羅婉茹 田軍 章慧平 余潔 王璐瑤 龐義軍

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤,約70%為非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌,其標(biāo)準(zhǔn)的治療方式是經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切,再輔以膀胱灌注化療藥物或卡介苗,但膀胱癌治療后的復(fù)發(fā)率仍達(dá)30%～70%[1]。有研究表明癌細(xì)胞可通過(guò)表達(dá)耐藥蛋白、增強(qiáng)抗凋亡能力、利用炎癥反應(yīng)促進(jìn)腫瘤再生、DNA修復(fù)等機(jī)制,對(duì)治療產(chǎn)生耐藥抵抗,從而引起腫瘤復(fù)發(fā)[2]。膀胱癌輔助治療的應(yīng)用已超過(guò)半個(gè)世紀(jì),一直沒(méi)有突破性的進(jìn)展,膀胱癌術(shù)后復(fù)發(fā)成為非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌治療的一個(gè)難點(diǎn)。

有研究顯示光動(dòng)力治療(photodynamic therapy, PDT)的細(xì)胞毒效應(yīng)可破壞癌細(xì)胞的耐藥蛋白、線粒體、DNA等,能與化療、放療、靶向治療等產(chǎn)生協(xié)同抗腫瘤作用[3]。相關(guān)臨床研究也顯示,PDT聯(lián)合化療用于膽管癌[4]、肺癌[5]和食管癌[6]患者的治療,可提高療效且患者耐受良好,是一種有前景的腫瘤治療策略。體外研究發(fā)現(xiàn)化療藥物和PDT聯(lián)合能提高對(duì)膀胱癌細(xì)胞的殺傷作用[7],但其作用機(jī)制尚不明確。本研究旨在驗(yàn)證六氨基乙酰丙酸(hexaminolevulinate, HAL)介導(dǎo)的PDT聯(lián)合吡柔比星(pirarubicin, THP)在體外對(duì)膀胱癌細(xì)胞殺傷的協(xié)同效應(yīng),并初步闡明其作用機(jī)制,為臨床治療提供新的思路。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

膀胱癌細(xì)胞株T24細(xì)胞由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院泌尿外科贈(zèng)予;膀胱癌細(xì)胞株RT4細(xì)胞、T24細(xì)胞完全培養(yǎng)液和RT4細(xì)胞完全培養(yǎng)液購(gòu)自武漢普諾賽生物科技有限公司;THP購(gòu)自Sigma-Aldrich公司;HAL由廣東精觀生物醫(yī)藥科技有限公司贈(zèng)予;光動(dòng)力治療儀(60 W)由蘇州精觀醫(yī)療科技有限公司贈(zèng)予;CCK-8試劑購(gòu)自大連美侖生物科技有限公司;酶標(biāo)儀購(gòu)自深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司;Hoechst/PI雙染試劑盒購(gòu)自Biosharp公司;倒置熒光顯微鏡購(gòu)自O(shè)lympus公司;Bcl-2、Bax基因引物購(gòu)自上海生物工程有限公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Takara公司;2×Tap Mix試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司;普通梯度PCR儀購(gòu)自Thermo公司;實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自Roche公司;兔抗P-gp抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司;鼠抗GAPDH抗體購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司;BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司;SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購(gòu)自武漢谷歌生物公司;WB電泳設(shè)備、化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自BIO-RAD公司;ECL顯色劑購(gòu)自康為世紀(jì)生物有限公司。

二、RT4和T24細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組

將膀胱癌細(xì)胞株RT4和T24細(xì)胞用其完全培養(yǎng)液培養(yǎng),置于5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。觀察細(xì)胞狀態(tài)并換液,當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%時(shí)予以傳代。傳代培養(yǎng)3次后取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn),各實(shí)驗(yàn)均將RT4和T24細(xì)胞分為空白對(duì)照組(Control組)、PDT組、THP組、PDT+THP組。

