趙飛，李剛

海軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院 肝膽胰脾外科，上海 200433

肝癌是全球癌癥相關(guān)死亡的第三大原因，患者5年生存率約為18%[1]。手術(shù)切除仍然是治療肝癌的標(biāo)準(zhǔn)方式[2]。由于轉(zhuǎn)移早、進展快，患者在診斷時多為晚期而失去了手術(shù)的機會[3-5]。因此，迫切需要找到一種高效安全的替代療法來治療肝癌。

在過去的幾十年中，學(xué)者們對多種藥物遞送載體進行了實驗研究，例如脂質(zhì)體、合成納米顆粒等，且在包括肝癌在內(nèi)的許多癌癥治療中取得了進展[6]。然而，由于細胞毒性和血腦屏障等原因，此類遞送載體的應(yīng)用受到限制。同時，天然藥物遞送載體領(lǐng)域發(fā)展迅速，例如外泌體。外泌體是從活細胞釋放到細胞外微環(huán)境的30～150 nm大小的納米級囊泡[7]，既能傳遞miRNA和蛋白質(zhì)等生物活性物質(zhì)，又能介導(dǎo)細胞之間的通訊[8]，具有治療肝癌的潛力。外泌體載體綜合了細胞藥物遞送和納米技術(shù)的優(yōu)勢。與細胞療法相比，外泌體更容易儲存，并且安全性更高[9]；與納米顆粒相比，外泌體是自身細胞分泌的納米大小的囊泡，具有較低的毒性和較好的生物相容性[10-11]。然而，天然外泌體靶向性差，大部分進入體內(nèi)后，很容易被循環(huán)免疫系統(tǒng)快速清除或被非靶細胞吸收[12]，導(dǎo)致外泌體藥物的半衰期縮短。利用生物工程技術(shù)對外泌體進行改造，通過加載靶向肽和外源性分子等，提高外泌體的靶向性和穩(wěn)定性，通過功能裝載使其具備治療的潛力。在本綜述中，我們總結(jié)了修飾工程化外泌體的不同策略，包括表面修飾和功能裝載，以及工程化外泌體在肝癌治療中的研究進展。

1 工程化外泌體的設(shè)計策略

外泌體是細胞間通訊的重要參與者，可以反映親本細胞的生理和病理狀態(tài)的改變，它被證實在體液中穩(wěn)定存在，且能夠反映腫瘤的進展。因此，分析循環(huán)外泌體及其衍生物可能為癌癥液體活檢提供新的方法[13]。外泌體已經(jīng)在一些癌癥中展現(xiàn)出作為診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物的潛力[14-15]。近年來，外泌體作為載體在藥物遞送方面也展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。利用生物工程對外泌體進行改造修飾，從而實現(xiàn)治療的目的。目前，制備工程化外泌體主要包括表面修飾和功能裝載。表面修飾通過對供體細胞或外泌體進行修飾，可以提高外泌體的靶向性和穩(wěn)定性；功能裝載通過負載一種或多種具有治療作用的藥物和核酸等，實現(xiàn)對腫瘤組織的殺傷作用。

1.1 表面修飾

外泌體表面修飾有利于靶向運輸和增加穩(wěn)定性，表面修飾主要包括基因工程和化學(xué)修飾[16-17]。

基因工程是將靶向配體與選定的外泌體膜蛋白相融合，配體蛋白在供體細胞中過表達，繼而產(chǎn)生攜帶靶向配體的工程化外泌體?？缒さ鞍资峭饷隗w膜的一部分，其中包括溶酶體相關(guān)膜蛋白2（Lamp-2b）和CD63等，可以通過與靶向配體融合增強外泌體的靶向特異性[18]。將間充質(zhì)干細胞結(jié)合肽E7與外泌體膜蛋白Lamp 2b融合，形成具有靶向特異性的外泌體，相較于沒有E7的外泌體能誘導(dǎo)更高程度的軟骨分化[19]。CD63是另一種常用的與靶向配體相融合的外泌體膜蛋白。有研究通過將靶向配體Apo-A1與外泌體膜上的CD63相融合，經(jīng)過基因工程修飾的外泌體可以特異性靶向肝癌細胞，從而抑制肝癌在體外的增殖和遷移[20]。但基因工程操作復(fù)雜，并且容易影響原有膜蛋白的生物活性。

