)1種抗生素表現(xiàn)為高度敏感。Pseudomonassp.ALJ1對(duì)18種抗生素表現(xiàn)為耐藥，對(duì)1種抗生素表現(xiàn)為中度敏感，對(duì)1種抗生素表現(xiàn)為高度敏感。Pseudomonassp.BMJ1對(duì)16種抗生素表現(xiàn)為耐藥，對(duì)4種抗生素表現(xiàn)為高度敏感。Exiguobacteriumsp.DJ2對(duì)7種抗生素表現(xiàn)為耐藥，對(duì)7種抗生素表現(xiàn)為中度敏感，對(duì)6種抗生素表現(xiàn)為高度敏感。結(jié)果表明，Exiguobacteriumsp.DJ2的安全性較好，Pseudomonassp.ALJ1的安全風(fēng)險(xiǎn)較高。

表1 5株菌株抗生素敏感性試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Test results of antibiotic sensitivity of 5 strains

2.3.2 溶血性的測(cè)定

菌株分泌的溶血素能夠溶解細(xì)胞，使機(jī)體發(fā)生紅細(xì)胞內(nèi)在缺陷、抗原抗體反應(yīng)、細(xì)胞死亡等，從而導(dǎo)致敗血癥[33]，并且溶血素還能引起有核細(xì)胞和血小板的損傷和死亡[34]。5株降解有機(jī)高分子化合物的細(xì)菌的溶血性結(jié)果見圖3。

由圖3可知，產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌株Bacillussp.AL1菌落周圍由于紅細(xì)胞的完全破裂形成了透明溶血環(huán)，有溶血現(xiàn)象，為β-溶血，表明Bacillussp.AL1具有溶血性，能產(chǎn)生致病物質(zhì)溶血素；其他4株菌菌落周圍均沒有明顯的變化，無溶血現(xiàn)象，呈γ-溶血，表明這4株菌都沒有溶血性，不具有引發(fā)敗血癥的隱患。結(jié)果表明，產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌株Bacillussp.AL1存在潛在的安全性風(fēng)險(xiǎn)。

圖3 5株菌株溶血性試驗(yàn)結(jié)果Fig.3 Hemolytic test results of 5 strains

2.3.3 氨基酸脫羧酶活性的測(cè)定

生物胺主要存在于蛋白質(zhì)含量豐富的發(fā)酵食品中，由微生物分泌的氨基酸脫羧酶催化游離氨基酸形成[35]。生物胺是世界范圍內(nèi)公認(rèn)的影響人體健康的物質(zhì)，食品中的生物胺是潛在的食品安全問題[36]。為確保產(chǎn)品的安全性，有必要對(duì)生物胺的產(chǎn)生進(jìn)行研究[37]。5株降解有機(jī)高分子化合物菌株的氨基酸脫羧酶活性測(cè)定結(jié)果表明，L-賴氨酸菌株組中Pseudomonassp.BM1和Exiguobacteriumsp.DJ2呈黃色，為陰性；Bacillussp.AL1和Pseudomonassp.BMJ1出現(xiàn)藍(lán)紫色，為陽性。L-精氨酸菌株組除Exiguobacteriumsp.DJ2呈黃色，結(jié)果為陰性外，其他菌株均呈藍(lán)紫色，為陽性。L-鳥氨酸菌株組中Pseudomonassp.BM1和Exiguobacteriumsp.DJ2呈黃色，為陰性，Bacillussp.AL1、Pseudomonassp.ALJ1和Pseudomonassp.BMJ1出現(xiàn)藍(lán)紫色，為陽性。結(jié)果表明，Exiguobacteriumsp.DJ2無賴氨酸、精氨酸和鳥氨酸脫羧酶活性，不會(huì)將氨基酸分解成相應(yīng)的生物胺，具有較好的安全性。

2.3.4 硝酸還原酶活性的測(cè)定

具有硝酸還原酶的菌株，能將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽，進(jìn)而形成腸毒素和致癌物質(zhì)，危害健康[23]。因此，對(duì)菌株硝酸還原酶活性的測(cè)定也是菌株安全性評(píng)價(jià)必不可少的[38]。結(jié)果表明，5株菌均沒有硝酸還原酶的產(chǎn)生，不會(huì)將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽，具有一定的安全性。