三、細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的RT4和T24細(xì)胞,接種于96孔板,密度為5×103個(gè)細(xì)胞/孔,細(xì)胞生長(zhǎng)至70%時(shí),進(jìn)行后續(xù)的藥物處理,每組設(shè)置4個(gè)復(fù)孔。Control組:加入完全培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h,CCK-8法測(cè)定細(xì)胞毒性。PDT組:兩種細(xì)胞加入相同濃度的HAL(0、6.250、12.500、25.000、50.000 μg/ml),37 ℃條件下避光孵育4 h,PBS清洗3次,將光動(dòng)力治療儀光纖固定于鐵架臺(tái)上,垂直照射培養(yǎng)板形成直徑為10 cm的光斑,給予450 nm波長(zhǎng)藍(lán)光照射處理10 min,繼續(xù)避光培養(yǎng)24 h后加入10% CCK-8(100 μl/孔),于37 ℃條件下避光孵育1 h,使用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處吸光度值。THP組:兩種細(xì)胞加入不同濃度的THP(RT4:0、0.250、0.500、1.000、2.000 μg/ml;T24:0、0.625、1.250、2.500、5.000 μg/ml),24 h后用PBS清洗3次,同上以CCK-8法測(cè)定細(xì)胞毒性。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,確定用于以下PDT與THP聯(lián)合治療時(shí)的HAL的濃度和光照時(shí)間。PDT+THP組:兩種細(xì)胞均加入濃度為12.500 μg/ml的HAL,37 ℃條件下避光孵育4 h,PBS清洗3次,給予光照處理10 min后,RT4細(xì)胞加入濃度為0.500 μg/ml的THP,T24細(xì)胞加入濃度為1.250 μg/ml的THP,24 h后PBS清洗3次,同上以CCK-8法測(cè)定細(xì)胞毒性。用GraphPad Prism 8.0繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

四、Hoechst/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的RT4和T24細(xì)胞,接種于96孔板,密度為5×103個(gè)細(xì)胞/孔,細(xì)胞生長(zhǎng)至70%時(shí),Control組:加入完全培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h;PDT組:兩種細(xì)胞均加入濃度為12.500 μg/ml的HAL,37 ℃條件下避光孵育4 h,PBS清洗3次,給予光照處理10 min后孵育24 h;THP組:RT4和T24細(xì)胞分別加入濃度為0.500 μg/ml和1.250 μg/ml的THP孵育24 h;PDT+THP組:兩種細(xì)胞均加入濃度為12.500 μg/ml的HAL,37 ℃條件下避光孵育4 h,PBS清洗3次,給予光照處理10 min后,RT4和T24細(xì)胞分別加入濃度為0.500 μg/ml和1.250 μg/ml的THP孵育24 h。處理完后,均加入PBS清洗3次。每孔加入5 μl Hoechst染色液和5 μl PI染色液,混勻,4 ℃孵育20 min。染色后用PBS清洗1次,在熒光顯微鏡下觀察,正常細(xì)胞為弱紅色熒光+弱藍(lán)色熒光,凋亡細(xì)胞為弱紅色熒光+強(qiáng)藍(lán)色熒光,壞死細(xì)胞為強(qiáng)紅色熒光+強(qiáng)藍(lán)色熒光。

五、Western blot檢測(cè)P-gp蛋白表達(dá)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的T24和RT4細(xì)胞,接種于6孔板,細(xì)胞生長(zhǎng)至70%時(shí),Control組:加入完全培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h;PDT組:兩種細(xì)胞均加入濃度為12.500 μg/ml的HAL,37 ℃條件下避光孵育4 h,PBS清洗3次,給予光照處理10 min后孵育12 h;THP組:RT4和T24細(xì)胞分別加入濃度為0.500 μg/ml和1.250 μg/ml的THP孵育12 h;PDT+THP組:兩種細(xì)胞均加入濃度為12.500 μg/ml的HAL,37 ℃條件下避光孵育4 h,PBS清洗3次,給予光照處理10 min后,RT4和T24細(xì)胞分別加入濃度為0.500 μg/ml和1.250 μg/ml的THP孵育12 h。收集各組處理后的RT4和T24細(xì)胞,PBS洗滌,加入100 μl細(xì)胞裂解液,冰上裂解30 min,15 000 rpm、4 ℃離心20 min,棄沉淀,上清液即為細(xì)胞總蛋白。采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。配置10% SDS-PAGE凝膠,恒壓(上層膠90 V、30 min,下層膠120 V、60 min)電泳,恒流(300 mA、120 min)轉(zhuǎn)膜,用含5%脫脂牛奶的TBST封閉2 h及一抗4 ℃孵育過(guò)夜、二抗室溫孵育2 h、ECL液顯影及成像拍照。

六、RT-qPCR檢測(cè)Bcl-2、Bax基因表達(dá)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RT4和T24細(xì)胞,接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,待細(xì)胞基本貼壁后,Control組:加入完全培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h;PDT組:兩種細(xì)胞均加入濃度為12.500 μg/ml的HAL,37 ℃條件下避光孵育4 h,PBS清洗3次,給予光照處理10 min后孵育24 h;THP組:RT4和T24細(xì)胞分別加入濃度為0.500 μg/ml和1.250 μg/ml的THP孵育24 h;PDT+THP組:兩種細(xì)胞均加入濃度為12.500 μg/ml的HAL,37 ℃條件下避光孵育4 h,PBS清洗3次,給予光照處理10 min后,RT4和T24細(xì)胞分別加入濃度為0.500 μg/ml和1.250 μg/ml的THP孵育24 h。每組設(shè)置3個(gè)平行樣本。用Trizol提取細(xì)胞總RNA,參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA;以所得cDNA為模板,制備RT-qPCR反應(yīng)體系,內(nèi)參為GAPDH(表1);按照2×Tap Mix試劑盒說(shuō)明書(shū)操作測(cè)得CT值,采用2-ΔΔCT法計(jì)算Bax、Bcl-2相對(duì)表達(dá)量。

