張 娟， 其樂木格， 段海婧,b， 張金保,b， 晉 玲,b,c， 陳紅剛,b,c,①， 趙文龍,b,c,①

(甘肅中醫(yī)藥大學(xué)： a. 藥學(xué)院， b. 西北中藏藥省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心， c. 甘肅省珍稀中藥資源評價與保護利用工程研究中心， 甘肅 蘭州 730000)

羌活(NotopterygiumincisumTing ex H. T. Chang)為中藥羌活的來源之一。中藥羌活別名有羌青、護羌使者、胡王使者、羌滑、退風(fēng)使者和黑藥等；性溫，味辛、苦，入膀胱、腎經(jīng)，具有解表散寒、祛風(fēng)除濕、止痛的功效，用于風(fēng)寒感冒、頭痛項強、風(fēng)濕痹痛、肩背酸痛，主產(chǎn)于甘肅、四川、青海等地，是中、藏、羌醫(yī)藥體系中的常用藥[1-2]。2013年，羌活在由中華人民共和國環(huán)境保護部和中國科學(xué)院聯(lián)合編制的《中國生物多樣性紅色名錄——高等植物卷》中被收錄為近危(NT)物種。

據(jù)記載，羌活單味藥及復(fù)方制劑涉及30多種劑型，260多個成方，約280個品種。近年來，隨著中醫(yī)藥大健康產(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展，羌活的市場需求量急劇增加，野生羌活資源瀕臨枯竭。因羌活種子休眠嚴(yán)重[3-4](自然狀態(tài)下發(fā)芽率僅0.52%)，目前只有部分地區(qū)試種成功，尚無法進(jìn)行大規(guī)模人工種植。層積處理是常見的打破種子休眠的方法，可使種子種皮軟化，增強種子內(nèi)部代謝活動，還可促進(jìn)種子完成一系列生理生化變化和后熟，變溫層積處理是用高溫與低溫交替進(jìn)行的層積方法，可以加速種子發(fā)芽[5]。如大百合〔Cardiocrinumgiganteum(Wall.) Makino〕[6]和北五味子〔Schisandrachinensis(Turcz.) Baill.〕[7]種子經(jīng)變溫層積后，種胚完成形態(tài)后熟而萌發(fā)。變溫層積過程中營養(yǎng)物質(zhì)含量、呼吸途徑關(guān)鍵酶活性以及內(nèi)源激素含量的變化與種胚發(fā)育密不可分。如變溫層積過程中種子可溶性糖含量增加，淀粉和可溶性蛋白質(zhì)含量降低[8]，葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G-6-PDH)活性升高[9]，脫落酸(ABA)含量降低，赤霉素(GA3)和吲哚乙酸(IAA)含量升高[10]，均是種子休眠解除的原因之一。

羌活種子的休眠特性是其資源瀕臨枯竭的主要原因，與常溫層積相比，變溫(15 ℃～25 ℃/2 ℃～5 ℃)層積可縮短其解除休眠的時間[4]。目前，對羌活種子層積過程中種胚形態(tài)及生理生化變化的相關(guān)研究較少，僅對羌活種子種胚后熟過程中內(nèi)源激素含量變化有所研究[11]，對貯藏物質(zhì)和呼吸途徑關(guān)鍵酶并沒有進(jìn)行系統(tǒng)的研究，不利于羌活種子休眠解除機制的研究。鑒于此，本研究對層積過程中羌活種子種胚發(fā)育和生理生化指標(biāo)的變化進(jìn)行了研究，并分析了種胚發(fā)育與生理生化指標(biāo)間的相關(guān)性，旨在明確羌活種子種胚發(fā)育和生理生化變化與種子休眠解除的內(nèi)在聯(lián)系，探究羌活種子萌發(fā)機制，建立種子休眠解除方法，為羌活野生資源保護、引種馴化、規(guī)模化種植提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試羌活種子于2020年9月采自甘肅省甘南藏族自治州瑪曲縣歐拉秀瑪鄉(xiāng)(具體地理坐標(biāo)為東經(jīng)101°06′28.46″、北緯34°15′02.64″，海拔3 471 m)，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)晉玲教授鑒定為羌活種子，采摘后去除雜質(zhì)，先用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%次氯酸鈉消毒5 min，再用蒸餾水沖洗3～5次，于室內(nèi)通風(fēng)處陰干，分裝于10 cm×15 cm網(wǎng)袋(40目)中，共分裝14袋，其中7袋每袋1 g，編號0-F至6-F，剩余7袋每袋3 g，編號0-J至6-J，備用。

