孫 寧，付家琳，徐 澍，俞 曦，水映懿，于廣波，朱啟文

（ 1. 中國刑事警察學院，遼寧 沈陽 110034 ； 2. 安徽省銅陵市公安局，安徽 銅陵 244000 ；3. 大連外國語大學，遼寧 大連 116000 ； 4. 沈陽醫(yī)學院遼寧省行為認知重點實驗室，遼寧 沈陽 110034 ）

皮質醇是大多數哺乳動物（包括犬）的壓力標志物，可反映下丘腦-垂體-腎上腺（HPA）軸的活動[1]。大量研究證明了皮質醇測定衡量犬腎上腺皮質活動的可靠性和實用性，皮質醇在某種程度上已成為評估犬對壓力反應的黃金標準，并被認為是評估犬福利狀態(tài)的重要指標。皮質醇在機體內以化合物和游離的形式存在，血液循環(huán)中大部分皮質醇（超過90%）與轉運蛋白結合，約80%皮質類固醇與球蛋白結合（稱為CBG），10%與白蛋白非特異性結合，余下的5%~10%血漿皮質醇以未結合的生物活性形式循環(huán)，以游離狀態(tài)存在，即游離皮質醇。對壓力應激反應的血漿皮質醇濃度增加主要發(fā)生在游離皮質醇，只有游離皮質醇才能夠對靶細胞發(fā)生作用。

游離皮質醇分子小、親脂性強，廣泛存在于身體中各處，因此血液、唾液、尿液、頭發(fā)和糞便均可作為測量皮質醇的介質。在血液和唾液中，皮質醇變化可在數分鐘甚至數秒鐘檢測到，適合監(jiān)測短期壓力；糞便和尿液可反映數小時甚至數天皮質醇的分泌狀況；毛發(fā)樣本中皮質醇水平可測量數周甚至數月的激素含量，適合監(jiān)測長期壓力。不同介質的皮質醇測定存在相關性，也具有相似之處和相對可行性。隨著人們對犬的福利狀況愈發(fā)重視，各種犬皮質醇的測定方法不斷發(fā)展并逐漸完善，犬的皮質醇已經成為衡量犬壓力的一種可視化檢測方式。本文通過國內外對血漿皮質醇、唾液皮質醇、糞便皮質醇和毛發(fā)皮質醇等4種犬皮質醇檢測方法的研究進展進行匯總，探究應用于犬的皮質醇測定方法，為改善犬的福利以及工作犬的性能提升提供參考。

1 皮質醇檢測方法

1.1 血漿皮質醇

早期研究大多測量血漿中皮質醇濃度，現(xiàn)已趨向成熟并得到廣泛應用，對于診斷和監(jiān)測犬的腎上腺皮質功能異常非常重要?；谘簶颖咎崛∑べ|醇是傳統(tǒng)的測定皮質醇濃度的方法，因此血漿皮質醇測量被視為“金標準”，不僅用于評估壓力反應，也被視為判斷其他樣本介質皮質醇濃度的標準。采集血液樣本具有方便、快捷的特點，能夠即時地反映特定狀態(tài)下機體的皮質醇濃度。但血液取樣存在一定局限性，取樣過程中所采取的對犬的約束和處理可能成為壓力源本身，從而影響皮質醇濃度；采用靜脈抽血等損傷性手段本身會對動物造成不同程度的傷害；檢材的采集、保存要求較高。因此，目前多采用侵入性較小的措施檢測機體內皮質醇濃度。

1.1.1 樣本采集

1.1.1.1 采集時間點（與刺激源的時間差）

一般在壓力源發(fā)生10~20 min 后采血，確定該采集時間是因為犬血液皮質醇濃度遇到壓力源后約20 min 達到峰值，在噪音刺激開始后約11 min 達到峰值，30 min 后恢復到基礎水平。人類遇到壓力源后20~40 min 達到峰值，具體的精準時間取決于壓力持續(xù)時間和壓力性質。