表1 Bax、Bcl-2及相應(yīng)內(nèi)參GAPDH的引物序列

七、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間差異采用方差分析進(jìn)行比較,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、PDT+THP組抑制RT4和T24細(xì)胞增殖

各組細(xì)胞處理后,采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。RT4細(xì)胞選擇THP濃度為0.500 μg/ml用于聯(lián)合治療,該劑量下RT4細(xì)胞存活率為(60.09±3.55)%(P<0.05)(圖1A);T24細(xì)胞選擇THP濃度為1.250 μg/ml用于聯(lián)合治療,該劑量下T24細(xì)胞存活率為(64.42±8.73)%(P<0.05)(圖1B)。兩種細(xì)胞均選擇HAL濃度為12.500 μg/ml用于聯(lián)合治療,該劑量下RT4細(xì)胞存活率為(52.38±2.39)%(P<0.01)(圖2A),T24細(xì)胞存活率為(65.79±6.33)%(P<0.05)(圖2B)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,PDT+THP組能夠協(xié)同抑制RT4和T24細(xì)胞的增殖,此時(shí)細(xì)胞存活率分別為(17.72±4.23)%、(27.52±6.46)%,與PDT組、THP組相比,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)(圖3)。

A:不同濃度THP對(duì)RT4細(xì)胞增殖的影響;B:不同濃度THP對(duì)T24細(xì)胞增殖的影響(與0 μg/ml THP組比較 *P<0.05,**P<0.01)

A:不同濃度HAL介導(dǎo)的PDT對(duì)RT4細(xì)胞增殖的影響;B:不同濃度HAL介導(dǎo)的PDT對(duì)T24細(xì)胞增殖的影響(與0 μg/ml HAL組比較 *P<0.05,**P<0.01)

A:各組對(duì)RT4細(xì)胞增殖的影響;B:各組對(duì)T24細(xì)胞增殖的影響(與PDT組、THP組比較 **P<0.01)

二、PDT+THP組促進(jìn)RT4和T24細(xì)胞凋亡

采用Hoechst/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果顯示,RT4細(xì)胞和T24細(xì)胞PDT+THP組PI標(biāo)記紅色熒光數(shù)量均多于PDT組和THP組,表明PDT+THP能夠協(xié)同促進(jìn)細(xì)胞凋亡(圖4)。

三、PDT+THP組抑制P-gp蛋白的表達(dá)

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,在RT4和T24細(xì)胞中,與Control組、PDT組和THP組相比,PDT+THP組顯著下調(diào)P-gp蛋白的表達(dá),表明PDT+THP能夠協(xié)同抑制膀胱癌細(xì)胞P-gp蛋白的表達(dá)(圖5)。

A:各組對(duì)RT4細(xì)胞中P-gp蛋白表達(dá)的影響;B:各組對(duì)T24細(xì)胞中P-gp蛋白表達(dá)的影響

四、PDT+THP組對(duì)RT4和T24細(xì)胞Bcl-2、Bax基因表達(dá)的影響

RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示,在RT4和T24細(xì)胞中,PDT+THP組能夠協(xié)同降低Bcl-2基因的表達(dá)、增加Bax基因的表達(dá),與PDT組、THP組相比,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)(圖6、7)。

A:各組對(duì)T24細(xì)胞中Bcl-2基因表達(dá)的影響;B:各組對(duì)T24細(xì)胞中Bax基因表達(dá)的影響(與PDT組、THP組比較 **P<0.01)

討 論

膀胱癌經(jīng)電切后輔以膀胱灌注化療,化療的同時(shí)會(huì)出現(xiàn)多藥耐藥(multidrug resistance, MDR)現(xiàn)象。MDR的機(jī)制主要包括:①藥物外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)增加;②腫瘤微環(huán)境變化與癌癥干細(xì)胞調(diào)控;③表觀遺傳改變和microRNA調(diào)節(jié)基因表達(dá);④藥物靶點(diǎn)改變;⑤細(xì)胞凋亡易感性降低;⑥D(zhuǎn)NA損傷修復(fù)能力增強(qiáng)[8]。PDT利用光敏劑在腫瘤組織中的選擇性富集,通過(guò)激光觸發(fā)光敏劑產(chǎn)生單態(tài)氧等活性氧分子,氧化損傷周邊的細(xì)胞器和生物分子,造成腫瘤細(xì)胞壞死、凋亡、自噬、鐵死亡,并誘發(fā)免疫反應(yīng)進(jìn)而殺傷腫瘤細(xì)胞,在膀胱癌治療中,能與化療[9]、放療[10]和免疫治療[11]產(chǎn)生協(xié)同抗腫瘤作用。