河沙來源于蘭州市黃河邊(具體地理坐標(biāo)為東經(jīng)103°48′52.48″、北緯34°03′57.21″)，用水洗去泥土及雜質(zhì)，185 ℃烘干約3 h，過40目篩，高壓滅菌鍋121 ℃滅菌30 min，加入無菌水將沙子濕度保持在9%～11%，備用。

1.2 方法

1.2.1 變溫層積處理 參考文獻(xiàn)[9]中的方法進(jìn)行變溫層積處理。在容器(30 cm×40 cm聚丙烯盒)底部平鋪厚度4 cm的沙子，將分裝好的羌活種子平鋪在其表面，再蓋上一層沙子，用保鮮膜封住容器，用鑷子打孔(12個)透氣。先將容器置于室溫(20 ℃～25 ℃)90 d，后移入3 ℃～5 ℃冰箱90 d。分別在層積0(即未層積處理，取出樣品0-F和0-J)、30(取出樣品1-F和1-J)、60(取出樣品2-F和2-J)、90(取出樣品3-F和3-J)、120(取出樣品4-F和4-J)、150(取出樣品5-F和5-J)和180 d(取出樣品6-F和6-J)取樣，取出后通風(fēng)處陰干，將樣品0-F至6-F置于4 ℃冰箱中保存，用于后續(xù)種胚形態(tài)及發(fā)芽指標(biāo)的觀測，樣品0-J至6-J置于-80 ℃冰箱中保存，用于后續(xù)生理生化指標(biāo)的測定。

1.2.2 種子種胚形態(tài)及胚率觀測 樣品0-F至6-F中，每份樣品選取羌活種子30粒，蒸餾水浸泡12 h，先用OCT膠水進(jìn)行常溫包埋，然后置于-20 ℃條件下冷凍包埋5 min，采用Leica-CM1950型恒冷切片機(德國Leica公司)切片(厚度0.12 mm)，在Leica DM500顯微鏡(德國Leica公司)下觀察種子形態(tài)結(jié)構(gòu)，并隨機取20粒種子用顯微鏡測量種子的胚長(種胚底端至頂端的長度)和胚乳長(胚乳底端至頂端的長度)，取平均值計算種子的胚率，計算公式為胚率=(胚長/胚乳長)×100%[10,12]。

1.2.3 種子生理生化指標(biāo)測定 采用考馬斯亮藍(lán)法[16-17]測定羌活種子蛋白質(zhì)含量，采用蒽酮比色法[16-17]測定可溶性糖和淀粉含量，采用丙酮酸激酶(PK)活性檢測法[17-18]測定PK活性，采用硫酸甲酯吩嗪反應(yīng)法[17-18]測定琥珀酸脫氫酶(SDH)活性，這5個指標(biāo)均使用購自南京建成生物工程研究所的試劑盒測定，試劑盒批號分別為20210622、20210422、20210429、20210329和202210329。采用酶聯(lián)免疫法[17-18]測定葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G-6-PDH)活性、赤霉素(GA3)含量、吲哚乙酸(IAA)含量和脫落酸(ABA)含量，這4個指標(biāo)均采用購自上海欽成生物科技有限公司的ELISA試劑盒測定，試劑盒批號均為202103，并據(jù)此計算GA3/ABA比、IAA/ABA比和(GA3+IAA)/ABA比。每個處理重復(fù)測定3次。

