孔德慶，秦 箐，張崇妍，劉治辰，徐曉龍，蘭茗熙，王一川，張景文，趙 丹，王志新，李金泉，劉志紅

（1.內蒙古農業(yè)大學動物科學學院，內蒙古 呼和浩特 010018；2.內蒙古自治區(qū)動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，內蒙古 呼和浩特 010018；3.農業(yè)農村部肉羊遺傳育種重點實驗室，內蒙古 呼和浩特 010018；4.內蒙古自治區(qū)山羊遺傳育種工程技術研究中心，內蒙古 呼和浩特 010018）

畜牧業(yè)是我國的重要行業(yè)，畜牧業(yè)發(fā)展中提高畜禽產品產量及質量是重要環(huán)節(jié)。骨骼肌是畜禽機體主要組成部分，骨骼肌發(fā)育的研究利于在遺傳育種中改良畜禽生長性狀，進而在實際生產應用中提高肉產量等畜禽生產水平。肌纖維構成骨骼肌，骨骼肌發(fā)育的本質是肌纖維發(fā)育，研究肌纖維發(fā)育的目的是促進肌纖維發(fā)育，使肌纖維的體積或數(shù)量擴增［1］。畜禽肌纖維發(fā)育早已研究到基因層面，相關基因之間是存在協(xié)同或拮抗作用的。一些物質（如信號通路需要的酶）在畜禽機體內不存在或不足，需要通過外源性物質的添加來調控肌纖維發(fā)育相關基因，進而促進肌纖維發(fā)育。

外源性物質的添加方式主要有植入和飼喂等，可通過人工合成來提供原料，再植入或飼喂到畜禽體內?；虻任⒂^物質可以采用植入方法進行添加，植入外源性物質主要通過注射或基因編輯等方式來進行。若能永久性改變基因，可選基因突變產生的優(yōu)良種質進行育種，進而應用到畜禽生產中。該文以近5 年研究文獻為材料，對影響肌纖維發(fā)育的不同外源性物質進行綜述，為畜禽的育種及改善肉質提供思路。

1 肌纖維的發(fā)育機制

肌纖維也稱肌細胞，它是骨骼肌主要組成部分。肌纖維按類別可分成Ⅰ型（耐酸而堿不穩(wěn)定）肌纖維和Ⅱ型（耐堿而酸不穩(wěn)定）肌纖維，肌纖維發(fā)育的不同時期中Ⅰ型肌纖維和Ⅱ型肌纖維比例和變化都不同［2］。肌纖維發(fā)育時期可分為胚胎發(fā)育期和出生后發(fā)育期，其中胚胎發(fā)育期主要是：生成肌祖細胞，形成肌細胞，肌管分化成肌纖維，以及肌纖維發(fā)育至成熟。而肌纖維的大部分發(fā)育在胚胎發(fā)育期就已經完成，其在出生后數(shù)量通常不變，所以出生后發(fā)育期研究重點是如何增加肌纖維的體積［3-6］。

2 與肌纖維發(fā)育調控相關的主要基因及信號通路

生 肌 調 節(jié) 因 子 （muscle regulatory factors，MRFs）是參與肌纖維發(fā)育調控的重要基因家族，其家族成員主要包括生肌決定因子（myogenic determining factor，MyoD）、肌細胞生成素（myogenin，MyoG）、生肌調節(jié)因子4 （muscle regulatory factor 4，MRF4）和生肌調節(jié)因子5 （myogenic factor 5，Myf5），在肌纖維發(fā)育過程中參與肌肉前體細胞增殖、肌纖維形成、出生后肌肉功能調節(jié)等［7］。配對盒基因（paired box gene，Pax）也是肌纖維發(fā)育調控中不可或缺的基因家族，其家族成員主要包括Pax3 與和Pax7，而Pax3 和Pax7 在肌發(fā)生中部分功能有相同之處，可共同調控肌纖維發(fā)育［8］。此外還有其他負調控肌纖維發(fā)育的基因，如肌生長抑制素（myostatin）基因MSTN 等，敲除MSTN 可促進肌纖維發(fā)育，對肌纖維發(fā)育的研究也十分重要。Wnt 信號通路和音猬因子（sonic hedgehog，Shh）信號通路是2 個功能相似的信號通路，兩者起協(xié)同作用可共同激活Myf5［9-10］。