1.1.1.2 采集方法

犬頭靜脈靜脈采血3~4 mL，血樣收集到含肝素或EDTA 的試管，立即將樣品置于冰上，離心收集血漿，-20 ℃儲存直至分析。采血時間應盡量快，以確保皮質醇水平不會因采血過程的刺激而升高。整個采樣過程需在2 min內完成，避免影響唾液皮質醇結果。

1.1.2 保存

采集后樣品應立即送檢，不宜長期保存，原因是標本在離體環(huán)境中時間過長，血清中的皮質醇濃度或活性可能降低。盡管室溫條件下犬血漿中的皮質醇具有穩(wěn)定性[1]，但在-20 ℃或更低的溫度下冷凍血清或血漿是一種理想的儲存方法。此外，儲存過程中要避免反復凍融，商業(yè)ELISA試劑盒手冊明確警告避免凍融循環(huán)，因為反復凍融樣品可能會影響血清或血漿中激素的穩(wěn)定性。

1.1.3 測定方法

犬皮質醇的檢測方法常使用放射免疫分析法（RIA）、酶免疫分析法（EIA）和液相色譜-質譜聯(lián)用法（LC-MS/MS）等方法，以EIA 中酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）被廣泛使用。目前測定皮質醇通常使用商業(yè)試劑盒，可用于檢測血液、糞便、唾液、尿液中的皮質醇濃度。

1.2 唾液皮質醇

在犬類研究中使用唾液皮質醇很普遍，雖然血液和唾液均可作為犬急性應激的壓力標志物，但通常認為唾液皮質醇測量是一種比血漿皮質醇更好的方法，因為唾液采樣相對簡單、非侵入性，故經常用于犬監(jiān)測短期壓力變化。唾液能夠最準確地反映腎上腺皮質反應，主要原因是唾液皮質醇濃度直接受血漿中游離皮質醇濃度的影響，唾液中的皮質醇基本是血漿游離皮質醇在唾液腺腔腺泡細胞中被動擴散的結果[2]。皮質醇從血漿到唾液的轉移非常迅速（<2 min），靜脈注射的皮質醇不到1 min 就會出現(xiàn)在唾液中。犬唾液皮質醇濃度與血漿濃度存在強烈的正相關性[3]。但唾液采樣的一個潛在缺點是唾液皮質醇濃度遠低于血液，因此，測定唾液皮質醇需要采用比測定血漿皮質醇更靈敏或更合適的測量技術以及更多的唾液采集量。

1.2.1 樣本采集

1.2.1.1 采集量

唾液皮質醇濃度通常約為血漿濃度的7%~10%，因而用于測定的唾液量需為血漿皮質醇測量的10倍以上，過少的樣品會導致從吸收性材料中提取的皮質醇過低。為保證結果有效性，建議盡量采集多量樣本，一般檢測方法只需25 μL唾液即可進行皮質醇測定。

1.2.1.2 采集方法

唾液采樣的方式各有不同，包括犬咀嚼拭子、拭子在犬口腔內保持不動或在不同位置（舌頭、牙齦、硬腭、頰部）摩擦。文獻報道了多種收集犬唾液的方法，但尚未確定一種標準操作。犬不喜歡口腔內的收集物，收集到的犬唾液量不足，為克服這個問題已嘗試了幾種刺激犬唾液分泌的方法。食物引誘方法刺激唾液分泌很方便，如給犬嗅聞奶酪或采用乙酸、蔗糖、氯化鈉、牛肉味棉簽[4]等。使用檸檬酸刺激犬唾液分泌是使用最廣泛的方法，可將一些檸檬酸顆粒灑在犬的舌頭上或用浸過檸檬酸的棉簽擦拭犬的口腔和牙齦[5]。具體方法為：收集唾液前用浸有5%檸檬酸的棉簽擦拭犬的口腔，將海綿放入口腔1 min后取出，能夠吸收100~1 000 μL唾液。