1.2.4 種子發(fā)芽指標(biāo)測定 預(yù)實驗結(jié)果顯示：層積后的羌活種子(空白對照)的發(fā)芽率不足10%，而添加400 mg·L-1氟啶酮處理的結(jié)果較好，故本試驗選擇400 mg·L-1氟啶酮處理羌活種子。樣品0-F至6-F中，每份樣品隨機選取羌活種子150粒，用400 mg·L-1氟啶酮溶液(批號F809822、純度99%，購于上海麥克林生化科技股份有限公司)浸泡24 h，蒸餾水沖洗3～5次，將種子上殘留的氟啶酮溶液沖洗干凈，播于沙床上，每培養(yǎng)皿(直徑9 cm)播種50粒，3次重復(fù)。將培養(yǎng)皿置于光照度3 000 lx、光照時間12 h·d-1、溫度20 ℃條件下培養(yǎng)，每日加入適量蒸餾水，記錄萌發(fā)種子數(shù)(以胚根突破種皮為種子萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn))，第12天統(tǒng)計發(fā)芽勢，第25天計算發(fā)芽率，計算公式分別為發(fā)芽勢=(第12天發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù))×100%，發(fā)芽率=(發(fā)芽種子總數(shù)/供試種子數(shù))×100%[12-15]。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析

采用EXCEL 2013軟件對獲得的實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和分析，采用SPSS 28.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、多重比較和Pearson相關(guān)性分析，采用Origin 2021軟件制圖。

2 結(jié)果和分析

2.1 層積過程中羌活種子種胚生長發(fā)育動態(tài)

在整個層積過程中，羌活種子種胚不斷發(fā)育，胚率總體持續(xù)升高，種胚形態(tài)變化見圖1，胚率變化見圖2。結(jié)果顯示：未層積(層積0 d)時種胚為球形胚(圖1-A)，胚率為7.53%，種子仍處于休眠狀態(tài)；層積30～90 d時，種胚發(fā)育緩慢(圖1-B，C，D)，胚率從13.33%升高至17.09%；層積120 d時，種胚發(fā)育為心形胚(圖1-E)，胚率顯著升高至36.65%；層積150 d時，種胚分化出完整的胚芽、胚軸和胚根(圖1-F)，胚率顯著升高至57.35%；層積180 d時，種胚發(fā)育為子葉型胚(圖1-G)，胚率顯著升高至67.30%，種胚后熟過程完成。

Em: 種胚 Embryo.

不同小寫字母表示不同層積時間處理在0.05水平差異顯著Different lowercases indicate the significant difference among different stratification time treatments at 0.05 level.

2.2 層積過程中羌活種子生理生化指標(biāo)的變化

2.2.1 種子營養(yǎng)物質(zhì)含量的變化 結(jié)果(表1)顯示：羌活種子的蛋白質(zhì)含量在層積過程中總體呈降低的趨勢，在層積0～120 d持續(xù)降低，在層積150 d時略升高，在層積180 d時降至最小值(22.39 mg·g-1)，層積60～180 d的種子蛋白質(zhì)含量與層積0 d(未層積)差異顯著?？扇苄蕴呛吭趯臃e過程中波動較小，但在層積0～60 d呈降低的趨勢，且在層積60 d時降至最小值(33.30 mg·g-1)，此后波動升高，但均顯著低于未層積處理。淀粉含量在層積過程中總體呈先降低后升高的趨勢，在層積0～60 d呈降低的趨勢，且層積60 d時降至最小值(12.93 mg·g-1)，之后波動升高，但均顯著低于未層積處理。說明層積處理可顯著降低羌活種子中營養(yǎng)物質(zhì)的含量，為種子發(fā)育提供物質(zhì)和能量。

2.2.2 種子呼吸途徑關(guān)鍵酶活性的變化 結(jié)果(表1)顯示：羌活種子的丙酮酸激酶(PK)活性在層積30 d時較未層積處理顯著升高，在層積30～90 d呈顯著降低的趨勢，且在層積90 d時降至最小值(79.25 U·g-1)，之后逐漸升高，在層積180 d時升至最大值(264.17 U·g-1)。琥珀酸脫氫酶(SDH)活性在層積30 d時較未層積處理無顯著變化，在層積60 d時顯著高于層積0和30 d，在層積60～150 d呈波動降低的趨勢，在層積180 d時升至最大值(39.70 U·g-1)。葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G-6-PDH)活性在層積30 d時較未層積處理顯著降低，在層積30～120 d無顯著變化，在層積150 d時降至最小值(10.06 U·g-1)，在層積180 d時升至最大值(20.35 U·g-1)。說明層積處理可使羌活種子內(nèi)部代謝活動增強，有利于種胚發(fā)育。

