常玉廣,金 露

(南京曉莊學院 環(huán)境科學學院,江蘇 南京 211171)

在微生物細胞融合技術(shù)中,原生質(zhì)體可以經(jīng)過溶菌酶處理而制備,在高滲條件下通過聚乙二醇(PEG)促融,使具有不同優(yōu)良性狀的2株菌通過破壁、促融,將2個優(yōu)良性狀集中于一種微生物內(nèi)[1]。其中原生質(zhì)體產(chǎn)率是一個重要指標,如何讓原生質(zhì)體再生的細胞,在普通的培養(yǎng)基上生長繁殖也是重要一環(huán),不同微生物的原生質(zhì)體最適再生條件存在著一定差異。另外,原生質(zhì)體具有再生成細胞的活力才可以使它的子代進行遺傳。測定原生質(zhì)體形成率和再生率可以作為檢驗、改善原生質(zhì)體分離和再生條件的影響因素[2],也是分析融合實驗結(jié)果、改善融合條件的一個衡量指標。

細胞融合技術(shù)不僅為基因調(diào)控、遺傳互補、腫瘤發(fā)生、基因定位、衰老控制等理念領(lǐng)域的研究提供了有力的手段,而且在遺傳學、免疫醫(yī)學以及醫(yī)藥、食品、環(huán)保等方面都有廣泛的應(yīng)用價值。從1974年發(fā)現(xiàn)的高效融合劑(聚乙二醇)使不同科屬的植物原生質(zhì)體之細胞融合技術(shù)開始,PEG在細胞融合領(lǐng)域取得了可喜的成績,具有重要的實用性意義[3]。本研究在已有的高效絮凝菌研究基礎(chǔ)上[4],利用細胞融合技術(shù),期望獲得具有更高絮凝能力的新型絮凝菌,以此作為后續(xù)絮凝菌絮凝性狀的基礎(chǔ)研究。

1 實驗部分

1.1 實驗材料

絮凝菌主要來源于含油廢水處理單元曝氣池中的水樣,芽孢桿菌屬(Bacillussp.),兩例菌均為哈爾濱工業(yè)大學環(huán)境生物技術(shù)實驗室開發(fā)[5],菌種生理及生化特征參見文獻[6]。

1.2 實驗方法

1.2.1 原生質(zhì)體形成及再生的培養(yǎng)

1.2.1.1 溶菌酶處理前總菌數(shù)的測定

挑取青霉素處理后具有抗性單菌落于液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)至光密度(OD)值0.3～0.5[7];取活化的菌液0.5 mL,用生理鹽水稀釋成10-5、10-6、10-7的菌液,各取1 mL稀釋液(每個稀釋度做3個重復),涂布于完全培養(yǎng)基上,于30 ℃培養(yǎng)24 h,計數(shù)溶菌酶處理前的菌數(shù),即為原菌計數(shù)。

1.2.1.2 溶菌酶處理后剩余菌數(shù)的測定

將溶菌酶處理后的含原生質(zhì)體懸浮液1 mL,用無菌水稀釋,使原生質(zhì)體裂解死亡,取稀釋成10-2、10-3、10-4的菌液各0.1 mL,涂布于完全培養(yǎng)基平板上。于30 ℃培養(yǎng)48 h,計算酶解后未形成原生質(zhì)體的數(shù)量。

1.2.1.3 原生質(zhì)體再生菌數(shù)的測定

雙層培養(yǎng)法:先倒高滲再生固體培養(yǎng)基在培養(yǎng)皿底層,取1 mL溶菌酶處理后的含原生質(zhì)體懸液,用高滲溶液作稀釋劑,稀釋成10-3、10-4、10-5的菌液各取1 mL,加入底層平板中央,再倒入高滲再生半固體培養(yǎng)基混合。于30 ℃培養(yǎng)48 h,計數(shù)原生質(zhì)體形成數(shù)量和未形成原生質(zhì)體的菌數(shù)之和。

1.2.2 原生質(zhì)體形成率及再生率

將原生質(zhì)體形成率與再生率作為融合子形成率的衡量尺度,具體計算公式如下:

原生質(zhì)體形成率=(A-B)/A×100%

(1)

原生質(zhì)體再生率=(C-B)/(A-B)×100%

(2)

其中:A為溶菌酶處理前的菌數(shù),即為原菌計數(shù);B為未形成原生質(zhì)體的菌落數(shù);C為形成的原生質(zhì)體與未形成原生質(zhì)體的菌數(shù)之和[8];A-B原生質(zhì)體形成數(shù);C-B原生質(zhì)體再生數(shù)。

1.2.3 原生質(zhì)體的融合時間篩選

取制備好的原生質(zhì)體,進行原生質(zhì)體融合實驗[9-10],以此來確定原生質(zhì)體融合PEG的最佳濃度和作用時間。

2 結(jié)果與討論

2.1 溶菌酶處理前總菌數(shù)的測定

測定溶菌酶處理前的菌液數(shù)量,通過計算原生質(zhì)體形成率以及再生率,檢測菌液的生長活性。因為菌液的活性直接影響制備的原生質(zhì)體生長活性,同時影響原生質(zhì)體的再生能力。所以,菌液的活性是原生質(zhì)體再生的一個重要因素。從表1可知,稀釋不同濃度的菌液的細菌總數(shù)測定趨于一致,F2菌種的總平均數(shù)為1680×105個,F6菌種的總平均數(shù)為1835×105個。說明在同一條件下,絮凝菌的生長狀況較穩(wěn)定,有利于在溶菌酶的作用下形成良好的原生質(zhì)體。