但由于犬的唾液具有保護個體免受酸性物質侵害的緩沖作用，采用檸檬酸鈉顆粒刺激唾液分泌會影響唾液皮質醇濃度。研究表明，僅0.1 g/mL的檸檬酸即可引起唾液pH 值顯著下降，唾液皮質醇濃度顯著升高。最近研究表明，蘸有生姜的棉簽可強烈刺激犬唾液分泌，收集時間僅30 s（訓練有素的獸醫(yī)也很難將棉簽放在犬口腔堅持2 min），可采集到足夠量的唾液（>400 μL）[6]。

1.2.1.3 采集材料

采集材料也是影響能否收集到足夠唾液的重要因素，采樣過程中不僅要吸收大量唾液，還應能夠回收所吸收的唾液。從犬的口腔中收集唾液的采集材料最常用的有紗布、海綿、棉簽、繩子等；較常用的方法是濾紙法，一般將濾紙放置犬舌下或口腔內，直到唾液徹底浸透濾紙。但從濾紙?zhí)崛∑べ|醇的過程較煩瑣，需用乙醚從濾紙上提取皮質醇，再用二乙醚溶解、離心、蒸發(fā)、二次蒸發(fā)、加緩沖液等[7]，且樣品蒸發(fā)耗時，乙醚具有副作用和毒性，需要特殊準備防毒面具、化學防濺鏡等實驗室安全防護設備。

一些報告稱，棉質材料唾液的回收率相對較低，尤其是在從犬口腔里吸收的唾液量低的情況下。而使用聚酯纖維對吸收唾液的效果較好，能夠收集唾液的（54.7±2.3）%，在離心后可以回收（95.8±1.1）%的唾液[8]。但也有報道，用棉拭子或聚酯拭子獲取犬的唾液量無差異。近年來，眼海綿被認為是一種有效收集唾液用于成年人皮質醇測定的新材質，柔軟無味，可收集足夠的唾液進行皮質醇測定?，F(xiàn)已有市售配套棉或聚酯拭子的特殊試管。

1.2.1.4 采集時間點（與刺激源的時間差）

目前關于唾液取樣的理想時間存在一些爭議。與血液相比，唾液皮質醇濃度峰值出現(xiàn)時間稍有延遲，Beerda等[9]卻檢測到唾液皮質醇濃度峰值與血漿相比沒有延遲。產生差異的原因可能在于是否將全血清或血漿濃度與唾液進行比較，因為唾液僅含有皮質醇的游離部分。有研究顯示，與血液中皮質醇的峰值濃度相比，唾液中的皮質醇峰值濃度滯后不到2~3 min[10]。因此一般在壓力刺激21~23 min后開始采集，此時唾液濃度達到峰值。

1.2.1.5 采集時間

與采集的要求相似，整個采樣過程需在4 min內完成。大部分研究認為采樣時間應為30~60 s，犬能夠保持安靜和配合，但也有部分犬在采樣過程中煩躁不安，取樣斷斷續(xù)續(xù)。一般采集拭子固定在口腔中的一處停留而非反復摩擦（這可能使犬更興奮），采樣比較快速而順利。

1.2.2 提取和保存

不同研究中樣本的離心條件差異較大[8]，如離心速率2 800~4 000 r/min，離心時間0~45 min，離心后保存條件為冷凍-20 ℃或-80 ℃。唾液中的皮質醇相對穩(wěn)定，可在室溫下放置數小時甚至數天，但樣品細菌生長會降解皮質醇，因此應在收集后盡快冷凍樣本。唾液含有黏蛋白，在測定前冷凍樣品和離心（12 000 r/min 離心10 min）可降低唾液樣品的黏度，使其更容易移液，也能夠避免可能存在的顆粒物質（如食物殘渣）的污染。

