張冠 楊登科

前列腺癌是男性泌尿生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率呈逐年升高趨勢,很多患者在初診時(shí)已屬中晚期。臨床診療中,患者在接受常規(guī)的內(nèi)分泌治療無效后會(huì)面臨疾病進(jìn)展、生活質(zhì)量下降、生存期縮短等問題[1],一部分病例經(jīng)內(nèi)分泌治療、手術(shù)治療或化療后仍存在生化復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移可能。本文旨在通過基因芯片技術(shù)和生物信息學(xué)方法,分析前列腺癌中的關(guān)鍵表達(dá)基因、信號(hào)通路以及蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò),并進(jìn)行前列腺癌生化復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移事件的生存分析和Cox回歸分析,從而尋找潛在的治療靶點(diǎn),為前列腺癌的生化復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移事件提供新的診療思路。

對象與方法

一、數(shù)據(jù)來源

從基因表達(dá)綜合(Gene Expression Omnibus, GEO)數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中下載前列腺癌相關(guān)的基因芯片數(shù)據(jù)集(GSE200879和GSE116918)。GSE200879發(fā)表于2022年5月,包含由實(shí)驗(yàn)平臺(tái)GPL32170提供的137例臨床樣本,其中正常樣本9例,前列腺癌樣本128例。GSE116918發(fā)表于2018年7月,包含由實(shí)驗(yàn)平臺(tái)GPL25318提供的248例前列腺癌樣本,并對其進(jìn)行前列腺癌生化復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移事件的隨訪。

二、數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化

利用R軟件對基因芯片數(shù)據(jù)集(GSE200879和GSE116918)進(jìn)行初步處理及標(biāo)準(zhǔn)化。首先,使用平臺(tái)文件將基因探針轉(zhuǎn)換為基因名,并對相同基因的表達(dá)量取平均值,然后使用“最近鄰居法”補(bǔ)充缺失值,最后使用標(biāo)準(zhǔn)化函數(shù)對數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化,并用箱線圖對標(biāo)準(zhǔn)化后的數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化檢驗(yàn),以確保后續(xù)數(shù)據(jù)生物信息學(xué)分析的有效性和可靠性。

三、篩選差異基因

利用limma包并使用過濾條件(差異表達(dá)倍數(shù)的對數(shù)絕對值>2,并且調(diào)整后的P<0.05),篩選出GSE200879中正常樣本和前列腺癌樣本的差異表達(dá)基因。

四、基因功能富集分析和信號(hào)通路富集分析

使用clusterProfiler包進(jìn)行基因本體(Gene Ontology, GO)及京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopaedia of Genes and Genomes, KEGG)分析,然后使用過濾條件(調(diào)整后的P<0.05)篩選差異基因主要富集的功能和通路,并繪制柱狀圖對結(jié)果進(jìn)行可視化。

五、構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)

利用在線分析工具STRING網(wǎng)站(https://cn.string-db.org/)和Cytoscape軟件對篩選出的差異基因構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò),并篩選出關(guān)鍵靶點(diǎn)。

六、差異基因?qū)η傲邢侔┥瘡?fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移事件的影響分析

提取標(biāo)準(zhǔn)化后的GSE116918中差異基因的表達(dá)量,根據(jù)基因表達(dá)的中位值將前列腺癌患者分為低表達(dá)組和高表達(dá)組,并與生化復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移事件的數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)。然后使用survival包和survminer包分析差異基因?qū)η傲邢侔┥瘡?fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移事件的影響,生存分析采用Kaplan-Meier法,并繪制生存曲線。

七、前列腺癌生化復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移事件的多因素Cox回歸分析

使用函數(shù)cox.zph驗(yàn)證PH假設(shè),然后使用survival包和survminer包構(gòu)建多因素Cox回歸模型,因變量為前列腺癌生化復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移事件的隨訪時(shí)間和隨訪狀態(tài),自變量為年齡、PSA值、T分期、Gleason評(píng)分和差異基因(TDRD1、CRISP3、OR51E2、SIM2、HPN、PGM5-AS1、BMP5、PCAT4、KRT15、KRT13、KRT5、VSNL1、GSTM1、OLFM4、SLC14A1、CYP3A5),最后繪制森林圖。