3 對肌纖維發(fā)育調控基因及信號通路有影響的外源性物質

3.1 對肌纖維發(fā)育基因及信號通路有影響的外源性物質種類

對肌纖維發(fā)育基因及信號通路有影響的外源性物質主要分成以下6 類：①與甲基化相關外源性物質：其影響的基因有MRFs 家族、Pax7 等。這類物質主要包括IGF-Ⅰ的DNA 甲基化狀態(tài)、含甲基供體的營養(yǎng)素、Mll1 等。甲基結合在某些促生長因子特定部位，可與生肌因子相互作用促進肌纖維發(fā)育。②與有機酸相關外源性物質：其影響的基因有MRFs 家族、Pax3 與Pax7 等。這類物質主要包括氨基酸（Ile、Leu、Met 等）和其他有機酸（油酸等）。某些氨基酸可促進肌肉蛋白合成，其他某些有機酸可激活或促進信號通路轉導。③與催化調節(jié)相關外源性物質：其影響的基因有MRFs 家族、Pax7 等。這類物質主要包括酶（PRMT1 等）、激素 （睪酮、ISO 等）；其影響的信號通路有Wnt 和Shh 信號通路等。這類物質主要包括酶（ENPP2、JARID2、ADAMTS5 等）、激素相關物質（TEST-E、TREN 等）。某些酶能促進肌原蛋白表達，某些激素相關物質能促進肌纖維發(fā)育相關基因表達。④與轉錄相關外源性物質：其影響的基因有MRFs家族、Pax3 與Pax7 等。這類物質主要包括轉錄因子（lncMGPF、EGR1、HEYL、KLF4、Ldb1、MRTF-A等），miRNA（miR-27b、miR206、miR-204、miR145、miR181 等）；其影響的信號通路有Wnt 和Shh 信號通路。這類物質主要包括轉錄因子（TGFβ 等）和其他蛋白（FNDC4、Plec、Podocan 等）。某些轉錄因子可輔助聚合RNA，其與某些miRNA 起協(xié)同作用共同調控肌原細胞，某些蛋白起轉錄后調控作用。⑤與基因相關外源性物質：其影響的信號通路有Wnt 和Shh 信號通路。這類物質主要包括MyD88、MFCS4 等。這類物質較少，但其相關研究比較重要，其本身就可能具有調控肌纖維發(fā)育作用的某些基因，其與其他正調控因子起協(xié)同作用，或與負調控因子起拮抗作用，以促進肌纖維發(fā)育。⑥其他外源性物質：其可能不屬于主流研究或研究較少不便于分類的某些外源性物質。其影響的基因有MRFs 家族、Pax3 與Pax7 等。其主要包括FMN、硅酸鹽、穿心蓮內酯、小球藻、二甲雙胍、維生素A、白細胞介素4 等；其影響的信號通路有Shh 信號通路等。其主要包括紫黃嘌呤等。其可能直接影響肌纖維發(fā)育相關基因或信號通路，也可能通過影響甲基化相關外源性物質、轉錄相關外源性物質來間接影響肌纖維發(fā)育相關基因或信號通路。

3.2 影響MRFs 家族的外源性物質

與甲基化相關外源性物質：MyoD 與類胰島素一號生長因子（insulin-like growth factors-Ⅰ，IGF-Ⅰ）的DNA 甲基化狀態(tài)相互作用于不同發(fā)育階段來調控肌肉生長，因此可植入IGF-Ⅰ來促進MyoD 表達［11］。飼喂含甲基供體的營養(yǎng)素可使Ⅱ型肌纖維增多，可增加肌纖維橫切面積，上調Myf5 等，以及促進線粒體合成相關基因的表達［12］。甜菜堿屬于含甲基供體的營養(yǎng)素，飼喂甜菜堿可通過影響NFATc1 信號通路來增強成肌細胞分化，通過負調控MyoD 的表達來抑制成肌細胞增殖，整體上促進肌纖維發(fā)育［13］。植入混合譜系白血病蛋白-1 （mixed lineage leukemia-1，MLL1）可通過介導其啟動子上的組蛋白第三亞基四號賴氨酸的三甲基化 （trimethylation of lysine 4 on histone H3 protein subunit，H3K4me3）進而調控Myf5，來促進Pax7 的表達以及成肌細胞的增殖［14］。