除基因工程外，化學(xué)修飾也是一種常用的表面修飾技術(shù)?；瘜W(xué)修飾是通過共價偶聯(lián)和非共價偶聯(lián)的方法將靶向配體偶聯(lián)到外泌體膜上，其中以共價偶聯(lián)方法更為常用。點擊化學(xué)作為一種重要的共價反應(yīng)已被廣泛用于外泌體的修飾[21]?；谠摬呗裕醒芯客ㄟ^點擊化學(xué)將外泌體膜與神經(jīng)皮素-1靶向肽（RGE）偶聯(lián)，獲得具有特異靶向神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的外泌體[22]。點擊化學(xué)反應(yīng)高效，它們可以在較短的時間內(nèi)快速反應(yīng)，但由于點擊化學(xué)反應(yīng)缺乏特異性，可能會影響外泌體膜上其他膜蛋白的功能。因此，需要精確控制點擊化學(xué)的反應(yīng)條件。另外，有研究通過共價偶聯(lián)外泌體膜蛋白的方法，將細胞穿透肽（CPPs）與肝癌細胞來源的外泌體相結(jié)合，增強了細胞內(nèi)的靶向遞送[23]。非共價修飾包括多價的靜電相互作用、配體-受體相互作用、疏水作用、基于核酸適配體的表面修飾和CP05肽錨定修飾，研究相對較少，仍需要進一步積極探索[24]。

1.2 功能裝載

作為藥物遞送載體，外泌體可以遞送親水性、親油性和兩親性的物質(zhì)[25]。目前，根據(jù)工程化對象的不同，外泌體的裝載策略可分為內(nèi)源性裝載和外源性裝載。

內(nèi)源性裝載是基于親本細胞的工程化裝載方式，首先對外泌體供體細胞進行工程化修飾，通過轉(zhuǎn)染和共孵育等方法將藥物導(dǎo)入供體細胞，供體細胞再將藥物裝載到分泌的外泌體中，從而獲得含有藥物的工程化外泌體。內(nèi)源性裝載只對供體細胞進行改造和修飾，而對分泌的外泌體不做處理，因此較好地保證了外泌體的完整性和生物學(xué)功能[26]。

外源性裝載是在分離好的外泌體中，直接將藥物裝載到外泌體的一種方法，主要應(yīng)用于一些小的核酸和治療藥物的裝載。相較于內(nèi)源性裝載，外源性裝載操作更加簡單，裝載效率也更高，但在裝載藥物的過程中可能會破壞外泌體的完整性，且需要額外的純化步驟去除沒有裝載的藥物。外源性裝載是目前最常用的外泌體裝載策略，主要包括電穿孔、超聲、擠壓和孵育等[27]。

2 工程化外泌體在肝癌治療中的應(yīng)用

外泌體是細胞分泌的納米級囊泡，由于其免疫原性低、生物相容性好以及可修飾性，成為藥物遞送的理想載體[28]?；谀壳暗难芯?，工程化外泌體用于惡性腫瘤治療主要有兩方面。一方面外泌體可以通過生物工程負載化學(xué)藥物、核酸等靶向到肝癌細胞中，通過改變腫瘤微環(huán)境來抑制腫瘤增殖和殺滅腫瘤細胞；另一方面外泌體可以作為治療性腫瘤疫苗，引發(fā)有效的抗腫瘤免疫反應(yīng)。

2.1 工程化外泌體靶向遞送藥物

外泌體由于其組織相容性好且可以負載化學(xué)藥物或治療性小RNA，有望成為新興的治療惡性腫瘤的方法。工程化外泌體已經(jīng)在許多癌癥研究中取得了良好的進展，相較于傳統(tǒng)的治療方式，工程化外泌體顯示出精確高效、低毒的特性。

2.1.1 工程化外泌體負載化學(xué)藥物用于肝癌的治療 化學(xué)藥物的許多靶點都在細胞內(nèi)，因此化學(xué)藥物需要穿過細胞膜才能發(fā)揮作用，由于水溶性差或過早的降解，化學(xué)藥物難以發(fā)揮預(yù)期的作用。作為理想遞藥載體的外泌體可以高效安全地遞送藥物，通過減少副作用從而改善預(yù)后[29]。Wang等[30]通過將青藤堿（SIN）負載在外泌體中，觀察到與游離SIN相比，負載在外泌體中的SIN在肝癌細胞中表現(xiàn)出更強的抑制作用。外泌體可以來源于不同的細胞，不同細胞分泌的外泌體有自己獨特的功能。Liang等[31]通過將化學(xué)藥物去甲斑蝥素（NCTD）包封在骨髓間充質(zhì)干細胞來源的外泌體中，與非外泌體負載的NCTD相比，治療效果得到顯著增強。此外，另一項研究將多柔比星（DOX）負載在腫瘤分泌的外泌體中[32]，顯示出對肝癌細胞和癌癥干細胞較強的細胞毒性。外泌體可以負載一種甚至多種藥物，對癌細胞發(fā)揮協(xié)同殺傷作用。Du等[33]構(gòu)建了一種負載鐵死亡誘導(dǎo)劑和光敏劑的外泌體，通過化學(xué)療法和光動力療法聯(lián)合使用，放大鐵死亡在腫瘤治療中的作用?；瘜W(xué)療法聯(lián)合光動力療法彌補了單一療法療效不足的缺點，并且由于聯(lián)合治療減少了毒性藥物的使用劑量，從而降低了毒副作用。

