趙雪松,黃嘉誠,王琬玥,武 韜,任 新

(吉林師范大學 工程學院, 吉林 四平 136000)

磷酸三-(2-丁氧基)乙酯(TBOEP)一種典型有機磷阻燃劑(OPFRs),在使用過程中TBOEP是以簡單的物理方式進行添加,使其極易釋放到周圍環(huán)境中[1,2]。北京地表水TBOEP的濃度為116 ng/L(

吉林省是中國重要的工業(yè)基地,加工制造業(yè)比較發(fā)達,工業(yè)門類特色鮮明。在汽車制造、客車制造、電子產(chǎn)業(yè)以及石化企業(yè)四大支柱產(chǎn)業(yè)生產(chǎn)加工中,阻燃劑與納米材料均占據(jù)舉足輕重的地位,TBOEP與nano-TiO2在吉林省大量應用勢必會造成環(huán)境殘留,二者在水環(huán)境中具有共存的可能性極高。本實驗以土著鯽魚為受試生物來研究通過分析TBOEP單獨暴露以及與nano-TiO2聯(lián)合暴露后幼魚性激素含量以及下丘腦-垂體-性腺軸(HPG軸)基因表達的變化,建立鯽魚暴露評價污染物繁殖毒性干擾效應模型,揭示nano-TiO2對TBOEP繁殖毒性影響的機制。本研究具有較高的現(xiàn)實意義,其研究結(jié)果將為我省四大支柱產(chǎn)業(yè)的生態(tài)安全評估與產(chǎn)業(yè)的合理布局提供必要的理論依據(jù),同時為完善持久性有毒物質(zhì)的生物毒理數(shù)據(jù)庫貢獻一份力量。

1 實驗部分

1.1 實驗試劑

99 %的TBOEP購自Sigma-Aldrich公司,99 %二甲基亞楓(DMSO)購自安耐吉公司,鯽魚幼苗養(yǎng)殖的培養(yǎng)液用NaHCO3, KCl, MgSO4·7H2O,以及CaCl2·2H2O進行配置,并將10 mg/mL的TBOEP儲備液用培養(yǎng)液稀釋至0.05 μg/L與0.5 μg/L。90 %的nano-TiO2購自深圳納米巷有限公司,并用培養(yǎng)液稀釋至5 μg/L。

1.2 暴露實驗

試驗用的鯽魚幼苗購自長春市水產(chǎn)養(yǎng)殖基地,幼苗的體長平均為(12.14±0.87) cm,體質(zhì)量約為(21.35±3.05) g。實驗開始前,將魚苗馴養(yǎng)一周以上,每天三次投放餌料,養(yǎng)殖液的溶解氧為(5.0±0.98) mg/L,水溫控制在(25±5) ℃。暴露實驗進行如下:在空白對照組、0.05 μg/L與0.5 μg/L TBOEP暴露組、0.5 mg/L nano-TiO2暴露組以及TBOEP 0.05 μg/L+nano-TiO20.5 mg/L、TBOEP 0.5 μg/L+nano-TiO20.5 mg/L復合暴露組中,每個暴露濃度放置10尾健康活潑的魚苗,實驗設(shè)置3組平行實驗。暴露實驗持續(xù)7 d,每天正常投喂三次,更換50 %暴露溶液,并詳細記錄魚苗的體態(tài)、形態(tài)學異常。

1.3 魚體組織中TBOEP含量的測定

鯽魚和腦、肝臟以及性腺等組織稱重后摻入100 ng的d27-TBP作為TBOEP的內(nèi)標,萃取劑為乙腈。暴露結(jié)束后,迅速提取組織樣品,勻漿后離心收集上清。反復提取2次后,收集上清液,經(jīng)氮氣吹脫濃縮到1 mL。后經(jīng)固相萃取,乙腈與甲醇洗脫后,利用液相色譜與質(zhì)譜連用儀進行定量分析,運行參數(shù)詳見文獻[11]。

1.4 血清中性激素含量的測定

鯽魚血清中性激素睪酮與雌二醇含量采用放射性免疫測定(RIA)方法以γ測定儀進行測定。暴露實驗結(jié)束后,按照Andrew F. R方法,收集尾靜脈的血液樣本用于性激素的測定。血清在測定前,需要用二氯甲烷進行萃取(血清與二氯甲烷的體積比為1∶5),結(jié)束后將二氯甲烷相取出,揮發(fā)去除二氯甲烷后用無水乙醇定容至200 μL。

1.5 基因表達

樣品RNA的提取,cDNA合成,熒光定量PCR的方法參見參考文獻[12],本實驗選定下丘腦、垂體激素相關(guān)基因Gnrh2, Gnrh3, Fshβ與Lhβ進行測定,引物序列見表1。