與有機酸相關外源性物質：飼喂異亮氨酸（isoleucine，Ile）可 上 調 肌 球 蛋 白 重 鏈（myosin heavy chain，MyHC）、MyoD、MyoG、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARg）以及脂肪酸合酶（fatty acid synthase，F(xiàn)AS）蛋白等物質的水平［15］。飼喂亮氨酸（leucine，Leu）可調控IGF mRNA、肌肉生長相關基因的表達，通過調節(jié)AKT/TOR 信號通路增加肌肉蛋白合成，并通過調節(jié)AKT/FOXO3a 信號通路減弱蛋白降解，從而促進肌纖維發(fā)育［16］。

與催化調節(jié)相關外源性物質：植入蛋白精氨酸甲基轉移酶1（proteinargininemethyltransferase1，PRMT1）使MyoD 介導的肌原蛋白表達得到促進，使MyoD R121 位點的精氨酸甲基化對其DNA 結合活性和反轉錄活性得到增強［17］。飼喂睪酮可增加成纖維細胞生長因子2 （fibroblast growth factor 2，F(xiàn)GF2）的表達，而降低MRF4 和肌生成抑制素的表達［18］。脂素lipin1 的缺失抑制了蛋白激酶PKC 亞型活性，也抑制了Ⅱ類去乙?；窰DAC5功能，從而抑制肌細胞特異性增強因子2C（recombinant myocyte specific enhancer factor 2C，MEF2C）和MyoD 的表達，反之其植入對MEF2c和MyoD 有促進作用［19］。

與轉錄相關外源性物質：lncMGPF 作為長鏈非編碼RNA，是miR-135a-5p 的分子海綿，其植入可使肌細胞增強因子2C（myocyte enhancer factor 2C，MEF2C）表達增加，也可使MyoD 和MyoG的信使RNA 穩(wěn)定性增強，進而促進肌肉分化［20］。植入早期生長應答因子1（recombinant early growth response protein 1，EGR1）可以正向調控MyoG，進而調控肌纖維發(fā)育［21］。

其他外源性物質：植入芒柄花素（formononetin，F(xiàn)MN）可抑制肌肉生長抑制素的表達，可增加磷酸激酶的磷酸化，可增加肌原性增殖分化標志物數(shù)量，也可促進MyoD 和肌原蛋白的表達［22］。飼喂適量硅酸鹽，其中的硅離子可促進MyoG、MyoD、神經生長因子（neurturin，NRTN）和γ-氨基丁酸（aminobutyric acid，GABA）的表達，進而促進肌纖維發(fā)育［23］。飼喂穿心蓮內酯可促進MyoD、MyoG、成肌細胞融合蛋白Myomaker、肌原調節(jié)蛋白1（myozenin 1，Myoz1）和Myoz3 等與肌管分化相關基因表達，也可促進H3K4Me2、H3K4Me3 和H3K36Me2 等組蛋白修飾［24］。飼喂小球藻可促進miR-133b 和miR-206 的表達，即調節(jié)微小核糖核酸（microRNAs，myomiRs）的表達，也可促進成肌細胞的增殖分化［25］。

3.3 影響Pax3 與Pax7 的外源性物質

與甲基化相關的外源性物質：Pax7 在Mll1 成肌細胞中的重新表達可恢復H3K4me3 在Myf5 啟動子上的富集并促進Myf5 的表達，所以植入Mll1可促進Pax7 在體內的表達并增強衛(wèi)星細胞的功能［26］。