3 討論

目前，安全性評(píng)價(jià)的研究以乳酸菌為主，但是相關(guān)的安全性評(píng)價(jià)方法和體系還不完善。一般都是從耐藥性評(píng)價(jià)、有害代謝產(chǎn)物評(píng)價(jià)和動(dòng)物性實(shí)驗(yàn)幾個(gè)方面進(jìn)行菌株的安全性評(píng)估[39]?？股孛舾行詫?shí)驗(yàn)結(jié)果表明5株菌對(duì)多種抗生素表現(xiàn)為耐藥。在使用過程中，應(yīng)防止菌株成為抗生素耐藥基因的來源，對(duì)于存在耐藥性的菌株應(yīng)盡可能地消除其耐藥性。目前，對(duì)病原菌耐藥性及耐藥消除的研究較多，而對(duì)工業(yè)發(fā)酵菌株的耐藥消除和消除后菌株的特性變化的研究還不夠全面。干酪乳桿菌攜帶的四環(huán)素耐藥基因tetW和林肯酰胺克林霉素耐藥基因lnuA的耐藥質(zhì)粒消除后，菌株耐藥性消失但益生特性得到保留[40]。采用十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）結(jié)合高溫培養(yǎng)對(duì)乳酸菌的耐藥性質(zhì)粒進(jìn)行消除，消除后乳酸菌的生長速度、產(chǎn)酸能力以及后儲(chǔ)過程中的存活率均受到了影響[41]。進(jìn)一步研究產(chǎn)酶菌株的發(fā)酵特性及降解有機(jī)高分子化合物的作用在消除耐藥性后的變化，可為發(fā)酵企業(yè)獲得低耐藥性或非轉(zhuǎn)移耐藥性的工業(yè)菌株提供理論保證。溶血性細(xì)菌的侵入會(huì)引起溶血現(xiàn)象，從而導(dǎo)致敗血癥。除Bacillussp.AL1具有溶血性，其他4株菌都沒有溶血性，不會(huì)引起溶血現(xiàn)象。Bacillussp.AL1使用時(shí)應(yīng)防止接觸傷口或進(jìn)入人體。氨基酸脫羧酶能夠?qū)被崦擊冗€原成生物胺，造成安全隱患。該酶的產(chǎn)生需要酸性條件，并且氨基酸的分解需要在厭氧條件下進(jìn)行。5株菌中僅Exiguobacteriumsp.DJ2的氨基酸脫羧酶活性試驗(yàn)結(jié)果為陰性，對(duì)氨基酸脫羧酶活性試驗(yàn)陽性的菌株，在其應(yīng)用時(shí)可對(duì)pH進(jìn)行調(diào)節(jié)，避免菌株處于酸性條件，并保證通氧量，防止氨基酸分解。硝酸還原酶可將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽，5株菌株均沒有檢測(cè)到硝酸還原酶活性。由菌株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶和產(chǎn)膠原蛋白酶活力測(cè)定結(jié)果可知，5株菌具有進(jìn)一步發(fā)酵產(chǎn)酶及降解高分子化合物產(chǎn)生有應(yīng)用價(jià)值的小分子物質(zhì)的潛力。

4 結(jié)論

該研究對(duì)來自環(huán)洞庭湖水系的3個(gè)淡水湖漁場(chǎng)的表層底泥樣品中的2株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌株及3株產(chǎn)膠原蛋白酶菌株的酶活進(jìn)行分析，結(jié)果表明菌株具有產(chǎn)幾丁質(zhì)酶和膠原蛋白酶的能力，經(jīng)16S rRNA序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育樹分析，2株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌株AL1和BM1分別被鑒定為芽孢桿菌（Bacillussp.）和假單胞菌（Pseudomonassp.）；3株產(chǎn)膠原蛋白酶菌株ALJ1、BMJ1及DJ2分別被鑒定為Pseudomonassp.、Pseudomonassp.和微小桿菌（Exiguobacteriumsp.）。安全性試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株BMJ1、DJ2分別對(duì)4種和6種抗生素高度敏感，其余菌株僅對(duì)1種抗生素高度敏感；除菌株AL1外，其他4株菌無溶血性；除菌株DJ2外，其他4株菌具有氨基酸脫羧酶活性；5株菌均無硝酸還原酶活性。由此可知，菌株BM1和DJ2是降解有機(jī)高分子化合物的較安全菌株，更適合于進(jìn)一步應(yīng)用。