2.2 溶菌酶處理后剩余菌數(shù)的測定

細胞通過溶菌酶處理后,存在原生質(zhì)體和未形成原生質(zhì)體的細胞。通過對剩余菌落數(shù)量的測定,來確定融合處理時的原生質(zhì)體濃度,剩余細胞數(shù)量相對少,則原生質(zhì)體形成率高,說明溶菌酶的作用效果相對較好。因此,分析溶菌酶處理后剩余菌數(shù),形成原生質(zhì)體形成率的一個指標,精準判斷細胞融合率。由表2可知,溶菌酶處理后的細胞數(shù)量相對菌液細胞數(shù)量少,F2總平均數(shù)為462×102個,F6總平均數(shù)為662×102個,表明溶菌酶處理細胞后得到的原生質(zhì)體細胞數(shù)量相對多。鑒于對溶菌酶處理的菌體細胞形態(tài)分析,溶菌酶的處理效果較好,因此,以上數(shù)據(jù)反應(yīng)了較好的處理效果。

表2 F2和F6溶菌酶處理后剩余細胞總數(shù)

2.3 原生質(zhì)體再生數(shù)的測定

將溶菌酶處理后的溶液再經(jīng)過純化后的原生質(zhì)體涂布于再生培養(yǎng)基上,觀察發(fā)現(xiàn)原生質(zhì)體再生成菌落的速度相對較慢,一般菌株在30 ℃下培養(yǎng),需1～2 d能夠生長出菌落,而原生質(zhì)體再生至少需要3～5 d才能長出菌落,一周左右細胞能夠成熟,這是原生質(zhì)體再生過程的延緩現(xiàn)象。

測定原生質(zhì)體再生數(shù)目,是檢測細胞活性、原生質(zhì)體活性、細胞再生能力的重要參考因素,有利于判斷在該條件下的原生質(zhì)體細胞融合的能力。由表3可知,F2的原生質(zhì)體與未形成原生質(zhì)體再生總數(shù)約為756×103個,F6的原生質(zhì)體與未形成原生質(zhì)體再生總數(shù)約為756×103個。該數(shù)量完全滿足細胞融合的需要,也是細胞融合成功的重要前提條件。

表3 F2和F6的原生質(zhì)體與未形成原生質(zhì)體再生總數(shù)

根據(jù)數(shù)據(jù)計算可知,F2原生質(zhì)體的形成率99.97%,F6原生質(zhì)體形成率99.96%,前期青霉素的預處理效果好,溶菌酶的作用時間與作用量的測定為最佳值[1]。盡管如此,原生質(zhì)體的再生率相對較低,F2原生質(zhì)體再生率0.4225%,F6原生質(zhì)體再生率0.5423%。在本實驗中,盡管再生率比率相對低,但再生的細胞數(shù)目仍然可觀,足夠可以進行細胞融合。

2.4 原生質(zhì)體融合PEG最佳作用濃度和時間

聚乙二醇(PEG)是乙二醇的多聚化合物,存在一系列的不同分子量的多聚體。PEG可與水分子借氫鍵結(jié)合,在高濃度的PEG溶液中自由水消失,導致細胞脫失而發(fā)生質(zhì)膜結(jié)構(gòu)的變化,從而引起細胞融合。為了發(fā)揮PEG促進細胞融合效力,必須采用較高濃度(30%～50%,分子量為6000),但PEG在高濃度下,細胞可能因脫水而受到顯著的破壞。因此,選擇合適的分子質(zhì)量、濃度及作用時間是PEG融合技術(shù)的關(guān)鍵。PEG誘導細胞融合由于具有容易制備和控制、活性穩(wěn)定、使用方便等特點,在細胞融合領(lǐng)域取得了可喜的成績,大量研究仍采用此法[11]。

PEG作用的最佳濃度和時間如表4所示。PEG的濃度設(shè)置從20%～60%,時間從10～120 min范圍,37 ℃條件下反應(yīng)。由數(shù)據(jù)顯示,在反應(yīng)10 min時,PEG的濃度為30%和40%融合效果最好,考慮到PEG會引起細胞脫水而受到破壞因素,選擇30%濃度為本次實驗的最佳值。其次,作用時間對絮凝微生物的原生質(zhì)體融合具有一定的影響效果,通過顯微鏡觀察,確定PEG最佳作用時間,原生質(zhì)體在促融劑聚乙二醇作用下促融和,PEG作用時間在20～120 min范圍時長出融合子逐漸減少,原因可能是PEG本身有毒性,作用時間過長導致原生質(zhì)體失活,會影響融合子的生成無法再生,是對細胞有毒害[11]。所以10 min時的促融合效果更好,而且時間短,效率高,是實驗的最佳選擇。因此,確定了PEG最佳作用時間為10 min。

表4 PEG作用濃度和時間的選擇試驗

3 結(jié) 論

通過前期青霉素的預處理、溶菌酶的作用時間與作用量的測定,確定的最佳值得到的原生質(zhì)體,原生質(zhì)體的形成率高達99%左右,而原生質(zhì)體的再生率在0.5%左右,原生質(zhì)體的再生率相對較低,這種現(xiàn)象在眾多的細胞融合實驗中是一個很難解決的難題。在本實驗中,為了細胞融合達到理想的目標,對原生質(zhì)體融合PEG最佳濃度和作用時間進行了篩選,PEG最佳濃度是30%,細胞融合的最佳作用時間為10 min。上述實驗數(shù)據(jù)旨在研究絮凝微生物的細胞融合,為改善絮凝微生物在水處理中的絮凝效果,需繼續(xù)完善細胞融合的研究。