2.2.3 種子內(nèi)源激素含量的變化 結(jié)果(表1)顯示：羌活種子的赤霉素(GA3)含量在層積過程中總體呈先升高后降低的趨勢，在層積0～120 d呈上升趨勢，在層積150 d時降至最小值(59.15 ng·g-1)，顯著低于未層積處理，在層積180 d時升至67.90 ng·g-1。吲哚乙酸(IAA)含量在14.06～22.08 ng·g-1范圍內(nèi)小幅度波動，在層積60 d時達(dá)到最大值(22.08 ng·g-1)，之后總體呈平緩降低的趨勢。脫落酸(ABA)含量在層積過程中總體呈先升高后降低的趨勢，在層積0～120 d無顯著變化，層積150和180 d的ABA含量顯著低于層積0～120 d，在層積150 d時降至最小值(82.39 ng·g-1)，在層積180 d時升至91.11 ng·g-1，但與層積150 d差異不顯著。

結(jié)果(表1)還顯示：羌活種子的GA3/ABA比、IAA/ABA比和(GA3+IAA)/ABA比在層積0～90 d無顯著變化，之后總體呈升高趨勢；層積120～180 d的GA3/ABA比和(GA3+IAA)/ABA比顯著高于層積0～90 d，但在層積120～180 d無顯著變化。總體上看，在層積過程中，(GA3+IAA)/ABA比的變幅最大，GA3/ABA比的變幅次之，IAA/ABA比的變幅較小。說明層積處理可使羌活種子內(nèi)促進(jìn)種子萌發(fā)的激素含量升高，抑制種子萌發(fā)的激素含量降低，有利于種子萌發(fā)。

表1 層積過程中羌活種子生理生化指標(biāo)的變化

2.3 層積過程中羌活種子發(fā)芽指標(biāo)的變化

對層積過程中羌活種子發(fā)芽情況進(jìn)行比較，結(jié)果見表2。結(jié)果顯示：層積過程中羌活種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢總體呈升高趨勢，層積0～90 d的發(fā)芽率和發(fā)芽勢較低，且均無顯著變化，層積120～180 d的發(fā)芽率和發(fā)芽勢顯著高于層積0～90 d，發(fā)芽率和發(fā)芽勢在層積180 d時升至最大值，分別為50.67%和35.33%。

表2 層積過程中羌活種子發(fā)芽指標(biāo)的變化

2.4 各指標(biāo)間的相關(guān)性分析

對羌活種子的胚率和發(fā)芽率與各生理生化指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果見表3。結(jié)果顯示：種子胚率與脫落酸(ABA)含量呈顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.800，與其余指標(biāo)相關(guān)性不顯著；發(fā)芽率與ABA含量呈極顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.875，與其余指標(biāo)相關(guān)性不顯著。

表3 羌活種子胚率和發(fā)芽率與各生理生化指標(biāo)間的相關(guān)系數(shù)