與有機酸相關外源性物質：飼喂蛋氨酸（methionine，Met）可使Myf5 調控的陽性衛(wèi)星細胞密度有下降的趨勢，而使Pax7 表達的細胞密度有增加的趨勢，總體上還是起促進肌纖維發(fā)育的作用［27］。在沒有激活劑噻唑烷二酮的情況下，油酸可使Pax3 和MyOD1 表達降低，但使Pax7 和MyoG 表達升高，總體上飼喂油酸可以促進肌肉發(fā)育［28］。

與催化調節(jié)相關外源性物質：注射異丙腎上腺素（ISOprenaline，ISO）可激活β-腎上腺素信號，誘導成肌細胞增殖，增加Pax7 調控的陽性成肌細胞百分比和骨骼肌纖維大小［29］。飼喂睪酮能夠促進腿肌中雄激素受體（androgen receptor，AR）的表達，增加p-Akt 激酶的含量，上調Pax7 的表達，進而促進肌纖維的增殖［30］。

與轉錄相關外源性物質：植入轉錄因子HEYL 和Krupple 樣因子4（Kruppel-like factor 4，KLF4）可促進從成纖維細胞衍生的Pax3 調控的陽性肌原性祖細胞表達［31］。LIM-結構域結合蛋白1（LIM domain binding protein 1，Ldb1）被獨立于蛋白復合物Ctcf-Cohesin 招募到Pax3 結合元件上，這是H3K4me1 在這些位點和染色質環(huán)上有效沉積所必需的，即植入Ldb1 對Pax3 有一定促進作用［32］。植入轉錄因子心肌相關轉錄因子-A（myocardin related transcription factor A，MRTF-A）可通過與其遠端CArG 盒序列結合，作為一種新的Pax7 調節(jié)因子參與Pax7 介導的成肌細胞增殖分化［33］。miR-27b 與Pax3 作用相反，miR-27b 直接靶向Pax3 mRNA 的3＇-非翻譯區(qū)，植入miR-27b可負調控Pax3 因子的表達來抑制骨骼肌衛(wèi)星細胞的增殖，但促進骨骼肌衛(wèi)星細胞的分化，整體來說其對肌纖維發(fā)育也有促進作用［34］。Pax3＇非翻譯區(qū)不同的Pax3 信使RNA 的亞型易受miR206 的調控，植入miR206 可導致體內Pax3 因子的水平不同［35］。Pax7、IGF-Ⅰ和MEF2C 分別是miR-204在成肌細胞增殖分化過程中的靶基因，植入miR-204 可促進Pax7 表達［36］。miR145 可以上調Pax3、Pax7、MyoD1、MyoG 和MyHC2，而miR181 可以觸發(fā)Myf5 和MyHC2 等肌原性因子表達，所以可植入這兩種miRNA 以促進肌肉發(fā)育［37］。

其他外源性物質：飼喂二甲雙胍可使Pax7 因子水平及其陽性細胞數(shù)量顯著增加，也可使衛(wèi)星細胞增殖［38］。飼喂VA 可促進Pax7 陽性衛(wèi)星細胞和 肌 原 性 標 記 基 因 包 括Pax7、Myf5、MyoD 和MyoG 的表達。VA 也增加了氧化型Ⅰ型和ⅡA 型纖維的比例，降低了乙醇型IIX 型纖維，其整體上起促進肌纖維發(fā)育作用［39］。植入白細胞介素4 可促進胚胎干細胞分化過程中早期肌原基因如Mesogenin1、Pax3 和Pax7 的表達［40］。

3.4 影響Wnt 和Shh 信號通路的外源性物質

與催化調節(jié)相關外源性物質：外核苷磷酸二酯酶Ⅱ型 （recombinant ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 2，ENPP2）受WNT/ β-Catenin 信號調節(jié)因子的調控，其植入可促進肌纖維肌源性分化［41］。植入組蛋白去甲基化酶（jumonji，AT rich interactive domain 2，JARID2）和多梳抑制復合物2 （polycomb repression complex 2，PRC2）復合物可通過抑制Wnt 拮抗劑而促進Wnt信號通路來調節(jié)肌肉分化［42］。血小板反應蛋白解整合素金屬肽酶5 （recombinant A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin 5，ADAMTS5）和Shh 協(xié)同調控MyoD 的表達，作用并不依賴于ADAMTS5 的催化活性，即植入ADAMTS5 可調節(jié)影響肌肉發(fā)育的重要細胞信號通路中的非酶功能［43］。飼喂庚酸睪酮（testosterone enanthate，TEST-E）和群勃龍（trenbolone，TREN）可增加雄激素敏感的提肛肌/球海綿體肌中的Wnt5a 蛋白，即芳香化和非芳香化雄激素增加了骨骼肌中Wnt5a 蛋白的表達［44］。

