阮 鳴,王珍珍,賁愛(ài)玲,唐怡欣

(南京曉莊學(xué)院 食品科學(xué)學(xué)院,江蘇 南京 211171)

黃芪鱔魚(yú)湯是由黃芪、鱔魚(yú)和山藥配伍而成的驗(yàn)方,具有補(bǔ)血益氣、提高機(jī)體免疫力的功效,被廣泛應(yīng)用于臨床輔助治療腫瘤化療后白細(xì)胞減少癥[1-4]?；熥畛Ｒ?jiàn)的毒副反應(yīng)是粒細(xì)胞為主的白細(xì)胞數(shù)量呈進(jìn)行性下降,導(dǎo)致人體防御能力降低,誘導(dǎo)各種并發(fā)癥產(chǎn)生,威脅患者的生命[5,6]。雖然使用粒細(xì)胞集落刺激因子等升白藥物能提升白細(xì)胞的數(shù)量,但維持時(shí)間短,長(zhǎng)期使用還存在諸多不良反應(yīng)[7,8]。黃芪鱔魚(yú)湯中的黃芪和山藥均為藥食同源之品,《本草綱目》也記載了黃鱔的獨(dú)特效用,因此該湯“寓醫(yī)于食”,既將藥物作為食材,又將食物賦以藥用,不僅降低了病人服藥的痛苦,還大大提升了白細(xì)胞減少癥的治療效果。

黃芪主要含有多糖、皂苷和黃酮類(lèi)活性成分,可改善免疫系統(tǒng),并具有一定的抗癌作用和顯著的抗癌輔助治療作用[9,10]。山藥富含甾體皂苷類(lèi)、多糖、黃酮類(lèi)、酚苷類(lèi)等有效成分,具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗炎等多種藥理作用[11]。黃鱔俗稱(chēng)鱔魚(yú),其肌肉中粗蛋白含量較高,氨基酸種類(lèi)齊全,必需氨基酸、鮮味氨基酸含量豐富,屬于高蛋白的優(yōu)質(zhì)魚(yú)類(lèi)[12,13]。黃芪鱔魚(yú)湯的治療作用來(lái)源于其有效成分,而有效成分的溶出與加工工藝密切相關(guān)。因此,本實(shí)驗(yàn)擬以黃芪鱔魚(yú)湯中多糖、皂苷、黃酮為代表的功能成分和以蛋白質(zhì)為代表的營(yíng)養(yǎng)成分的含量為指標(biāo),結(jié)合感官評(píng)定,篩選活性組分含量高、口感佳的藥膳湯加工工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

D-無(wú)水葡萄糖,上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司(分析對(duì)照品,貨號(hào)R017243);黃芪甲苷,上海源葉生物科技有限公司(分析標(biāo)準(zhǔn)品,HPLC≥98%,貨號(hào)B20564);蘆丁,北京萬(wàn)佳首化生物科技有限公司(對(duì)照品,HPLC≥98%,貨號(hào)BW1681);黃芪,南京市益豐大藥房湖西街店;鱔魚(yú)、山藥(鮮品),南京市蘇果超市仙林高科榮境社區(qū)店;其余試劑均為市售分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

RE-52A型旋轉(zhuǎn)濃縮蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;L6S 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海儀電分析儀器有限公司;K9860全自動(dòng)凱氏定氮儀,SH220N石墨消解儀 山東海能科學(xué)儀器有限公司;LD5-10B低速大容量離心機(jī) 北京雷勃爾醫(yī)療器械有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 鱔魚(yú)的前處理方法