P-gp是藥物外排蛋白中的一種,其表達(dá)水平與細(xì)胞膜的通透性、細(xì)胞內(nèi)藥物濃度及耐藥程度有關(guān)[12]。P-gp可將細(xì)胞內(nèi)的毒性代謝產(chǎn)物泵出細(xì)胞,對(duì)組織細(xì)胞起保護(hù)作用,同樣P-gp亦可通過(guò)三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)提供的能量將已進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的藥物從胞內(nèi)泵出胞外,從而降低細(xì)胞內(nèi)抗癌藥物的濃度,使細(xì)胞毒性作用減弱或完全消失,使癌細(xì)胞產(chǎn)生耐藥現(xiàn)象。有研究表明,PDT聯(lián)合化療能特異性降低藥物外排蛋白的表達(dá)從而產(chǎn)生協(xié)同抗腫瘤作用[13-14]。Khdair等[15]以亞甲基藍(lán)為光敏劑介導(dǎo)的PDT抑制了P-gp導(dǎo)致的抗癌藥物的外排作用,從而增加了阿霉素在卵巢癌細(xì)胞中的細(xì)胞毒性。Huang等[16]的研究結(jié)果顯示,以苯并卟啉衍生物為光敏劑介導(dǎo)的PDT增加了前列腺癌細(xì)胞內(nèi)伊立替康的濃度,其機(jī)制為PDT降低了ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體G2的表達(dá),激活了細(xì)胞凋亡信號(hào)通路。Arentsen等[17]的研究表明,以二磺化四苯氯為光敏劑的PDT聯(lián)合博萊霉素在體內(nèi)可誘導(dǎo)協(xié)同抑制T24和AY-27膀胱癌細(xì)胞株生長(zhǎng),結(jié)果顯示PDT聯(lián)合博萊霉素治療效果顯著高于單一處理的治療效果。這些研究均說(shuō)明PDT在增強(qiáng)藥物治療和逆轉(zhuǎn)耐藥中的作用。本研究發(fā)現(xiàn)PDT聯(lián)合THP能使膀胱癌細(xì)胞P-gp表達(dá)降低,說(shuō)明聯(lián)合治療可通過(guò)下調(diào)藥物外排泵P-gp的表達(dá),改善藥物的耐藥性,使癌細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性增加,從而增強(qiáng)藥物的毒性作用。

Bcl-2和Bax在腫瘤細(xì)胞凋亡中具有重要的調(diào)控作用。Bax/Bcl-2比值越高細(xì)胞越易凋亡,相反Bax/Bcl-2比值低則細(xì)胞抗凋亡能力增強(qiáng)。P-gp作為MDR1基因的表達(dá)產(chǎn)物,除了具有藥物外排泵的功能外還可能存在抗凋亡作用,過(guò)表達(dá)的P-gp可通過(guò)抑制Bax/Bcl-2比值的升高及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3和9的活性,直接抑制細(xì)胞凋亡;也可以通過(guò)活化PI3K通路,間接抑制細(xì)胞凋亡[18]。Xu等[19]的研究表明,P-gp抑制劑維拉帕米類似物能夠促進(jìn)耐阿霉素的白血病細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn),與PDT組和THP組相比,PDT+THP組能夠協(xié)同降低P-gp蛋白的表達(dá),下調(diào)Bcl-2基因的表達(dá)、上調(diào)Bax基因的表達(dá),表明PDT聯(lián)合化療能夠改善藥物耐藥性,增加膀胱癌細(xì)胞凋亡易感性。

此外,一項(xiàng)體外研究顯示,在小鼠的肝癌細(xì)胞中,先用PDT處理后再用阿霉素處理與先用阿霉素處理再用PDT處理比較,其對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖抑制率提高了20%,其原因主要是由于阿霉素產(chǎn)生的細(xì)胞毒性作用使細(xì)胞對(duì)光敏劑的攝取減少[20]。因此本研究采用先用PDT處理再用THP處理的方式進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)HAL介導(dǎo)的PDT聯(lián)合THP對(duì)RT4和T24細(xì)胞具有協(xié)同殺傷作用,其機(jī)制可能與聯(lián)合治療后膀胱癌細(xì)胞的P-gp下調(diào)、Bcl-2基因表達(dá)下調(diào)以及Bax基因表達(dá)上調(diào),從而降低了癌細(xì)胞的耐藥性和促進(jìn)了癌細(xì)胞的凋亡有關(guān)。本研究未能在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步證明PDT聯(lián)合THP具有協(xié)同殺傷膀胱癌細(xì)胞的作用,這部分內(nèi)容有待于今后進(jìn)一步完善。