結(jié) 果

一、篩選差異基因

從GSE200879中篩選出3 314個(gè)差異表達(dá)基因,其中1 664個(gè)基因表達(dá)下調(diào),1 650個(gè)基因表達(dá)上調(diào)。進(jìn)一步使用過濾條件篩選出22個(gè)基因,其中15個(gè)基因表達(dá)下調(diào),7個(gè)基因表達(dá)上調(diào)。按照差異表達(dá)倍數(shù)由大到小排列,15個(gè)下調(diào)基因依次排序?yàn)镾CGB1A1、CYP3A5、SLC14A1、OLFM4、GSTM1、UPK1A、VSNL1、CD177、GPX2、KRT5、KRT13、KRT15、PCAT4、BMP5、PGM5-AS1;7個(gè)上調(diào)基因依次排序?yàn)镻CA3、TDRD1、CRISP3、AMACR、OR51E2、SIM2、HPN。對篩選出的22個(gè)差異基因進(jìn)行相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)表達(dá)上調(diào)的基因與其他上調(diào)基因呈正相關(guān)關(guān)系,而與下調(diào)基因呈負(fù)相關(guān)關(guān)系,表明這些差異基因可能存在共表達(dá)或表達(dá)調(diào)控關(guān)系。

二、基因功能富集分析和信號(hào)通路富集分析

GO分析發(fā)現(xiàn),KRT5、KRT13、KRT15基因主要富集在中間絲組織、中間絲細(xì)胞骨架組織和基于中間絲的生物過程;CYP3A5、GSTM1基因主要富集在分解代謝過程;HPN、BMP5基因主要富集在激素代謝過程和上皮向間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的負(fù)調(diào)控過程。KEGG分析發(fā)現(xiàn),GPX2、GSTM1基因主要富集在谷胱甘肽的代謝過程;CYP3A5、GSTM1基因主要富集在化學(xué)致癌、細(xì)胞色素P450藥物代謝及其對外源物質(zhì)的代謝過程;KRT13、KRT15基因主要富集在金葡菌感染、雌激素的信號(hào)通路過程。

三、蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

使用過濾條件(差異表達(dá)倍數(shù)的對數(shù)絕對值>1.5,并且調(diào)整后的P<0.05)篩選出97個(gè)差異基因,基于STRING網(wǎng)站和Cytoscape軟件構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。我們發(fā)現(xiàn)上調(diào)基因中,HPN、AMACR、CRISP3基因表達(dá)的蛋白質(zhì)間存在相互作用,下調(diào)基因中KRT5、KRT13、KRT15、UPK1A、SCGB1A1、CYP3A5、GSTM1、GPX2基因表達(dá)的蛋白質(zhì)間存在相互作用。

四、差異基因?qū)η傲邢侔┥瘡?fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移事件的影響分析

分析發(fā)現(xiàn),PGM5-AS1、CD177、GSTM1、SLC14A1、OR51E2、KRT13基因高表達(dá)患者的無生化復(fù)發(fā)生存率顯著高于低表達(dá)患者;PGM5-AS1、CD177、GSTM1、SLC14A1、KRT15、KRT5基因高表達(dá)患者的無轉(zhuǎn)移生存率顯著高于低表達(dá)患者。

五、前列腺癌生化復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移事件的多因素Cox回歸分析

使用函數(shù)cox.zph驗(yàn)證PH假定,我們發(fā)現(xiàn)納入的變量均符合PH假定。多因素Cox回歸分析結(jié)果顯示,SIM2基因(HR=0.405,95%CI:0.245～0.670,P<0.001)是前列腺癌生化復(fù)發(fā)事件的保護(hù)因素,T分期(HR=1.649,95%CI:1.051～2.588,P=0.030)和BMP5基因(HR=1.907,95%CI:1.006～3.614,P=0.048)是前列腺癌生化復(fù)發(fā)事件的危險(xiǎn)因素;SIM2基因(HR=0.385,95%CI:0.173～0.858,P=0.020)是前列腺癌轉(zhuǎn)移事件的保護(hù)因素,HPN基因(HR=7.513,95%CI:1.886～29.924,P=0.004)是前列腺癌轉(zhuǎn)移事件的危險(xiǎn)因素。