3 討論和結(jié)論

3.1 羌活種子后熟與種胚形態(tài)的關(guān)系

因胚的發(fā)育程度造成的種子休眠可分為3種情況，即胚的形態(tài)休眠、生理休眠以及2種方式同時存在所引起的綜合休眠[19]。綜合休眠的種子在后熟階段需要經(jīng)歷球形胚、心形胚、魚雷型胚才能發(fā)育完全，這在柴胡(BupleurumchinenseDC.)[20]、滇重樓〔Parispolyphyllavar.yunnanensis(Franch.)Hand.-Mzt.〕[16]、刺楸〔Kalopanaxseptemiobus(Thunb.) Koidz.〕[21]等植物中已得到證實。本研究中，羌活種子先在室溫(20 ℃～25 ℃)下層積90 d，后在低溫(3 ℃～5 ℃)下繼續(xù)層積90 d，觀測發(fā)現(xiàn)羌活種子種胚發(fā)育具有胚后熟特性，且層積處理可有效促進(jìn)種胚的發(fā)育，胚率總體持續(xù)升高，尤其是層積后期(低溫層積)的胚率顯著提高。張恩和等[4]的研究結(jié)果表明：羌活種子胚率僅6%，需經(jīng)過一段時間的后熟，才可發(fā)育為具有胚根、胚軸和子葉的完整胚，且層積過程中低溫可提高種胚的無氧呼吸作用，減少種胚的需氧量，從而克服包被組織造成的萌發(fā)障礙。由此推斷，層積處理可打破羌活種子形態(tài)休眠，且低溫對種胚形態(tài)休眠的解除至關(guān)重要。

3.2 羌活種子后熟與營養(yǎng)物質(zhì)含量的關(guān)系

種子萌發(fā)過程中需要消耗能量，為了給種胚的生長發(fā)育提供原料和能量，種子中貯藏的淀粉、蛋白質(zhì)和脂肪等大分子物質(zhì)在相關(guān)酶的作用下會轉(zhuǎn)化成種胚易于吸收的可溶性糖等小分子物質(zhì)，這些小分子物質(zhì)可為種胚的生長發(fā)育提供營養(yǎng)和能量[22-24]。黃精(PolygonatumsibiricumDelar. ex Redoute)[25]和百蕊草(ThesiumchinenseTurcz.)[26]種子在層積過程中，其淀粉含量逐漸降低，可溶性糖和蛋白質(zhì)含量升高，大分子物質(zhì)轉(zhuǎn)化為小分子物質(zhì)，為種胚的分化發(fā)育提供能量，促進(jìn)了萌發(fā)。說明種子內(nèi)貯藏物質(zhì)的積累與消耗，可反應(yīng)種子內(nèi)部代謝活動的強弱[27]。本研究結(jié)果顯示：在層積過程中羌活種子的蛋白質(zhì)、可溶性糖和淀粉含量總體呈降低趨勢。其中，蛋白質(zhì)含量在層積0～120 d逐漸降低，在層積150 d時顯著升高，在層積180 d時又顯著降低，可能是因為在種子發(fā)育過程中蛋白質(zhì)水解為氨基酸等其他小分子化合物，而后又和其他有機物質(zhì)合成新的蛋白質(zhì)，說明種子內(nèi)部代謝活動增強[27]。可溶性糖和淀粉含量在層積0～60 d逐漸降低，為種胚伸長生長提供能量，在層積90～180 d波動升高，可能是為后期種子的萌發(fā)儲存能量。

3.3 羌活種子后熟與呼吸途徑關(guān)鍵酶活性的關(guān)系

糖酵解途徑(EMP)、三羧酸循環(huán)途徑(TCA)和磷酸戊糖途徑(PPP)是植物體內(nèi)常規(guī)的呼吸代謝途徑，種子休眠和萌發(fā)與呼吸代謝途徑密切相關(guān)，丙酮酸激酶(PK)、琥珀酸脫氫酶(SDH)和葡萄糖-6-磷酸脫氫酸(G-6-PDH)分別作為EMP途徑、TCA途徑和PPP途徑的關(guān)鍵限速酶，一定程度上反映著相應(yīng)呼吸途徑的活化水平，通過對關(guān)鍵酶活性的測定，可以進(jìn)一步了解種子休眠的歷程[28-30]。如華重樓〔Parispolyphyllavar.chinensis(Franch.) Hara〕[31]種子在層積過程中G-6-PDH活性顯著升高，其呼吸代謝途徑從以TCA途徑為主轉(zhuǎn)為以PPP途徑為主，通過調(diào)控種子呼吸代謝途徑，促進(jìn)種子解除休眠。本研究結(jié)果顯示:在層積0～60 d， PK活性呈先升高后降低的趨勢，TCA途徑SDH活性呈明顯升高的趨勢，G-6-PDH活性先降低后略有升高，說明層積0～60 d期間以TCA途徑為主。層積60～150 d，PK活性呈波動升高的趨勢，SDH和G-6-PDH活性總體呈波動降低的趨勢，說明層積60～150 d期間以EMP途徑為主。在層積180 d時，PK、SDH和G-6-PDH活性均顯著高于層積120 d，且層積150～180 d的羌活發(fā)芽率以及胚率均顯著高于層積120 d，說明層積150～180 d的羌活種子內(nèi)部代謝活動顯著加強，利于種子休眠的解除。