熱燙法:用200 mL的沸水淋在50 g鱔魚(yú)上,1 min后撈出。

浸泡法:取500 mL常溫水浸泡50 g鱔魚(yú),30 min后撈出。

鹽搓法:取50 g食鹽均勻撒在50 g鱔魚(yú)上,小心揉搓,直到滑膩黏膜完全去除。

鱔魚(yú)通過(guò)前處理可達(dá)到去血、去粘膜、去腥的目的,然后再洗凈,切段,備用。

1.3.2 黃芪鱔魚(yú)湯樣品的制備

按照黃芪鱔魚(yú)湯的配方[1-4]:“黃芪30 g,新鮮山藥(去皮)100 g,鱔魚(yú)50 g”備好食材,并按照下述方法制湯。

水煮法:黃芪、鱔魚(yú)和山藥不經(jīng)油炒,直接加水1000 mL、生姜少許,大火煮沸后改小火燉1 h,起鍋前加蔥花及食鹽少許。

油炒法:黃芪、鱔魚(yú)和山藥經(jīng)油炒(5 g烹調(diào)食用油,翻炒4 min), 再加水1000 mL,隨后同水煮法熬湯。

將熱燙水煮、鹽搓水煮、浸泡水煮、熱燙油炒、鹽搓油炒和浸泡油炒六種工藝制得的湯汁用紗布過(guò)濾,濾液減壓濃縮至85 mL,即得各黃芪鱔魚(yú)湯樣品。每份樣品平行制備三次,分別標(biāo)號(hào)為第①組、第②組、第③組。

1.3.3 感官鑒評(píng)

本次實(shí)驗(yàn)的評(píng)價(jià)小組由隨機(jī)選取的10人組成,根據(jù)本產(chǎn)品特性,結(jié)合劉暢等人的研究,采用單盲法對(duì)黃芪鱔魚(yú)湯的菜品口感、湯汁色澤外觀、湯品滋味三個(gè)方面按表1進(jìn)行評(píng)分[14],綜合評(píng)分100分。具體分項(xiàng)為:菜品口感20分,色澤外觀20分,湯品滋味60分。

表1 感官鑒評(píng)評(píng)分表

1.3.4 硫酸蒽酮法測(cè)定多糖含量

1.3.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱(chēng)取0.0105 g D-無(wú)水葡萄糖,加蒸餾水溶解,并定容至100 mL,得0.105 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。另準(zhǔn)確稱(chēng)取0.100 g蒽酮,加200 mL濃硫酸充分溶解,制得0.05%硫酸蒽酮溶液,現(xiàn)配現(xiàn)用。取具塞試管8支,編號(hào),按照表2的要求,依次向?qū)?yīng)的試管中加入相應(yīng)的試劑[15,16]。

表2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

各試管內(nèi)溶液混合均勻后,置沸水浴中加熱20 min,取出,迅速冷卻后再置冰水浴中15 min,試管內(nèi)溶液倒入比色皿,以相應(yīng)試劑為空白,放入可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè),檢測(cè)波長(zhǎng)為625 nm。以吸光度為縱坐標(biāo)、葡萄糖質(zhì)量為橫坐標(biāo),繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4.2 黃芪鱔魚(yú)湯中多糖的含量測(cè)定

參照文獻(xiàn)[15,16]方法測(cè)定黃芪鱔魚(yú)湯中多糖含量,具體步驟為:精密量取1.3.2節(jié)下樣品5 mL,加入95%的乙醇溶液至醇濃度為80%,冷藏過(guò)夜,離心過(guò)濾10 min,轉(zhuǎn)速為4000 r/min,棄去上清液,沉淀加蒸餾水溶解,并定容至10 mL。吸取該溶液0.25～0.60 mL,置于10 mL具塞試管中,加蒸餾水至2 mL,再加入硫酸蒽酮溶液6 mL,混合均勻,置沸水浴中加熱20 min,再在冰水浴中放置15 min,測(cè)得相應(yīng)吸收度值,并根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算黃芪鱔魚(yú)湯樣品中多糖的含量。

1.3.5 凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)含量

稱(chēng)取1.3.2項(xiàng)下魚(yú)湯樣品15 g,精確至0.0001 g,移入消化管,參照GB 5009.5—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》中的分光光度法測(cè)定黃芪鱔魚(yú)湯中蛋白質(zhì)的含量。全自動(dòng)凱氏定氮儀參數(shù)設(shè)置:標(biāo)準(zhǔn)酸溶液1000 mL,蛋白系數(shù)5.71,硼酸30 mL,稀釋水20 mL,堿液40 mL,蒸餾5 min。

1.3.6 香莢蘭醛-高氯酸法測(cè)定皂苷含量

1.3.6.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱(chēng)定黃芪甲苷對(duì)照品0.0067 g,用甲醇溶解,并定容至10 mL。取10 mL的具塞試管8支,編號(hào)0～7號(hào),依次準(zhǔn)確吸取0、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35 mL的黃芪甲苷對(duì)照品溶液加入試管中,在105 ℃烘箱中使其充分干燥后,冷卻至室溫,依次向各試管中加入5%香莢蘭醛冰醋酸溶液0.2 mL、高氯酸1.2 mL,混合均勻,80 ℃水浴加熱25 min,取出,快速冷卻,再加入冰醋酸5 mL,迅速搖勻,以相應(yīng)試劑為空白,放入可見(jiàn)分光光度計(jì)中,將檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)為540 nm,讀數(shù)即為對(duì)應(yīng)的吸收度值。以吸光度為縱坐標(biāo),以黃芪甲苷質(zhì)量為橫坐標(biāo),繪制黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.6.2 黃芪鱔魚(yú)湯中皂苷的含量測(cè)定