討 論

關(guān)于前列腺癌的分子機(jī)制和診療靶點(diǎn),國內(nèi)外已有很多相關(guān)研究,但均缺乏足夠的理論支撐和證據(jù)等級(jí),這也限制了相關(guān)研究在臨床實(shí)踐中的應(yīng)用。我們使用生物信息學(xué)方法篩選出前列腺癌中的差異表達(dá)基因,其中7個(gè)基因表達(dá)上調(diào),按照差異表達(dá)倍數(shù)由大到小依次排序?yàn)镻CA3、TDRD1、CRISP3、AMACR、OR51E2、SIM2、HPN。通過查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn),PCA3基因在大多數(shù)前列腺癌細(xì)胞中高表達(dá),且有研究認(rèn)為PCA3的表達(dá)水平與病情進(jìn)展呈正相關(guān),可以作為前列腺癌診斷的標(biāo)志物[2]。最近的一項(xiàng)研究表明,PCA3作為前列腺癌的標(biāo)志物,具有良好的特異性和敏感性,并且PCA3與PSA聯(lián)合在前列腺癌的診斷中發(fā)揮著重要作用[3]。TDRD1是原發(fā)性前列腺癌中ERG過表達(dá)的直接上調(diào)靶基因,可以作為一種新的前列腺癌生物標(biāo)志物[4-5]。此外,作為前列腺癌的原癌基因,CRISP3與前列腺癌的侵襲和進(jìn)展關(guān)系密切,被證實(shí)為前列腺癌的潛在治療靶點(diǎn)[6]。CRISP3是前列腺癌的上調(diào)基因之一,其在前列腺癌細(xì)胞中的表達(dá)具有雄激素依賴性,CRISP3啟動(dòng)子受雄激素受體的表觀遺傳調(diào)控[7]。CRISP3高表達(dá)是前列腺癌生化復(fù)發(fā)預(yù)后不良因素之一[8]。有學(xué)者對AMACR基因在前列腺癌中的作用進(jìn)行了研究,認(rèn)為敲除AMACR會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞增殖能力下降、凋亡率增加,AMACR基因在前列腺癌的進(jìn)展中可能發(fā)揮著致癌作用[9]。也有報(bào)道指出,對于精液中的AMACR蛋白檢測可成為前列腺癌診斷中的一種非侵入性檢查[10]。不僅如此,OR51E2激動(dòng)劑可通過激活前列腺癌中的細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1和2發(fā)揮致癌作用[11]。OR51E2基因在人前列腺癌上皮細(xì)胞中特異性高表達(dá)[12],能促進(jìn)前列腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移[13]。有研究表明SIM2是前列腺癌顯著上調(diào)基因之一,并且其表達(dá)與臨床病理因素相關(guān)[14]。HPN基因是前列腺癌常見的高表達(dá)基因,一項(xiàng)研究指出HPN基因的變異可能與前列腺癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)[15]。綜上,本研究篩選出的上調(diào)差異基因與既往的相關(guān)研究相符,進(jìn)一步驗(yàn)證了本研究的有效性與可靠性。

在下調(diào)基因中,PGM5-AS1、GSTM1、SLC14A1基因在前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展中起著十分重要的作用。有研究表明,PGM5-AS1通過競爭性結(jié)合miR-587,從而上調(diào)GDF10基因的表達(dá),抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡[16]。此外,有研究認(rèn)為GSTM1基因缺失與亞洲人群前列腺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加顯著相關(guān)[17]。最近的一項(xiàng)研究指出,與正常前列腺上皮細(xì)胞相比,SLC14A1基因在前列腺癌細(xì)胞中的表達(dá)顯著降低,并且Kaplan-Meier生存分析顯示,SLC14A1高表達(dá)可延長前列腺癌患者的無生化復(fù)發(fā)生存時(shí)間[18],這與本研究的結(jié)果相符。

在信號(hào)通路的相關(guān)研究中,雄激素依賴性的信號(hào)通路在前列腺癌內(nèi)分泌治療中發(fā)揮著重要作用,此外雄激素非依賴性的信號(hào)通路也參與了前列腺癌的進(jìn)展。有研究認(rèn)為松弛素與雄激素在胞內(nèi)信號(hào)通路中存在著相互作用,并且可能是雄激素非依賴性前列腺癌新的治療靶點(diǎn)[19]。WNT信號(hào)通路在前列腺癌的進(jìn)展中也發(fā)揮著重要作用[20]。有研究表明脂質(zhì)代謝通路與前列腺癌的侵襲和進(jìn)展密切相關(guān)[21]。綜上,多種信號(hào)通路共同調(diào)控前列腺癌的發(fā)生和進(jìn)展。在對差異基因?qū)η傲邢侔┥瘡?fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移事件的影響分析中,我們發(fā)現(xiàn)PGM5-AS1、CD177、GSTM1、SLC14A1基因高表達(dá)能顯著延長前列腺癌患者無生化復(fù)發(fā)生存率和無轉(zhuǎn)移生存率。在前列腺癌生化復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移事件的多因素Cox回歸分析中,我們發(fā)現(xiàn)SIM2基因表達(dá)是前列腺癌生化復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移事件的保護(hù)因素。以上結(jié)果可為前列腺癌的臨床診療提供新的診療思路。

本研究也存在一些局限性。首先,本研究所選取的樣本來源于歐洲人群,所得結(jié)論是否適用于我國前列腺癌患者還需要進(jìn)一步論證;其次,本研究數(shù)據(jù)來源于公共數(shù)據(jù)庫,其有效性和可靠性尚需進(jìn)一步驗(yàn)證;此外,尚需結(jié)合多中心的臨床數(shù)據(jù)來進(jìn)行進(jìn)一步的論證和預(yù)后分析。