與轉錄相關外源性物質：植入轉化生長因子β 活化激酶（TGF-β activated kinase，TAK1）可使Shh 和轉錄因子Gli2 的轉錄本顯著上調［45］。植入含纖維連接蛋白Ⅲ型結構域4 （fibronectin typeⅢdomain-containing protein 4 ，F(xiàn)NDC4）可以通過轉錄后調控作用激活Wnt/β-連環(huán)蛋白信號轉導，進而影響成肌細胞C2C12 的分化［46］。血小板及白細胞C 激酶底物（platelet and leukocyte C kinase substrate，Plec）和肌成纖維細胞（myofibroblast，MyoF）的轉錄后調控作用可以保護蓬亂蛋白Dsh 同源物2（dishevelled，dsh homolog 2，Dvl-2）免受自噬介導的降解來保持穩(wěn)定狀態(tài)，即植入Plec 可通過激活Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路促進骨骼肌發(fā)育［47-48］。Podocan 蛋白是正常C2C12 分化所必需的，其植入可通過轉錄后調控作用增強Wnt/β-連環(huán)蛋白通路進而促進肌生成［49］。

與基因相關外源性物質：植入髓樣分化因子（myeloid differentiation factor 88，MyD88）可在肌生成過程中調節(jié)非典型的NF-κB 信號通路和典型的Wnt 信號通路，促進小鼠骨骼肌生長，以及促進過負荷誘導的肌纖維肥大［50］。缺乏Shh 順式增強子（ShhMFCS4/—，MFCS4）的小鼠，會減少舌背上皮Shh，擾亂舌隔肌腱的形成，破壞了內在肌肉模式，反之說明植入MFCS4 可促進肌肉生成［51］。

其他外源性物質：飼喂紫黃嘌呤可激活Shh信號，或促進嗎啉基（morpholino，MO）表達進而激活轉錄抑制因子Gli3 的敲除，挽救了miR-133 敲除（knock-down，KD）表型，參與構建Shh/MRF/miR-133/Gli3 軸［52］。

3.5 影響其他肌纖維發(fā)育調控相關基因及信號通路的外源性物質

與有機酸相關外源性物質：飼喂丁酸能增加PPAR γ 共激活因子1α （PPAR-γ coactivator 1 alpha，PGC-1α）水平，增加靶TEA 結構域轉錄因子1（TEA domain transcription factor 1，TEAD1）基因水平，以及增加miR-208b 和miR-499-5p 水平，以達到促進肌纖維發(fā)育的目的［53］。飼喂N-氨甲酰谷氨酸（N-carbamylglutamate，NCG）可轉化相關基因（MSTN、PPAR-γ 和PGC-1α）表達，增加Ⅰ型肌纖維比例，提高肌肉抗氧化機能，從而改善肌肉品質［54］。飼喂丁酸、辛酸和棕櫚酸可能通過促進AMPK 信號通路和Ca2+依賴的信號通路來增加肌纖維密度以及較小直徑肌纖維比例［55］。飼喂較低水平二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）可通過激活AMPK／Sirtl 信號通路途徑促進白肌增生和肌纖維發(fā)育，但高水平的DHA 可通過激活P53/Cycling 信號通路途徑誘導細胞周期停滯而抑制生長，所以需要控制用量［56］。