參照文獻(xiàn)[17,18]方法測(cè)定黃鱔魚(yú)湯中皂苷含量,具體步驟為:精密量取1.3.2節(jié)下樣品溶液5～15 mL,抽濾,濾液加水飽和正丁醇10 mL萃取,正丁醇層備用,水層再重復(fù)萃取5次。將6次正丁醇層溶液合并,加1% NaOH水溶液30 mL洗滌,棄去水層,正丁醇層同法再洗滌1次,然后加正丁醇飽和的水30 mL萃取,最后將正丁醇層溶液置蒸發(fā)皿中,水浴蒸干,殘?jiān)眉状既芙?并定容至25 mL。精密量取該殘?jiān)芤? mL,并定容至10 mL,離心10 min,轉(zhuǎn)速為4000 r/min,準(zhǔn)確量取離心液0.5 mL,按標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法測(cè)定,并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算湯中總皂苷的含量。

1.3.7 NaNO2-Al(NO3)3比色法測(cè)定黃酮含量

1.3.7.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確稱(chēng)取蘆丁對(duì)照品10.5 mg,加無(wú)水乙醇溶解,并定容至25 mL,得0.42 mg/mL的蘆丁對(duì)照品溶液。精密量取蘆丁對(duì)照品溶液0.6、1.0、1.4、1.8、2.2、2.6 mL,分別置于25 mL容量瓶中,再在每個(gè)容量瓶?jī)?nèi)加入5% NaNO2溶液1 mL,搖勻后靜置6 min,繼續(xù)加入10% Al(NO3)3溶液1 mL,搖勻后靜置6 min,最后加入4% NaOH溶液10 mL,并用無(wú)水乙醇定容至刻度,搖勻后靜置15 min,以試劑空白為對(duì)照,在510 nm處測(cè)定吸光度值,以蘆丁質(zhì)量濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)(X),吸光度值為縱坐標(biāo)(Y),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.7.2 黃芪鱔魚(yú)湯中黃酮的含量測(cè)定

參照文獻(xiàn)[19,20]方法測(cè)定黃芪鱔魚(yú)湯中黃酮含量,具體步驟為:精密量取1.3.2節(jié)下樣品溶液5 mL,抽濾,濾液放入蒸發(fā)皿中置水浴蒸干,加10 mL無(wú)水乙醇溶解,溶液離心10 min,轉(zhuǎn)速為4000 r/min,取上清液于100 mL容量瓶中,加無(wú)水乙醇定容,精密量取該溶液1～2 mL置于另一25 mL容量瓶中,按照標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下方法進(jìn)行顯色反應(yīng)和吸光度測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 感官鑒評(píng)

根據(jù)表3可知,鹽搓油炒法制備的黃芪鱔魚(yú)湯綜合評(píng)價(jià)分值最高,主要因?yàn)槠錅纷涛逗蜕珴赏庥^分值占比高,達(dá)73.6分。雖然浸泡水煮的菜品口感分?jǐn)?shù)最高,且高出鹽搓油炒47.2%,但是其綜合評(píng)價(jià)分值最低,僅為52.3分,因此浸泡水煮法和熱燙水煮法不適合黃芪鱔魚(yú)湯的制備(綜合評(píng)價(jià)不及格)。此外還可以看出,油炒后再水煮(表3中3種油炒法,下同)的湯在色澤外觀、湯品滋味和綜合評(píng)價(jià)中的分?jǐn)?shù)均較高,說(shuō)明油炒是影響黃芪鱔魚(yú)湯感官的關(guān)鍵加工工藝;直接水煮制備的湯總評(píng)分值普遍較低,但就熱燙、鹽搓和浸泡三種處理鱔魚(yú)的方式來(lái)看,鹽搓法更勝一籌。這兩點(diǎn)也說(shuō)明了鹽搓油炒法總評(píng)分值最高的原因?？傮w看來(lái),藥膳湯的感官評(píng)價(jià)分值無(wú)法和普通魚(yú)湯相比,最高也未能達(dá)到90分以上,這與藥膳湯不加過(guò)多調(diào)料有關(guān)。

