王超 趙鵬 張競美

(青島市胸科醫(yī)院，山東 青島 266043)

肺結核是由結核分枝桿菌引發(fā)的肺部感染性疾病，臨床表現(xiàn)為盜汗、發(fā)熱、月經(jīng)失調、呼吸困難等癥狀，嚴重威脅人類的健康〔1〕。結核分枝桿菌簡稱結核桿菌，是引起結核病的病原菌，可侵犯全身器官，其中肺結核最為多見〔2〕。肺結核至今仍為重要的傳染病，有報道顯示，每年約有800萬新病例發(fā)生，至少有300萬人死于該病〔3〕。我國結核病患病人數(shù)高居世界第2位，肺結核處于高發(fā)狀態(tài)，因此肺結核疾病仍是臨床上治療的難題?？鄥槎箍评僦参锟鄥⒌母稍锔?，是中國歷史悠久的傳統(tǒng)藥物之一〔4〕。苦參屬于清熱燥濕藥，其性味苦寒，有清熱燥濕和利尿的功效〔5,6〕。近些年，國內外對苦參的研究重點放在生物堿上，目前已經(jīng)從苦參中分離出27種生物堿?？鄥⑸飰A大多屬于喹諾里西啶類，極少數(shù)為雙哌啶類，以苦參生物堿和氧化苦參堿含量最高，并且苦參堿具有肝細胞保護、消炎鎮(zhèn)痛、抑菌抗病毒等多方面的藥理活性〔7,8〕?？鄥⑺啬z囊在肺結核治療中具有良好的保肝作用，因此苦參堿可以制成適宜劑型以便于臨床上更好地治療肺結核〔9〕。肌醇必需酶(IRE)1是存在于內質網(wǎng)膜上的跨膜蛋白，哺乳動物中存在IRE1α和IRE1β兩種亞型，IRE1α在哺乳動物所有的組織細胞中普遍存在，而IRE1β則存在于呼吸道、胃腸道消化系統(tǒng)的上皮細胞中〔10〕。IRE1α在不同的組織細胞中表達也大不相同，目前還沒有明確報道證實IRE1α在肺結核肺組織中的表達情況，因此本文建立肺結核大鼠模型，并給予苦參堿治療干預，觀察苦參堿對肺結核大鼠結核桿菌的抑制作用及其對IRE1信號的表達的影響。

1 材料和方法

1.1實驗動物 大鼠均來中國科學院上海實驗動物中心，共計60只健康大鼠，體重平均(221.5±1.4)g，正常飼養(yǎng)，保證實驗室清潔，晝夜交換更替，保持實驗室溫度在24℃。

1.2試劑和儀器 苦參堿(上海第二軍醫(yī)大學藥學院中西藥研究室)；二喹啉甲酸(BCA)蛋白試劑盒、一抗二抗去除液(強堿性)、細胞裂解液、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)試劑盒、IRE1抗體均購自沈陽萬科生物科技有限公司；低溫高速離心機(湖南湘立科學儀器有限公司)；成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司)；多功能電泳儀購自北京鴻濤基業(yè)科技發(fā)展有限責任公司。

1.3動物分組與模型建立 大鼠隨機分為正常組、PTB組和Mat組，每組20只。正常組大鼠尾靜脈注射0.2 ml 0.9%氯化鈉注射液。PTB組和Mat組大鼠尾靜脈注射由結核患者痰液中分離的結核分枝桿菌，該桿菌已按結核病診斷細菌學檢驗規(guī)程驗證為結核分枝桿菌，取分裂旺盛的模型菌，用 0.9%氯化鈉溶液溶解，每只大鼠注射0.2 ml細菌懸液。

造模成功后，正常組和PTB組大鼠給予等量的生理鹽水灌胃干預；Mat組大鼠給予苦參堿灌胃，每千克大鼠給予30 mg進行干預，3組大鼠給藥干預1次/d，連續(xù)干預30 d。

1.4標本采集 檢測各組大鼠給藥后第1天、15天和30天體重變化。造模30 d時，用頸部脫臼法分別處死3組大鼠，留取肺組織，放置在-80℃的冰箱中保存，以用于后續(xù)實驗。

1.5測定大鼠體重 在給藥后1 d、15 d和30 d時，分別對正常組、PTB組和Mat組大鼠的體重進行測量并比較。

1.6大鼠肺組織結核分枝桿菌菌落計數(shù) 取每只大鼠全部左肺組織，加入2 ml 0.9%氯化鈉注射液后研磨成勻漿，再取組織液加等體積4%硫酸消化15 min 后，加入2.5 mol NaOH調整至pH7.0左右，接種于斜面培養(yǎng)基，置于37℃下培養(yǎng)5 w，計數(shù)培養(yǎng)基上結核分枝桿菌菌落數(shù)。