1.2.3 測定方法

樣品在室溫下解凍，6 000 r/min 離心10~20 s，使用移液器從離心管底部收集唾液。由于皮質醇的唾液濃度通常比血漿濃度低10倍，若使用血漿或血清的商業(yè)試劑盒需要調整以適應唾液皮質醇。

1.3 糞便皮質醇

糞便皮質醇其實是糞便皮質醇代謝物（FCM）。因為皮質醇在肝臟中代謝快，其代謝物通過膽汁排泄到腸道中，糞便中無法發(fā)現(xiàn)皮質醇本身，因此使用FCM測量腎上腺皮質的活動[11]，本文中暫且稱為糞便皮質醇。

糞便皮質醇測定具有很多優(yōu)點，如糞便可很容易地在不侵擾犬的情況下在犬舍和自然環(huán)境中采集，采樣程序對測量的皮質醇濃度無影響。此外，與采集血樣相比，糞樣中的皮質醇變化具有長期特征，可反映某個時間段內（犬為20~28 h[12]）的平均皮質醇濃度，而非某一時刻的脈沖值，不受某一時間點的應激條件影響。此外，糞便可長期、連續(xù)地采集，對于研究某些生理特征及動態(tài)是一種便捷有效的非損傷性方法，利于對犬的生理狀況進行長期監(jiān)測。

但糞便皮質醇濃度受諸多因素影響，包括在肝臟中的代謝、通過胃腸道的時間、細菌分解、食糜質量、食材類型以及樣本收集、保存程序。因此，糞便樣本收集和儲存的標準操作程序對于檢測結果至關重要。

1.3.1 樣本采集

1.3.1.1 采集時間點（與刺激源的時間差）

皮質醇在糞便中的代謝有滯后性，即應激的發(fā)生與糞便中出現(xiàn)皮質醇代謝物之間存在滯后時間，糞便的采集時間需依據滯后時間方可相對精準地與應激壓力源對應。正常情況下，糞便皮質醇與血液皮質醇濃度正相關，但二者會呈現(xiàn)分泌高峰時間不一致的現(xiàn)象。因為血液中的皮質醇在肝臟與蛋白相結合，以代謝物的形式經腎進入尿液排出或經膽汁進入腸道通過糞便排出，在腸道階段激素又可被重吸收進入肝腸循環(huán)，整個過程使糞便中的皮質醇濃度滯后于血漿皮質醇濃度。使用放射性皮質類固醇示蹤劑（如14C-皮質醇）能夠準確地確定滯后時間。Schatz等[13]研究了犬的14C-皮質醇的代謝，犬糞便中皮質醇激素的峰值發(fā)生在（24±4） h后，在48 h后恢復到基礎水平。

1.3.1.2 采集量

一般檢測需要糞便0.2~0.5 g，但也有報告稱樣本量小于0.05 g時結果會產生偏差[14]。

1.3.2 保存

糞便中含有大量微生物，若不及時處理，糞樣中類固醇激素的代謝產物會被自身及外界的微生物分解，樣品保存應做適當處理以減少影響，比如冷凍、冷凍干燥、加熱干燥、二氧化硅干燥或儲存在乙醇（90%~95%）、福爾馬林（10%）、乙酸（2%）和氫氧化鈉（2%）中。因為水會支持細菌酶的活性，為盡量減少由于細菌作用導致的糞便樣本變化，樣品最好是排便后盡早收集，采集后立即冷凍、凍干，-20 ℃儲存直至分析。此外，如果冷凍樣品在40 ℃下緩慢解凍，與在95 ℃下更快解凍相比，皮質醇濃度會增加。