表3 不同加工方法對(duì)黃芪鱔魚(yú)湯感官的影響

2.2 硫酸蒽酮法測(cè)定多糖含量

標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為y=2.8741x+0.0151,R2=0.9991>0.999,說(shuō)明葡萄糖質(zhì)量在0.021～0.147 mg之間線性關(guān)系良好。

由表4可看出,直接水煮制備的黃芪鱔魚(yú)湯中多糖含量均遠(yuǎn)高于油炒后水煮的湯,說(shuō)明水煮法是獲得多糖的關(guān)鍵工藝條件,這可能與多糖的水溶性相關(guān)。其次在三種油炒法中,鹽搓油炒的湯中多糖含量最高,分別比熱燙油炒法和浸泡油炒法高出46.3%和56.9%,表明鹽搓法可以促進(jìn)多糖的溶出,是增加多糖含量的次關(guān)鍵加工工藝。因此,鹽搓水煮的湯中多糖含量最高。

此外,浸泡水煮、熱燙油炒、鹽搓油炒和浸泡油炒四種制備工藝所得湯中的多糖含量均顯著低于鹽搓水煮組(P<0.01),熱燙水煮法和鹽搓水煮法之間雖未見(jiàn)顯著差異(P>0.05),但后者在均數(shù)上依然優(yōu)于前者。

由于熱燙油炒法和浸泡油炒法的多糖含量過(guò)低,故不建議使用這兩種方法制備黃芪鱔魚(yú)湯。

表4 85 mL黃芪鱔魚(yú)湯中多糖質(zhì)量的測(cè)定結(jié)果 單位:mg

2.3 凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)含量

表5的數(shù)據(jù)顯示,6種加工方法對(duì)蛋白質(zhì)的影響與多糖極為相似,即水煮法是獲得蛋白質(zhì)的關(guān)鍵加工工藝,這可能與蛋白質(zhì)的水溶性有關(guān);鹽搓法不管是與水煮法搭配還是與油炒法并用,都可以明顯促進(jìn)蛋白質(zhì)的溶出,是增加蛋白質(zhì)含量的次關(guān)鍵加工工藝。因此,鹽搓水煮的湯中蛋白質(zhì)含量最高。其中熱燙油炒法制得的湯中蛋白質(zhì)含量?jī)H為鹽搓水煮的1/5,故不適宜黃芪鱔魚(yú)湯的制備。此外,與鹽搓水煮法相比,其他5種加工工藝制備的湯中蛋白質(zhì)含量均顯著低于鹽搓水煮組(P<0.01)。

表5 85 mL黃芪鱔魚(yú)湯中蛋白質(zhì)質(zhì)量的測(cè)定結(jié)果 單位:mg

2.4 香莢蘭醛高氯酸法測(cè)定皂苷含量

標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為y=4.122x-0.0246,R2=0.9990≥0.999,說(shuō)明在黃芪甲苷含量為0.0670～0.2375 mg之間線性關(guān)系良好。

從表6的數(shù)據(jù)可以看出,油炒法制備的湯中皂苷含量均高于水煮法,這與皂苷的溶解性一致;鹽搓法比熱燙法和浸泡法更有利于提高皂苷的含量。與鹽搓油炒法相比,其他5種加工工藝制備的湯中皂苷含量均顯著低于鹽搓油炒組(P<0.01,P<0.05)。鹽搓油炒組的皂苷含量高于鹽搓水煮組84.9%。因此,鹽搓油炒是黃芪鱔魚(yú)湯中皂苷溶出的關(guān)鍵加工工藝。

表6 85 mL黃芪鱔魚(yú)湯中皂苷質(zhì)量的測(cè)定結(jié)果 單位:mg

2.5 NaNO2-Al(NO3)3比色法測(cè)定黃酮含量

標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為y=19.749x+0.0016,R2=0.9993≥0.999,說(shuō)明在蘆丁含量在0.0101～0.0437 mg/mL之間線性關(guān)系良好。