1.7肺組織病理學形態(tài)觀察 分別取出正常組、PTB組和Mat組大鼠的肺組織取出，固定后用石蠟進行包埋處理，把包埋后的組織進行切片，每個切片組織均為5 μm，切片組織脫蠟后，用蘇木素-伊紅(HE)染色觀察。用顯微鏡對染色的肺組織進行觀察，觀察組織形態(tài)的變化。

1.8Western印跡法檢測肺組織中Ire1α和GRP78蛋白的表達 3組大鼠的肺組織分別提取100 mg，細胞進行裂解并提取核蛋白，并對核蛋白的濃度進行測量，分裝后，保存在-20℃的環(huán)境中。將提取出的蛋白溶液和緩沖溶液進行混均，按照4∶1的比例進行，為了讓蛋白質變性需將蛋白溶液全部進行煮沸處置。電泳板孔內注入蛋白樣品，50 μg。轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上后加脫脂奶粉，封閉1 h。TTBS洗滌要在加入的1抗前進行，每次漂洗10 min，一共進行3次漂洗，最后加入2抗對溶液進行稀釋，再在常溫的環(huán)境中封閉1 h。取出PVDF膜，TTBS漂洗10 min×3，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色后數(shù)碼相機照相。

1.9qRT-PCR法檢測肺組織中IRE1α和GRP78 mRNA的表達 分別取出3組大鼠的肺組織，用Trizol將組織進行裂解，對總的DNA進行提取，所有的逆轉錄反應按照說明書進行，經(jīng)所得到的cDNA進行熒光實驗。反應按照反應條件嚴格進行擴增，變性30 s 95℃，變性5 s 95℃，退火40 s 60℃，一共45個循環(huán)。取平均值后得到Ct值，計算方法用2-△△Ct法進行分析，引物序列見表1。

表1 引物序列表

1.10統(tǒng)計學分析 采用SPSS19.0統(tǒng)計學軟件進行t檢驗、單組間因素分析。

2 結 果

2.13組大鼠體重比較 給藥后1 d 3組大鼠的體重變化沒有顯著差異(P>0.05)。給藥后15 d和30 d，與正常組體重相比，PTB、Mat組體重顯著降低(P<0.05)；給藥后15、30 d，Mat組體重明顯高于PTB組(P<0.05)，見表2。

2.23組肺組織結核分枝桿菌菌落計數(shù)比較 正常組肺組織中沒有結核分枝桿菌的菌落出現(xiàn)，和正常組大鼠相比，PTB組大鼠的肺組織中結核分枝桿菌的菌落數(shù)量顯著增多(P<0.05)；Mat組肺組織中結核桿菌的菌落數(shù)量顯著低于PTB組(P<0.05)，見表3。

2.3肺組織病理變化比較 正常組肺組織沒有出現(xiàn)明顯的病理變化。與正常組相比較，PTB組大鼠肺臟血管周圍有大量的炎性細胞浸出，并且出現(xiàn)了大量的肉芽腫樣細胞聚集；肺間質之間出現(xiàn)了大量的水腫，大體解剖可見肺臟表面存在白色栗粒狀結節(jié)。Mat組肺組織病理情況明顯好于PTB組，見圖1。

表2 3組給藥后1 d、15 d和30 d體重比較

表3 3組肺組織結核分枝桿菌菌落計數(shù)及IRE1α、 GRP78蛋白表達比較

圖1 3組肺組織(HE染色，×100)

2.43組肺組織中IRE1α和GRP78蛋白表達比較 與正常組相比，PTB組肺組織中IRE1α和GRP78蛋白表達顯著增多(P<0.05)；Mat組肺組織中IRE1α和GRP78蛋白表達明顯低于PTB組(P<0.05)，見表3、圖2。

圖2 3組肺組織中IRE1α和GRP78蛋白表達

2.53組肺組織中IRE1α 和GRP78 mRNA表達比較 與正常組相比較，PTB組肺組織中IRE1α和GRP78 mRNA表達增多，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；Mat組肺組織中的IRE1α和GRP78 mRNA表達低于PTB組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表4。

