遲明宏， 程 哲， 楊志娟， 王彥杰， 金奇江， 楊梅花， 王雪蓮， 徐迎春,①

(1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)： a. 園藝學(xué)院， b. 三亞研究院， c. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部花卉生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 江蘇 南京 210095；2. 海南大學(xué)三亞南繁研究院， 海南 三亞 572025； 3. 石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院， 新疆 石河子 832099)

熱帶睡蓮為睡蓮科(Nymphaeaceae)睡蓮屬(NymphaeaLinn.)[1]植物中廣泛分布于熱帶地區(qū)的類群統(tǒng)稱，具有極高觀賞價值和生態(tài)價值，熱帶睡蓮花色豐富，多應(yīng)用于園林造景、水生態(tài)治理以及日化產(chǎn)品開發(fā)等多個領(lǐng)域。然而熱帶睡蓮的適宜生長溫度為18 ℃～35 ℃[2]，在北緯24.3°以北地區(qū)需要采用保護(hù)設(shè)施才能安全越冬[3]，生產(chǎn)成本的提高降低了廠商對熱帶睡蓮生產(chǎn)培養(yǎng)的積極性，進(jìn)而影響了熱帶睡蓮在中國北方的推廣和應(yīng)用。

目前，熱帶睡蓮的研究多集中在育苗技術(shù)和雜交育種[4-5]、天然產(chǎn)物提取與功能分析[6-8]以及水體凈化[9-11]等方面，已有的耐寒性相關(guān)研究存在耐寒程度未量化、耐寒性育種操作技術(shù)不成熟[12]等不足。因此，有必要對熱帶睡蓮進(jìn)行科學(xué)的耐寒性評價，確定其安全越冬的溫度，為熱帶睡蓮的保護(hù)越冬和引種等奠定基礎(chǔ)。本研究以50份主栽熱帶睡蓮材料為研究對象，研究低溫對葉片生理生化指標(biāo)的影響，通過半致死溫度并結(jié)合聚類分析等建立耐寒性評價體系，以期為熱帶睡蓮種質(zhì)資源區(qū)域化引種以及耐寒性種質(zhì)篩選提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試50份熱帶睡蓮材料均采自南京農(nóng)業(yè)大學(xué)龍?zhí)逗苫ㄋ徎?東經(jīng)119°08′57″、北緯32°12′06″)，包括埃及白睡蓮〔Nymphaealotus(Linn.) Willdenow〕、‘艾利克斯’(‘Alexis’)、‘安妮艾米特’(‘Anne Emmet’)、澳洲IM睡蓮(N.immutabilissubsp.immutabilis)、澳洲藍(lán)巨睡蓮(N.giganteaHook.)、‘芭芭拉’(‘Barbara Barnette’)、‘白藍(lán)星’(‘White Colorata’)、‘保羅藍(lán)’(‘Paul Stetson’)、‘貝蒂樓’(‘Betty Lou’)、‘查爾斯托馬斯’(‘Charles Thomas’)、‘丹泉石’(‘Tanzanite’)、‘蒂娜’(‘Tina’)、‘粉黛’(‘Fen Dai’)、‘粉火烈鳥’(‘Pink Flamingo’)、‘粉鉆’(‘Pink Diamond’)、‘蓋瑞’(‘Gary’)、‘甘娜’(‘Madame Ganna Walska’)、‘公牛眼’(‘Bull’s Eye’)、‘黑美人’(‘Murasaki Shikibu’)、‘紅蟹爪’(‘Nangkwag Red’)、‘狐火’(‘Foxfire’)、‘黃金國’(‘Eidorado’)、‘江南風(fēng)韻’(‘Southern Charm’)、‘康弘’(‘Yasuhiro’)、‘拉薩米’(‘Rassamee jan’)、‘藍(lán)金神蟹人’(‘Blue Gold Crab Man’)、‘藍(lán)女神’(‘Wood’s Blue Goddess’)、藍(lán)星睡蓮(N.colarataPeter)、‘藍(lán)紫苑’(‘Blue Aster’)、‘魯比’(‘Ruby’)、‘邁阿密玫瑰’(‘Miami Rose’)、‘帕拉米’(‘Paramee’)、‘潘燮’(‘Poonsub’)、‘熱帶風(fēng)情’(‘Tropic Punch’)、‘日冕紅’(‘Corona Red’)、‘瑞秋’(‘Rachell Presnell’)、‘圣路易斯金’(‘St. Louis Gold’)、‘蘇瓦娜’(‘Suwanna’)、‘泰國國王’(‘King of Siam’)、‘泰國之星’(‘Star of Siam’)、‘希拉里’(‘Hilary’)、‘仙饌’(‘Ambrosia’)、小花睡蓮(N.micranthaGuill. et Perr.)、‘雪崩’(‘Avalanche’)、‘血色火焰’(‘Scarlet Flame’)、‘伊斯蘭達(dá)’(‘Islamorada’)、印度紅睡蓮(N.rubraRoxb. ex Andrews)、‘月光’(‘Moon Beam’)、增殖睡蓮(N.proliferaWiersema)和‘紫云’(‘Purple Cloud’)。實(shí)驗(yàn)所用的50份株齡相近的材料均由中國科學(xué)院植物研究所王競生研究員鑒定。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)處理 于2018年10月，隨機(jī)從上述各熱帶睡蓮上采集生長狀況基本一致、無病蟲害的成熟葉片300 g。用蒸餾水沖洗干凈，吸水紙吸干表面水分，并用打孔器在葉片上避開主脈的位置，取直徑1 cm的葉塊，置于密封袋后放入9610型低溫循環(huán)儀(美國Polyscience公司)內(nèi)進(jìn)行低溫處理。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)定4 ℃、0 ℃、-6 ℃和-12 ℃ 4個溫度處理，每個溫度梯度間降溫1 h，在降至每個低溫節(jié)點(diǎn)時持續(xù)1.5 h。將低溫處理后的葉片分成2份，一部分直接用于測定相對電導(dǎo)率，另一部分在室溫下解凍后用于測定其他生理生化指標(biāo)。每個處理設(shè)置3次重復(fù)。