由表7可知,6種制備方法對(duì)湯中黃酮的影響與皂苷相似:鹽搓油炒是黃芪鱔魚(yú)湯中黃酮溶出的關(guān)鍵加工工藝,其制備的湯中黃酮含量最高,且高于鹽搓水煮法78.3%。與鹽搓油炒法相比,其他5種加工工藝制備的湯中黃酮含量均顯著低于鹽搓油炒組(P<0.01)。結(jié)合表6和7可看出,浸泡水煮法加工的湯中皂苷和黃酮含量均最低,故不宜用于黃芪鱔魚(yú)湯的制備。

表7 85 mL黃芪鱔魚(yú)湯中黃酮質(zhì)量的測(cè)定結(jié)果 單位:mg

3 討 論

黃芪鱔魚(yú)湯是藥食兩用湯劑,且其療效已在人體上得到驗(yàn)證[1-4],因此從功能性和營(yíng)養(yǎng)性角度考察其加工工藝很有意義。《中國(guó)藥典》規(guī)定,黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bge. var.mongholicus(Bge.)Hsiao或膜莢黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根,性微溫、味甘,為我國(guó)傳統(tǒng)補(bǔ)氣中藥材,主要含有多糖、皂苷和黃酮類(lèi)活性物質(zhì)。已有研究表明黃芪多糖可通過(guò)提高免疫器官指數(shù)、促進(jìn)免疫細(xì)胞增殖、刺激細(xì)胞因子釋放、影響免疫球蛋白分泌和免疫信號(hào)傳導(dǎo)來(lái)調(diào)節(jié)免疫功能;也能通過(guò)增強(qiáng)免疫、抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移等作用,顯示出其特有的抗腫瘤特性[21]。此外黃芪皂苷被認(rèn)為是結(jié)腸癌治療中一種有效的輔助藥物,能與其他西藥化療藥物聯(lián)合使用以減少后者的副作用[22]。黃芪中的兩個(gè)三萜糖苷型皂苷在不刺激小鼠炎癥細(xì)胞因子的情況下可產(chǎn)生強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)作用[23]。此外黃酮亦是黃芪的主要免疫調(diào)節(jié)成分之一[24]。山藥為薯蕷科植物薯蕷DioscoreaoppositaThunb.的干燥根莖,性平、味甘。山藥多糖具有免疫調(diào)節(jié)、自由基清除活性[25]。山藥皂苷元可抑制肝癌細(xì)胞中一種致癌因子(TAZ)的表達(dá),從而間接抑制肝癌細(xì)胞的增長(zhǎng)、誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的凋亡、抑制肝癌細(xì)胞遷移和侵襲[26]。山藥黃酮是有效的抗氧化活性物質(zhì),可有效的清除體內(nèi)自由基,預(yù)防腫瘤,并對(duì)山藥的感官和風(fēng)味產(chǎn)生影響[27]。鱔魚(yú)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富,其中蛋白質(zhì)高達(dá)180 mg/g[28]。鱔魚(yú)中的優(yōu)質(zhì)蛋白有助于增強(qiáng)人體抵抗力,故選為黃芪鱔魚(yú)湯的營(yíng)養(yǎng)性成分指標(biāo)。黃芪鱔魚(yú)湯可以輔助治療腫瘤化療后白細(xì)胞減少癥,這與其促進(jìn)人體免疫功能密切有關(guān)[1],而后者已被證明是治療免疫相關(guān)疾病(例如癌癥)的重要手段[24]。因此黃芪和山藥中的多糖、皂苷和黃酮是黃芪鱔魚(yú)湯的功能性成分。

綜上所述,鹽搓水煮法和鹽搓油炒法更加適宜黃芪鱔魚(yú)湯的制備,因此鹽搓黃鱔是該湯加工的關(guān)鍵工藝,有利于功能成分和營(yíng)養(yǎng)成分的溶出。油炒是影響黃芪鱔魚(yú)湯風(fēng)味的關(guān)鍵工藝條件,同時(shí)也是提高湯中皂苷和黃酮含量的有效方法;不油炒直接水煮能增加多糖和蛋白質(zhì)的溶出,故也是不可缺少的加工工藝。黃芪鱔魚(yú)湯既可以應(yīng)用于臨床治病,又可以作為家庭日常保健飲食。因此,本論文的研究結(jié)果不僅為科學(xué)制備黃芪鱔魚(yú)湯提供了依據(jù),也為日后方便黃芪鱔魚(yú)湯的工業(yè)化生產(chǎn)提供了參考。