表4 3組肺組織中IRE1α、GRP78 mRNA 表達比較

3 討 論

肺結核屬于慢性呼吸傳染疾病，主要由結核分枝桿菌感染肺部導致機體免疫應答紊亂引起，患者可通過呼吸及咳嗽產(chǎn)生飛沫或痰液傳播，影響社會健康〔11〕。肺結核病程長，病理變化復雜，臨床表現(xiàn)為機體細胞因子分泌失衡、腫瘤壞死因子釋放過多等癥狀，導致患者呼吸系統(tǒng)功能異?！?2〕，嚴重者會導致肺部空洞，故疾病早期予以良好治療意義重大?？鄥A是從中藥苦豆子中分離出來的單體生物堿，具有提高免疫力、抗病毒、抗炎、抗腫瘤等方面的藥性活性和臨床用途〔13〕。有研究結果證實，苦參堿在結核桿菌標準珠H37RV濃度為104CFV/ml時，MIC值為10 mg/L，和傳統(tǒng)的方法相比效果更為顯著，由此說明苦參堿有抑制結核桿菌生長的作用〔14〕。IRE1α具有復雜的結構和功能，是目前報道的蛋白中唯一一個同時具有激酶和核酸內切酶活性的蛋白〔15〕。有研究發(fā)現(xiàn)，IRE1α能通過多種途徑誘導細胞凋亡和參與炎癥反應，并且介導著代謝性疾病的發(fā)生發(fā)展〔16〕，但目前還沒有實驗證明IRE1α在肺結核中具體表達，因此本文給予肺結核大鼠苦參堿進行干預治療，證實其對肺結核結核桿菌的抑制作用，并觀察苦參堿對肺結核大鼠肺組織中IRE1α蛋白表達的影響。

本文建立肺結核大鼠模型，實驗結果顯示經(jīng)過苦參堿治療后大鼠的體重明顯回升，并且大鼠狀態(tài)也得到了改善，可見苦參堿可有效改善肺結核大鼠的癥狀。結核分枝桿菌菌落計數(shù)可直接反映肺結核病的嚴重程度，本研究結果說明，苦參堿治療以后，患病大鼠的病癥明顯減輕，結核治療效果明顯?？鄥A有降低DNA含量的功能，這可能是其抑制結核桿菌生長的作用之一。吳濤等〔17〕研究發(fā)現(xiàn)檢測苦參堿藥物高低濃度時，有70%在抑菌濃度范圍內，還有23%為高低濃度生長菌，可能是結核桿菌的耐藥株，其對大多數(shù)抗生素有一定抵抗能力，還有2株為高低濃度敏感株，可能比較脆弱的結核桿菌株存在。連續(xù)培養(yǎng)30 d后發(fā)現(xiàn)高低濃度的生長菌比例明顯上升，說明苦參堿有顯著的抑菌作用，雖然不能殺死全部的結核桿菌，但能有效減緩細菌的生長速度。

在治療抗結核的藥物中均有不同程度的肝細胞毒性，治療結合病中經(jīng)常伴隨著肝細胞的損傷，而肝細胞的損傷往往伴隨著細胞的過度凋亡、而細胞凋亡最主要的途徑就是內質網(wǎng)應激，有研究表明，內質網(wǎng)應激是肺結核發(fā)生發(fā)展的重要病理機制。IRE1信號通路是內質網(wǎng)應激信號通路中的經(jīng)典通路，被認為與慢性疾病引起的細胞凋亡有關〔18〕。當內質網(wǎng)應激發(fā)生時，葡萄糖調節(jié)蛋白(GRP)78的解離促進了IRE1α的激活，驅動多種未折疊的蛋白應答相關的基因表達，從而誘發(fā)細胞凋亡〔19〕。GRP78又稱為免疫球蛋白重鏈結合蛋白，當內質網(wǎng)應激時對受到刺激的細胞最先進行保護，被稱為內質網(wǎng)應激途徑的關鍵標志性因子。本研究結果提示，苦參堿能有效抑制肺結核肺組織中IRE1α和GRP78的表達。有研究者把肺結核患者隨機分為治療組和對照組，治療組患者給予苦參素膠囊干預，結果顯示治療組患者均未出現(xiàn)肝功能損傷，而對照組有1/3患者肝功能受到嚴重損傷〔20〕，說明苦參素膠囊在肺結核化療中同時具有較高的保肝效果，因此苦參堿可以制成適宜劑型以便于臨床上更好的治療肺結核。王捷等〔21〕通過對肺動脈損傷的大鼠研究證實，在模型組大鼠肺組織中IRE1信號通路中關鍵因子IRE1α和GRP78均顯著升高，藥物治療后發(fā)現(xiàn)其表達得到了顯著的抑制，進而降低肺動脈的壓力，為肺動脈損傷的靶向治療提供新的途徑。

綜上，苦參堿可有效抑制肺結核結核桿菌的生長，同時對肺組織中IRE1α信號通路進行抑制，進而對肺組織進行保護。