1.3.3 提取

糞便代謝物是幾種具有不同極性的代謝物的混合物，在皮質醇測定之前需要進行提取。到目前為止，甲醇對皮質醇的提取率最高。Farca 等[15]分別用二乙醚和甲醇提取犬的糞便皮質醇，二乙醚和甲醇提取物的回收率分別為（23.2±2.0）%和（89.0±6.0）%。提取犬糞便皮質醇方法推薦的程序是：冷凍糞便在37 ℃培養(yǎng)箱中干燥72 h，因皮質類固醇在糞便中分布不均勻，故再將干糞便樣本粉碎均勻。提取時首先稱量一定質量的均質糞便（如0.5 g），用固定體積的80% 甲醇（如5 mL）萃取，振蕩30 min，2 500 r/min離心15 min后取上層清液待測定。

1.3.4 測定方法

提取后，將樣品離心20 min，取1 mL 上清液在空氣流下干燥。首先加入50 μL 的100%乙醇，加入1 mL 磷酸鹽緩沖液PBS，對干燥的提取物進行復溶，等待測定。有研究表明，犬糞便代謝物中的皮質醇EIA最適合監(jiān)測腎上腺皮質活動的變化[16]。

1.4 毛發(fā)皮質醇

毛發(fā)皮質醇測定是一種近年流行的壓力生物標志物評估方法。毛發(fā)采集非侵入性，取樣輕松，價格低廉，材料來源豐富，還可常溫保存至數月甚至數年，具備比其他皮質醇測定方法更多優(yōu)勢。如毛發(fā)皮質醇比血漿和唾液皮質醇測量的侵入性更??；比血漿、糞便或唾液中的皮質醇更能夠指示長期或慢性壓力源，血漿、唾液和糞便評估的是1 d 內的急性應激源，而毛發(fā)中的皮質醇含量會隨著毛發(fā)的毛囊生長反映前幾周至幾個月的壓力活動，能夠評估犬的慢性壓力水平；毛發(fā)采樣比唾液或糞便更省力，唾液和糞便皮質醇需要在多個時間段收集更多的樣本，而且4個糞便樣本才能夠達到1個毛發(fā)樣本相同的可重復性水平，避免了重復采樣，結果更穩(wěn)定。

與唾液、糞便等中的皮質醇相比，毛發(fā)中的皮質醇濃度不易受到晝夜節(jié)律、個體本身或外界一些因素的影響。Bennett等[17]報道，年齡、品種、體重或絕育對犬毛發(fā)皮質醇無顯著影響，支持了毛發(fā)皮質醇成為比較個體特征（如對慢性壓力的恢復力）的工具。頭發(fā)皮質醇在取樣、測量和分析等方面的優(yōu)勢確保了其應用于慢性壓力研究的可靠性。雖然毛發(fā)樣本是一種量化長期皮質醇濃度的實用且有效的方法，但皮質醇進入毛發(fā)的機制尚不完全清楚。目前普遍被接受的是由Vassiliki 等[18]提出的假說，認為游離皮質醇會通過血液運輸穿過毛細血管壁，通過被動擴散到毛囊并摻入毛干的角蛋白基質中，再沿著發(fā)軸生長方向擴散運輸至發(fā)梢部位。一些研究表明，犬的毛發(fā)顏色會影響皮質醇濃度，黑色犬的毛發(fā)皮質醇濃度較低，深色毛發(fā)的皮質醇濃度低于淺色毛發(fā)，有時同一頭犬身上不同顏色的皮質醇濃度也存在差異。目前認為原因是犬的黑色毛發(fā)中含有黑色素，黑色素與皮質醇等中性化合物結合較少。

最有爭議的是毛發(fā)皮質醇濃度是否隨著毛發(fā)的生長而變化，有研究表明，犬緊貼皮膚處（新生毛發(fā)）和毛末端（舊毛發(fā)）皮質醇濃度無差異。盡管犬毛發(fā)皮質醇檢測相對處于起步階段，但犬的毛發(fā)與唾液和糞便皮質醇濃度之間的正相關性已得到證明。Mack等[19]對從犬指甲和毛發(fā)樣本中測量的皮質醇進行比較，發(fā)現(xiàn)這兩種方法存在顯著正相關。毛發(fā)皮質醇測定是衡量犬慢性壓力的非常的潛力的評估方法。但目前毛發(fā)皮質醇的研究仍處于不成熟的階段，需要深入研究。

