孫洪洋 劉文波 姜陽 王婷 張穎 楊欣

隨著近年來國內(nèi)外相關(guān)研究的日益深入，不少學(xué)者發(fā)現(xiàn)孕早期胎兒頸項透明層（NT）厚度可能和先天性心臟?。–HD）存在密切相關(guān)，其中NT 厚度作為早期篩查CHD 的重要指標(biāo)已在國內(nèi)得到應(yīng)用和普及[1-3]。此外，程序性壞死屬于調(diào)節(jié)性細胞死亡方式之一，其中受體相互作用蛋白激酶1（RIPK1）屬于程序性壞死關(guān)鍵性因子，其中RIPK1-RIPK3-MLKL 通路的異常激活會促進程序性壞死的發(fā)生，而程序性壞死在多種心臟疾病的發(fā)生、發(fā)展中均發(fā)揮著關(guān)鍵性作用，由此推測RIPK1 可能具有一定的預(yù)測胎兒CHD 價值[4]。microRNA 是近年來所發(fā)現(xiàn)一類新型非編碼單鏈RNA，且在心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中扮演著重要的角色，可能參與了心臟發(fā)育、心臟形態(tài)變化及心肌細胞生長、分化的調(diào)控過程[5]。鑒于此，本文通過研究胎兒NT厚度超聲檢測聯(lián)合母體外周血單核細胞（PBMCs）RIPK1、miR-22-3p 表達篩查胎兒CHD 的價值，以期為臨床胎兒CHD 的防治工作開展提供指導(dǎo)依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析2019 年2 月-2021 年2 月于佳木斯市中心醫(yī)院接受規(guī)律性產(chǎn)檢，且隨訪明確胎兒伴有CHD 的41 例孕婦為研究組，另取同期于醫(yī)院接受規(guī)律性產(chǎn)檢，且隨訪明確胎兒無CHD的41 例孕婦作為對照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）所有胎兒均經(jīng)超聲檢查確診[6]；（2）孕婦年齡20～40 歲；（3）無臨床病歷資料缺失。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）神志異?；蚝喜⒕窦膊?；（2）未遵循規(guī)定時間體檢或檢查/診斷依從性較差；（3）伴有其他部位畸形；（4）合并肝、腎等臟器嚴(yán)重障礙。本研究獲準(zhǔn)于醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會。

1.2 方法（1）NT 厚度檢測：檢測時間為孕早期，協(xié)助孕婦取仰臥位，保證腹部完全暴露，之后由醫(yī)院影像科醫(yī)師采用GE-E8 超聲診斷儀（探頭頻率為3.5～5.0 MHz）于二維模式下開展超聲檢測。選取胎兒面部正中矢狀切面，胎兒呈自然俯屈位，完成頭臂長的測量。之后放大圖像促使超聲聲束和胎兒體表呈垂直角度，顯示胎兒頭部和上胸部，暴露胎兒丘腦及菱腦，清晰顯示胎兒背部皮膚，于頸部皮膚高回聲帶的深部顯示無回聲或低回聲帶記作NT。測量過程中務(wù)必連續(xù)測量3 次，以厚度最大值作為最終結(jié)果。（2）PBMCs RIPK1、miR-22-3p 表達檢測：分別采集所有孕婦孕早期空腹靜脈血3 mL，離心處理后分離血漿，并滴加淋巴細胞分離液（購自達科為生物技術(shù)股份有限公司），以梯度離心法采集PBMCs，隨后加入TRIzol 試劑（購自美國Invitrogen）充分裂解，保存至-80 ℃冰箱中備用。通過實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）獲取PBMCs 的總RNA。之后采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（購自瑞士羅氏公司）合成獲取cDNA。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參，通過cobas z480 全自動熒光定量PCR 分析儀（購自瑞士羅氏公司）檢測RIPK1、miR-22-3p mRNA 相對表達量。擴增條件如下：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s。溶解反應(yīng)條件如下：95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。以2-△△Ct法計算相對表達水平。

1.3 觀察指標(biāo)及判定標(biāo)準(zhǔn) 比較兩組NT 厚度及PBMCs RIPK1、miR-22-3p 表達水平，且以隨訪結(jié)局作為金標(biāo)準(zhǔn)，分析NT 厚度及PBMCs RIPK1、miR-22-3p 表達水平對胎兒CHD 的診斷效能。NT厚度＞2.5 即判定為CHD；PBMCs RIPK1＞1.30 即判定為CHD；miR-22-3p＜1 即判定為CHD。三項聯(lián)合檢測即任意一項陽性即為CHD，三項均為陰性即為非CHD。敏感度=真陽性例數(shù)/（真陽性+假陰性）例數(shù)×100%；特異度=真陰性例數(shù)/（真陰性+假陽性）例數(shù)×100%；準(zhǔn)確度=（真陽性+真陰性）例數(shù)/總例數(shù)×100%。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 數(shù)據(jù)處理方式由SPSS 22.0 軟件完成，計量資料采用（±s）表示，比較采用獨立樣本t檢驗；計數(shù)資料用率（%）表示，比較采用χ2檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料比較 研究組年齡20～40歲，平均（28.31±1.39）歲；孕周11～14 周，平均（12.31±0.35）周；受教育年限9～16 年，平均（12.31±1.36）年。對照組年齡20～40 歲，平均（28.40±1.45）歲；孕 周11～14 周，平 均（12.35±0.37）周；受教育年限9～16年，平均（12.36±1.37）年。兩組一般資料比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 兩組NT 厚度及母體PBMCs RIPK1、miR-22-3p 表達水平對比 研究組NT 厚度和PBMCs RIPK1水平均高于對照組，而PBMCs miR-22-3p 水平低于對照組（P＜0.05），見表1。