化學(xué)治療方案的成功很大程度上取決于高效和精確的藥物遞送，從而減少細胞毒性。外泌體通過工程化修飾可以負載多種藥物，實現(xiàn)共同遞釋，從而提升治療效果。協(xié)同治療是目前外泌體治療的熱點內(nèi)容，可以加強對癌細胞的殺傷，發(fā)揮更強的治療作用。

2.1.2 工程化外泌體負載核酸藥物用于肝癌的基因治療 這種治療效果取決于核酸藥物的靶向和遞送效率，其中核酸包括特異性DNA、mRNA和miRNA等，但核酸常帶負電且親水，不能直接穿透細胞膜，容易被酶降解，因此不能有效運輸?shù)郊毎衃34]，工程化外泌體可以負載核酸運輸?shù)郊毎?。此外，肝癌確診時多為中晚期而失去手術(shù)的機會，很多情況下只能通過經(jīng)動脈化療栓塞和藥物聯(lián)合治療[35]，但是藥物長期使用容易產(chǎn)生耐藥性，因此迫切需要提高肝癌對化學(xué)藥物的敏感性。一方面工程化外泌體可以在肝癌細胞中降低耐藥性，Xu等[36]研究發(fā)現(xiàn)，含有miRNA-451a的外泌體顯著降低了對紫杉醇的耐藥，通過抑制上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transformation，EMT），促進肝癌細胞的凋亡；另一方面工程化外泌體可以增強肝癌細胞對化學(xué)藥物的敏感性，Lou等[37]構(gòu)建了含有miR-199a修飾的外泌體，這種工程化外泌體被證實可通過mTOR途徑改善肝癌細胞對阿霉素的敏感性。總之，隨著工程化外泌體的不斷發(fā)展將為基因治療提供動力。

2.2 工程化外泌體作為治療性的腫瘤疫苗在肝癌治療中的應(yīng)用

最近，基于腫瘤特異性抗原的個體化疫苗已經(jīng)在乳腺癌和黑色素瘤中進行了研究，并取得了較好的進展[38-39]。肝癌由于組織內(nèi)部復(fù)雜的異質(zhì)性使得肝癌的個體化腫瘤疫苗治療效果不佳。癌癥免疫療法是一種新興的治療方式，旨在激活受損的免疫系統(tǒng)。腫瘤疫苗可以通過將腫瘤相關(guān)抗原或腫瘤特異性抗原與免疫佐劑一起遞送到抗原呈遞細胞中，激活腫瘤特異性免疫應(yīng)答，以引發(fā)有效的抗腫瘤免疫反應(yīng)，從而特異性殺傷腫瘤細胞[40]。因其強大而持久的抗腫瘤效果，一直是研究熱點之一。樹突狀細胞（DC）是癌癥疫苗載體的常用方法之一[41]，DC作為體內(nèi)抗原提呈能力最強的細胞，處于人體免疫應(yīng)答的中心環(huán)節(jié)，DC可以負載多種形式的腫瘤特異性抗原，如腫瘤裂解物、多肽、mRNA等，具有廣泛的免疫刺激活性，免疫應(yīng)答更持久。然而DC疫苗的生產(chǎn)成本較高且不易保存，DC衍生的外泌體含有親本細胞所必要的免疫刺激成分，常用于腫瘤免疫治療的無細胞腫瘤疫苗[42]。有研究發(fā)現(xiàn)，肝癌的靶向肽P47和AFP212負載到DC衍生的外泌體中，可以靶向到肝癌細胞中，并募集內(nèi)源性DC激活腫瘤抗原的交叉呈遞，形成強大的抗腫瘤免疫反應(yīng)，從而殺傷癌細胞[43]。DC衍生的外泌體保留了親本細胞的免疫刺激，是目前研究的重點，其他來源的外泌體，包括腫瘤細胞和各種免疫細胞亞群，也可能引發(fā)有效的抗腫瘤免疫反應(yīng)。

3 小結(jié)與展望

工程化外泌體包括表面修飾和功能裝載，分別賦予外泌體靶向性和裝載治療藥物的潛力。外泌體一方面作為理想的藥物載體，可以裝載化學(xué)藥物、核酸等，增強對肝癌細胞的殺傷作用和降低耐藥性；另一方面可以作為無細胞腫瘤疫苗，激活自身免疫系統(tǒng)和產(chǎn)生免疫記憶，從而清除腫瘤。目前許多動物實驗已經(jīng)證實工程化外泌體在肝癌治療中有顯著靶向治療作用，具有良好的應(yīng)用前景，但工程化外泌體仍然存在產(chǎn)量低、存儲難等問題。隨著生物工程技術(shù)的不斷發(fā)展，工程化外泌體在肝癌治療中的研究也將不斷推進。