1.4.1 樣本采集

1.4.1.1 采集部位

人類的頭發(fā)采樣部位比較一致，位置在腦后頂點，取樣盡可能接近頭皮。犬的采樣部位多為薦部（坐骨區(qū)）、肩部、胸部（劍突區(qū)）和腿部（內側），同一只犬的左肩和右肩采樣的毛發(fā)皮質醇濃度沒有差異。

1.4.1.2 采集量及采集方法

一般使用電動剃須刀或剪刀采集犬毛發(fā)，皮質醇分析需約250 mg的毛發(fā)（最少7~50 mg）。采集毛發(fā)時，對于是否帶有毛囊連根拔起盡管還存有疑議，但大部分研究的毛發(fā)樣本中均不含毛囊。Gow等[20]建議不要拔毛，認為拔毛會帶有毛囊，毛囊中的皮質醇可能會混淆毛干中皮質醇的濃度。毛囊本身會在局部產生皮質醇，與下丘腦-垂體-腎上腺軸全身應激反應相協(xié)調合成皮質醇[21]。

1.4.2 清洗

在檢測前清洗毛發(fā)樣本是一種很好的做法，旨在去除毛發(fā)外部的污染物。在不影響內部皮質醇濃度的情況下，使用異丙醇清洗2 次，每次洗滌3 min 是去除污染源的最有效方法[22]。這種預提取洗滌程序已被許多研究采用，具體方法是：稱重250 mg頭發(fā)樣品，置入15 mL聚丙烯管中，加入5 mL異丙醇，輕輕搖動試管3 min清洗。該程序重復2次，在室溫下干燥毛發(fā)樣品7 d。

1.4.3 剪碎/研磨

為增加從毛干中提取皮質醇的比例，大部分研究在測定前將毛發(fā)剪碎或研磨。毛發(fā)皮質醇的提取取決于頭發(fā)的粒度，粒度越高，提取的皮質醇的濃度就越高。剪碎是指將毛發(fā)的長度精細切割至約1 mm，檢測結果差異性較大；而研磨則用球磨機產生細粉和均質的毛發(fā)顆粒，皮質醇水平是剪碎毛發(fā)的3.5 倍，可最大限度地提高皮質醇的提取量。因此，研磨頭發(fā)是毛發(fā)皮質醇制備的優(yōu)選方法。具體方法是：將50 mg 的毛發(fā)樣品精細切成小段（>1~2 mm），使用球磨機（30~50 Hz，8~10 min）研磨成粉末。

1.4.4 提取

測定前必須采用有機溶劑提取毛發(fā)角蛋白基質中的皮質醇。提取通常包括將毛發(fā)粉末或片段與甲醇混合，室溫和50 ℃之間孵育過夜至24 h。具體方法是將毛發(fā)樣品浸入1.5 mL 的無水甲醇中（20 ℃，24 h），3 000×g 離心5 min，吸取0.6 mL 上清液，置于培養(yǎng)箱中孵育（50 ℃，18 h），干燥以蒸發(fā)甲醇，加入試劑盒中提供的0.2~0.4 mL緩沖液[23]。

1.4.5 測定

與唾液皮質醇的方法相似，毛發(fā)皮質醇濃度通常很低，所以測定靈敏度是測定的關鍵。液相色譜—質譜聯(lián)用法（LC-MS/MS）在犬毛發(fā)皮質醇測定中經常使用，確定犬毛中是否存在皮質醇的“金標準”。2004年，Raul等[24]使用LC-MS/MS報告了人類頭發(fā)中的皮質醇。Bryan等[25]使用了LC-MS/MS 測量犬毛中的皮質醇。具體方法為提取100 mg 毛發(fā)粉末樣品，用20 μL 氘代皮質醇作為內標（每次進樣800 pg），與甲醇混合，并在室溫和50 °C 之間孵育過夜，加入50 μL 甲醇和50 μL 水復溶，14 000×g 離心10 min，提取40 μL注入LC-MS/MS系統(tǒng)。