3.4 羌活種子后熟與內(nèi)源激素含量的關(guān)系

植物激素對種子萌發(fā)有至關(guān)重要的調(diào)控作用，脫落酸(ABA)可以促進(jìn)種子休眠，抑制種子萌發(fā)。而赤霉素(GA3)可以解除種子休眠，促進(jìn)種子萌發(fā)[32-33]。金銀花(LonicerajaponicaThunb.)[34]和桃兒七〔Sinopodophyllumhexandrum(Royle) Ying〕[35]種子通過低溫層積可使種子內(nèi)部的GA3和IAA含量升高，ABA含量降低，降低了抑制種子萌發(fā)的內(nèi)源激素含量，進(jìn)而解除種子休眠。本研究結(jié)果表明：羌活種子的GA3和ABA含量在層積0～120 d內(nèi)無顯著差異，在層積150 d時顯著降低，在層積180 d時又有所升高，而吲哚乙酸(IAA)含量在層積過程中變化不大。影響種子休眠和萌發(fā)的因子不僅與植物內(nèi)源激素的絕對含量有關(guān)，還可能與種子內(nèi)源激素的協(xié)調(diào)有關(guān)，尤其是與促進(jìn)種子萌發(fā)和抑制種子萌發(fā)的激素有關(guān)[36]，如高水平的GA3/ABA比、IAA/ABA比和(GA3+IAA)/ABA比有助于打破種子休眠[37-38]。本研究結(jié)果表明：羌活種子的GA3/ABA比和(GA3+IAA)/ABA比在層積過程中總體呈升高趨勢，且層積120～180 d的GA3/ABA比和(GA3+IAA)/ABA比顯著高于層積0～90 d，而IAA/ABA比在層積過程中無顯著變化。相關(guān)性分析結(jié)果表明：種子胚率與ABA含量呈顯著負(fù)相關(guān)，發(fā)芽率與ABA含量呈極顯著負(fù)相關(guān)。說明層積處理可使種子內(nèi)促進(jìn)種子萌發(fā)的激素含量升高，抑制種子萌發(fā)的激素含量降低，提高種子的發(fā)芽率；且促進(jìn)種子萌發(fā)與抑制種子萌發(fā)的激素比值顯著升高對羌活種子休眠解除具有重要作用。

3.5 層積處理與羌活種子發(fā)芽情況的關(guān)系

種子的發(fā)芽情況可通過發(fā)芽率和發(fā)芽勢等指標(biāo)進(jìn)行評價，發(fā)芽率和發(fā)芽勢是檢測種子質(zhì)量的重要指標(biāo)。氟啶酮為脫落酸(ABA)生物合成抑制劑，具有促進(jìn)種子萌發(fā)的作用[39]。本研究結(jié)果表明：層積處理可促進(jìn)種子萌發(fā)，將層積處理后的種子用氟啶酮處理，發(fā)芽勢達(dá)到35.33%，種子發(fā)芽率達(dá)到50.67%。說明層積處理結(jié)合氟啶酮處理是打破羌活種子休眠的有效方法。

綜上所述，羌活種子具有胚后熟特性，層積處理可打破羌活種子形態(tài)休眠，結(jié)合氟啶酮處理可提高種子發(fā)芽率；營養(yǎng)物質(zhì)含量的降低，呼吸途徑關(guān)鍵酶活性的波動變化，ABA含量的降低以及內(nèi)源激素含量間的比值變化對羌活種子休眠解除有重要影響。該結(jié)果將為羌活引種馴化和規(guī)?；N植提供科學(xué)依據(jù)。