表1 測定基因的引物序列

2 結(jié)果與討論

2.1 Nano-TiO2對TBOEP生物累積的影響

如圖1(a)和(b)可見,TBOEP在鯽魚體內(nèi)的累積具有組織差異性,肝臟、腦和性腺器官的蓄積含量逐漸降低。同時,TBOEP的單一暴露組與復合暴露組中,TBOEP在魚體中累積均存在濃度依賴關(guān)系,并且在復合暴露組中TBOEP的累積濃度顯著高于單一暴露組,同時雌魚體內(nèi)的TBOEP的累積濃度高于雄魚,其中的原因有可能是由于攝取、代謝、分布 以及清除的能力不同,也可能是由于不同性別對營養(yǎng)需求,攝食行為以及各種生理活動的差異,從而影響了污染物的積累。同時,考慮的TBOEP的相對疏水性,雌性和雄性攝取的差異也可能是由于不同脂質(zhì)含量引起的。

圖1 TBOEP在鯽魚內(nèi)累積的組織差異性 (a) 雌魚;(b) 雄魚

2.2 Nano-TiO2與TBOEP 對鯽魚性激素水平的影響

如表2所示,與空白對照組相比,所有暴露組暴露7 d后的睪酮與雌二醇均高于相同暴露濃度的對照組。 Nano-TiO2暴露組血清中睪酮與雌二醇的含量與對照組沒有顯著的差別。在TBOEP單獨暴露組中,隨著TBOEP的暴露濃度從0.05 μg/L增加到0.5 μg/L,睪酮與雌二醇的含量雖然有所增加,但是與對照組相比沒有顯著的差異。7 d后,在復合暴露組中,0.5 μg/L T+N暴露組睪酮的水平從單一暴露組的0.54±0.03 μg/mL 顯著增加至0.61±0.03 μg/mL;0.05 μg/L T+N暴露組雌二醇的水平從單一暴露組的對照組的0.23±0.005 μg/mL顯著增加至0.24±0.01 μg/mL,0.5 μg/L T+N暴露組雌二醇的水平從單一暴露組的對照組的0.22±0.03 μg/mL顯著增加至0.29±0.01 μg/mL,說明nano-TiO2能夠顯著增強TBOEP對于鯽魚性激素的干擾作用,進而加劇TBOEP的生殖毒性。

表2 不同暴露組對鯽魚性激素水平的影響

2.3 Nano-TiO2與TBOEP對鯽魚HPG軸基因表達的影響

本實驗測定了HPG關(guān)鍵基因促性腺激素釋放激素(Gnrh2和Gnrh3)、卵泡刺激素(Fshβ)以及促黃體激素(Lhβ)相對定量表達。結(jié)果如圖2所示,0.05 μg/L TBOEP單獨暴露組以及0.5 μg/L T+N復合暴露組Gnrh2與Fshβ基因的表達較對照組顯著增加;所有暴露組Gnrh3表達雖然較對照組有所增加,但是沒有顯著差異;Lhβ基因只有在0.05 μg/L T+N以及0.5 μg/L T+N復合暴露組與對照組存在顯著差異。復合暴露組Gnrh2、Fshβ與Lhβ基因表達高于單一暴露組。性激素是決定魚體生殖抑制的重要生物標志物,因為性別激素濃度的變化可能在隨后的受精階段導致生殖功能障礙。促性腺激素釋放激素Gnrh2的異常表達必定感染性激素的釋放[13]。

同時,在魚類中,FSH和LH從腦垂體分泌并與其受體結(jié)合以刺激類固醇的產(chǎn)生和配子發(fā)生。FSH主要控制生長階段(卵黃發(fā)生/精子發(fā)生),LH主要控制卵母細胞成熟/精子期[13]。因此,復合暴露組Fshβ與Lhβ異常表達表明,與單一暴露相比,nano-TiO2暴露可能影響卵黃發(fā)生和配子發(fā)生的進展,導致成年鯽魚的配子發(fā)生和配子成熟功能障礙的惡化。

*p<0.05與**p<0.01表示暴露組與對照組相比差異顯著圖2 鯽魚HPG軸基因表達

3 結(jié) 論

本研究以土著鯽魚為受試生物,系統(tǒng)地研究nano-TiO2與TBOEPP復合暴露對鯽魚生殖系統(tǒng)的影響,研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)TBOEP在鯽魚體內(nèi)的累積具有組織差異性,肝臟、腦和性腺器官的蓄積含量逐漸降低,且雌魚體內(nèi)的TBOEP的累積濃度高于雄魚。同時,Nano-TiO2能夠顯著增強TBOEP對于鯽魚性激素的擾亂作用,干擾卵黃發(fā)生和配子發(fā)生,加劇TBOEP的繁殖毒性。