2 影響皮質醇測定的因素

皮質醇檢測結果受個體差異、檢測方法程序和具體環(huán)境等因素的影響。因為皮質醇反應通過復雜的途徑調節(jié)，受到個體差異、晝夜節(jié)律波動以及壓力源強度和以往經歷等諸多因素的影響，需要在犬皮質醇測定中加以考慮，以增加檢測結果的可靠性。

2.1 晝夜節(jié)律

在人類和其他一些哺乳動物中，皮質醇濃度會受到晝夜節(jié)律波動的影響，尤其是對急性壓力更為敏感的血液皮質醇、唾液皮質醇。在非壓力條件下，健康成年人在早晨血漿皮質醇濃度最高，之后逐漸降低至午夜時最低，犬是否存在皮質醇晝夜波動規(guī)律尚未達成共識。

一些研究發(fā)現(xiàn)了犬皮質醇晝夜變化的證據，如Palazzolo[26]的研究認為，成年犬的血漿皮質醇中存在晝夜節(jié)律，但在老年犬血漿中未檢測到24 h 內存在顯著變化，幼犬中不存在血漿皮質醇的晝夜節(jié)律。杜鳳鳴等[27]發(fā)現(xiàn)，犬8：00時血漿皮質醇濃度最高，12：00、16：00、20：00:逐漸下降，24：00最低，翌日4：00回升，8：00再次升至最高。

但更多的研究表明，犬血漿中可能根本不存在這種晝夜模式。有研究指出，犬似乎沒有明顯的晝夜皮質醇節(jié)律，在24 h 內每小時測量比格犬，并未發(fā)現(xiàn)犬唾液皮質醇濃度之間的差異[3]。還有研究發(fā)現(xiàn)，每日3 次采集結果顯示犬唾液皮質醇沒有出現(xiàn)系統(tǒng)性的晝夜節(jié)律差異。在持續(xù)30 d，每隔20 min 采集一次血漿的試驗中，皮質醇濃度晝夜節(jié)律均不明顯[28]。

無論犬的皮質醇濃度是否存在晝夜波動，每天犬正?；顒訒r的皮質醇濃度波動確實會發(fā)生，如運動或其他體力消耗等，均為正常應對應激的腎上腺激素釋放，可采用測量長期壓力的毛發(fā)皮質醇檢測方法消除1 d中皮質醇濃度自然波動的影響。

2.2 個體差異

犬類對于壓力在行為和生理上的反應，在個體間差異很大。即使是同一品種的不同個體，也可能由于性別、年齡、健康、氣質、過去經歷等因素影響到皮質醇反應。

2.2.1 年齡差異

年齡對犬皮質醇濃度的影響不可忽視，然而關于年齡和皮質醇濃度的關系尚未得到廣泛證實，仍然存在不少爭議。有研究認為，小于6月齡幼犬的皮質醇濃度低于成年犬及大于8歲的老年犬[29]。Sandri等[30]的研究中統(tǒng)計分析了不同年齡的犬的皮質醇濃度，結果顯示，老年犬的唾液中皮質醇濃度更高。Rothuizen等[31]研究結果顯示，犬血液中的皮質醇濃度隨著年齡呈周期性的增長。Jamie等[32]的研究顯示，犬的性格隨著年齡的增長會逐漸穩(wěn)定，對刺激的生理和心理反應也會趨于穩(wěn)定，年齡大的犬對壓力可能會表現(xiàn)較低的皮質醇反應。但在Mongillo 等[33]的試驗中卻沒有觀察到犬的血漿皮質醇濃度在成年前和成年后存在明顯的變化。因此在分析研究中應盡量避免年齡的差異給犬帶來的干擾，不應將年齡差異較大的犬皮質醇濃度進行匯總或直接比較。