表1 兩組NT厚度及PBMCs RIPK1、miR-22-3p表達水平比較（±s）

表1 兩組NT厚度及PBMCs RIPK1、miR-22-3p表達水平比較（±s）

2.3 NT厚度及PBMCs RIPK1、miR-22-3p 表達水平對胎兒CHD 的診斷情況對比 以隨訪結(jié)局作為金標(biāo)準(zhǔn)，NT 厚度及PBMCs RIPK1、miR-22-3p表達水平聯(lián)合診斷胎兒CHD 的敏感度、特異度及準(zhǔn)確度均高于NT 厚度、PBMCs RIPK1 及PBMCs miR-22-3p 單獨診斷（P＜0.05），見表2、3。

表2 NT厚度及PBMCs RIPK1、miR-22-3p表達水平對胎兒CHD的診斷情況對比（例）

表3 NT厚度及PBMCs RIPK1、miR-22-3p表達水平診斷胎兒CHD的效能對比（%）

3 討論

針對CHD 胎兒進行早期有效的診斷和治療具有極其重要的意義[7-9]。國內(nèi)外不少研究表明，孕14 周之前的胎兒淋巴組織和系統(tǒng)尚未發(fā)育成熟，從而導(dǎo)致部分淋巴液積聚于頸部淋巴管及淋巴囊內(nèi)，進一步形成NT，且在孕14 周后，伴隨著胎兒各組織系統(tǒng)的不斷發(fā)育成熟，特別是伴隨著淋巴細胞的逐漸成熟，NT 會快速消失[10-12]。故此，針對早期CHD 的篩查可借助NT 的特點開展診斷鑒定。

本研究發(fā)現(xiàn)，研究組NT 厚度及PBMCs RIPK1水平均高于對照組，而PBMCs miR-22-3p 水平低于對照組（P＜0.05）。這反映了CHD 患兒NT 厚度明顯增加，且孕婦孕早期PBMCs RIPK1 水平異常升高，PBMCs miR-22-3p 水平異常降低。原因在于CHD 屬于胸部內(nèi)部結(jié)構(gòu)異常，可能會引起淋巴管和頸靜脈淋巴液回流受阻，進一步導(dǎo)致淋巴液大量積聚于頸項部，最終表現(xiàn)為NT 厚度的增加[13-15]。RIPK1 屬于絲/蘇氨酸激酶，在觸發(fā)程序性壞死時，RIPK1 會在其絲氨酸/蘇氨酸殘基位點出現(xiàn)自身磷酸化，且可通過和RIPK3 相結(jié)合，進一步導(dǎo)致RIPK3 出現(xiàn)自身磷酸化，從而大量募集混合譜系激酶結(jié)構(gòu)域樣假激酶（MLKL），而活化的MLKL 可通過不同途徑參與細胞壞死的發(fā)生，最終引發(fā)CHD的發(fā)生、發(fā)展。人心肌轉(zhuǎn)錄因子4（GATA4）是人心肌轉(zhuǎn)錄因子（GATA）家族重要成員之一，可能參與了心肌受損后的修復(fù)及重建。故此，GATA4正常水平的表達在維持心臟正常生理功能過程中起著至關(guān)重要的作用。而miR-22-3p 可通過調(diào)控GATA4 基因的表達，進一步改變CHD 遺傳易感性，促進了CHD 的發(fā)生、發(fā)展[16-18]。此外，以隨訪結(jié)局作為金標(biāo)準(zhǔn)，NT 厚度及PBMCs RIPK1、miR-22-3p表達水平聯(lián)合診斷胎兒CHD 的敏感度、特異度及準(zhǔn)確度均高于NT 厚度單獨診斷、PBMCs RIPK1 單獨診斷及PBMCs miR-22-3p 單獨診斷。這反映了孕早期檢測NT 厚度及母體PBMCs RIPK1、miR-22-3p表達水平聯(lián)合診斷胎兒CHD 的效能較佳。究其原因，聯(lián)合檢測時可為醫(yī)生診斷CHD 提供較為全面的依據(jù)，進一步達到提高臨床診斷效能的目的。然而，佟紅梅[19]的研究發(fā)現(xiàn)，NT 厚度以＞2.4 mm 為臨界值，診斷CHD 的敏感度、特異度及準(zhǔn)確度分別為90.00%、87.50%、88.75%，這明顯高于本研究結(jié)果，而導(dǎo)致上述差異發(fā)生的主要原因可能和入選對象接受NT 厚度超聲檢查的孕周不同有關(guān)。且相較于上述研究而言，本文還分析了母體PBMCs RIPK1、miR-22-3p 表達水平對胎兒CHD 的診斷價值，亦是本研究的創(chuàng)新之處。

綜上所述，孕早期聯(lián)合檢測NT 厚度及母體PBMCs RIPK1、miR-22-3p 表達水平，可在一定程度上提高胎兒CHD 的診斷敏感度、特異度及準(zhǔn)確度。