與轉錄相關外源性物質：植入miR-499-5p可能通過下調轉錄因子豬Sox6 （porcine Sox6，pSox6）的表達來促進氧化肌纖維的形成［57］。miR-152 直接靶向解偶聯(lián)蛋白3 （uncoupling protein 3，UCP3）的30 個非翻譯區(qū) （unique taxpayer reference，3＇-UTR），導致其在蛋白水平上轉錄后抑制，而UCP3 相關信號通路介導了miR-152 在慢收縮肌纖維形成中的作用。即植入miR-152 可促進慢收縮肌纖維形成和骨骼肌生成來調控肉質［58］。Vgll3 蛋白過表達可降低Hippo 信號通路負反饋回路的活性，可影響肌肉調節(jié)基因Myf5、Pitx2 和Pitx3 等基因的表達，以及可編碼某些Wnts 和IGFBP 蛋白相關基因的表達。即植入Vgll3 可作為一種轉錄基因輔助因子與Hippo 信號通路一起控制肌生成［59］。

與基因相關外源性物質：FSIII 基因使Smad和Erk 通路被抑制，使PI3k/Akt 通路激活。MyoD、Myf5 和MyoG 轉錄水平上調，而MRF4 轉錄水平下調。即植入FSIII 基因可通過調控與MSTN 相關的信號通路，以及調控肌原性調節(jié)因子的表達，進而整體上介導骨骼肌肥大［60］。

其他外源性物質：飼喂原花青素B2（proanthocyanidin B2，PB2）可通過調控AMPK 信號通路來促進C2C12 肌管中慢收縮肌相關基因的表達［61］。植入MST1/2 激酶的抑制劑XMU-MP-1 可刺激YAP 相關信號通路在成肌細胞和肌管中的核定位，可上調肌原蛋白，進而促進成肌細胞融合［62］。酶解大豆蛋白效應物Ala-Phe 二肽可通過激活ERK1 和ERK2 信號通路來促進成肌細胞增殖和分化，Glu-Tyr 二肽可通過激活ERK1 信號通路促進成肌細胞增殖和分化，而Glu-Tyr 和Ala-Phe 二肽都能通過激活TOR 信號通路促進成肌細胞蛋白質合成。所以可通過飼喂酶解大豆蛋白來促進肌纖維發(fā)育［63］。飼喂蘿卜硫素（sulforaphane，SFN）可激活Akt 蛋白，可通過Foxo 蛋白依賴的信號通路增強蛋白質合成，進而增加肌管直徑［64］。

4 利用敲除等手段調控其他基因

由于存在一些負調控肌纖維發(fā)育的因子，需要使用敲除或消融手段消除這類因子，以達到促進肌纖維發(fā)育的目的。這類因子包括基因（MSTN、Sox6 等）、蛋白（Hes1、TMEM182 等）。在胎兒時期敲除功能性MSTN 可通過促進肌纖維的增生和肥大導致肌肉質量的顯著增加［65］。Sox6 是體內慢肌相關基因表達的肌纖維富集抑制因子，敲除Sox6可使慢肌的纖維數(shù)量增加［66］。在干細胞中消融轉錄調節(jié)因子Hes1 振蕩器可干擾穩(wěn)定的MyoD 振蕩，也可導致MyoD 持續(xù)表達時間延長，進而導致分化傾向的增加［67］?？缒さ鞍?82（transmembrane protein 182，TMEM 182）可在功能上抑制成肌細胞的分化和融合，其與整合素β 1 （integrin beta 1，ITGB1）可相互作用。TMEM182 的肌原性缺失可提高ITGB1 與層粘連蛋白的結合活性，在肌發(fā)生過程中可誘導FAK-ERK 和FAK-Akt 信號軸的激活。所以敲除TMEM182 可促進肌纖維發(fā)育［68］。

5 展望

綜上所述，肌纖維生長發(fā)育相關基因相互影響，而基因也受到外源性物質的調控。雖然已經探索發(fā)現(xiàn)了許多外源性物質對基因的影響，但還有很多方面問題亟待解決。比如MSTN 突變體與MSTN 作用相反，是否其他負調控因子突變也有類似情況？ 比如不同外源性物質若同時添加到畜禽體內，是否起協(xié)同作用而更好地促進肌纖維發(fā)育，具體還需要加以驗證。今后，還需加強肌纖維基因的研究，找到更多對肌纖維發(fā)育影響的基因以及相關外源性物質，并將其應用到畜禽育種和生產中。