2.2.2 品種差異

犬的種屬特異性可能會影響犬對環(huán)境刺激的反應性，不同品種個體的應激反應可能不同。同一條件下，羅威納犬和德國牧羊犬的唾液皮質醇濃度明顯高于杜賓犬和比利時牧羊犬，羅威納犬表現(xiàn)出刻板行為的次數更高[34]。不同氣質類型的犬對外界刺激的反映程度也存在差異，皮質醇濃度變化也存在差異，越膽小的犬可能越需要更長的時間適應新環(huán)境帶來的焦慮和壓力，高濃度皮質醇也可能因此持續(xù)更長的時間。由于犬之間的個體差異，建議盡可能統(tǒng)一其他潛在的變異來源，如年齡、性別、絕育、氣質和以前的經歷等因素。此外，保證足夠的樣本量對于彌補犬的個體差異也很必要。

2.2.3 各種測定方法的差異

各種方法測定犬皮質醇的有效性在試驗中已得到驗證，盡管不同方法測定的皮質醇濃度存在很強的相關性，但不同方法中的數值差別較大。同一只犬在同一條件下，糞便皮質醇濃度為（363.0±12.9） ng/g，唾液皮質醇濃度為（1.42±0.06） μg/L，毛發(fā)皮質醇濃度為（11.6±0.8） ng/g[35]。采用同一檢測方法，采樣、提取和儲存方法及檢測程序不同時，測量濃度范圍也存在顯著差異[36-37]。如測量毛發(fā)皮質醇濃度時，Bryan等[25]研究測得濃度為11.6 ng/g，有相似的實驗結果（分別為10.9 ng/g 和9.8 ng/g），也存在差異較大的結果（2.10 ng/g）。此外，皮質醇濃度各介質的度量單位常表示為：毛發(fā)（ng/g），唾液（μg/L 或nmol/L），糞便（ng/g），血漿（nmol/L或μg/L）；單位換算關系是：1 nmol/L=0.362 47 μg/L（皮質醇分子量為362.47）。各文獻中使用的皮質醇濃度單位并不統(tǒng)一，故有必要對皮質醇濃度統(tǒng)一單位，便于比較研究。

目前，皮質醇檢測方法仍缺乏標準化的程序和對比試驗，因此采用各種檢測方法之間進行交互的方法學驗證非常有必要，《免疫測定手冊》可作為測定開發(fā)和驗證的指南[38]。除了方法學驗證外，還可采取生物學驗證。生物驗證有時被認為是對自然壓力源的反應，有時是對腎上腺皮質活動的藥理操作（如外源性促腎上腺皮質激素）的反應。在實踐中可結合犬暴露在各種壓力源下的反應，如噪音、新環(huán)境、運輸、惡劣條件等壓力源，測量犬的皮質醇濃度變化，評估壓力反應與皮質醇濃度的相應性，以犬的壓力反應驗證皮質醇檢測結果，實現(xiàn)皮質醇的檢測用以評估和提高犬福利狀態(tài)的終極目的。

3 結論

綜上所述，各種測量皮質醇的檢測方法各具特點，其有效性在試驗中已得到驗證。本文對血漿皮質醇、唾液皮質醇、糞便皮質醇和毛發(fā)皮質醇等4種犬皮質醇檢測方法的優(yōu)缺點以及每種檢測方法的采集、提取、測定等進行綜述。皮質醇檢測應用于評估犬壓力的研究方興未艾，該領域需要進一步深入探索，建議犬皮質醇檢測結果可采用方法學和生物學驗證，采用犬的壓力反應驗證皮質醇檢測結果，以驗證皮質醇作為評價動物福利的可靠指標，更精準地評估和提高犬福利狀態(tài)。