1.2.2 相對電導(dǎo)率測定以及半致死溫度計算 使用DDS-307電導(dǎo)率儀(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)，并根據(jù)文獻(xiàn)[12]中的電導(dǎo)法測定相對電導(dǎo)率；通過擬合Logistic方程y=k/(1+ae-bx)計算半致死溫度(LT50)，式中，y為細(xì)胞傷害率，k為細(xì)胞傷害率的飽和容量，x為處理溫度，a和b為方程參數(shù)[13]。

1.2.3 生理生化指標(biāo)的測定 采用TBA法[14]測定可溶性糖含量和丙二醛(MDA)含量；采用磺基水楊酸法[15]測定游離脯氨酸含量；采用氮藍(lán)四唑法(NBT)[16]測定超氧化物歧化酶(SOD)活性。上述指標(biāo)均重復(fù)測定3次，結(jié)果取平均值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用EXCEL 2016軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，并采用SPSS 19.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析、相關(guān)性分析和k均值聚類分析。

2 結(jié)果和分析

2.1 低溫處理對熱帶睡蓮葉片的相對電導(dǎo)率及半致死溫度的影響

以不同低溫處理下50份熱帶睡蓮材料葉片的相對電導(dǎo)率為參數(shù)，帶入回歸方程求得各個材料的半致死溫度(LT50)。獲得的回歸方程擬合度高，計算出的半致死溫度可用于判斷不同熱帶睡蓮材料的耐寒性。

結(jié)果(表1)顯示：隨著溫度降低，50份熱帶睡蓮材料葉片的相對電導(dǎo)率呈升高的趨勢，且在不同低溫處理間存在顯著差異。從LT50值看，‘江南風(fēng)韻’的LT50值最低，為-5.85 ℃；‘潘燮’的LT50值最高，為3.69 ℃，跨度達(dá)9.54 ℃。LT50值小于等于-5 ℃的熱帶睡蓮有埃及白睡蓮、澳洲藍(lán)巨睡蓮、‘白藍(lán)星’、‘查爾斯托馬斯’、‘蓋瑞’、‘甘娜’、‘江南風(fēng)韻’和‘熱帶風(fēng)情’，初步推測這8份材料的耐寒性較佳。LT50值大于0 ℃的熱帶睡蓮有‘丹泉石’、‘粉黛’、‘公牛眼’、‘康弘’、‘邁阿密玫瑰’、‘潘燮’、‘日冕紅’、‘泰國之星’、小花睡蓮和印度紅睡蓮10份材料。其余32份熱帶睡蓮材料的LT50值介于-5 ℃～0 ℃范圍內(nèi)。

表1 不同低溫處理下50份熱帶睡蓮材料葉片相對電導(dǎo)率及半致死溫度(LT50)的比較

2.2 低溫處理對熱帶睡蓮耐寒性相關(guān)指標(biāo)的影響

不同低溫處理下50份熱帶睡蓮材料葉片的可溶性糖和丙二醛(MDA)含量的比較結(jié)果見表2，游離脯氨酸含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性的比較結(jié)果見表3。

2.2.1 低溫處理對可溶性糖和MDA含量的影響 結(jié)果(表2)顯示：50份熱帶睡蓮材料葉片的可溶性糖含量為7.56～70.02 mg·g-1。隨著溫度降低，可溶性糖含量的變化趨勢整體可分為3類：第1類為穩(wěn)定型，各低溫處理間的可溶性糖含量差異不顯著，包括埃及白睡蓮、‘安妮艾米特’、‘芭芭拉’、‘白藍(lán)星’、‘查爾斯托馬斯’、‘紅蟹爪’、‘狐火’、‘江南風(fēng)韻’、‘康弘’、‘拉薩米’、‘藍(lán)金神蟹人’、‘熱帶風(fēng)情’、‘雪崩’、印度紅睡蓮和‘月光’15份材料，其中，‘狐火’的可溶性糖含量變幅較小，總體變幅為2.05%～8.22%；第2類各低溫處理間的可溶性糖含量存在顯著差異，且總體呈先升后降或先降后升的趨勢，包括‘艾利克斯’、澳洲IM睡蓮、‘保羅藍(lán)’、‘丹泉石’、‘蒂娜’、‘甘娜’、藍(lán)星睡蓮、‘藍(lán)紫苑’、‘魯比’、‘邁阿密玫瑰’、‘帕拉米’、‘潘燮’、‘日冕紅’、‘圣路易斯金’、‘蘇瓦娜’、‘泰國國王’、‘希拉里’、小花睡蓮、‘血色火焰’、‘伊斯蘭達(dá)’和增殖睡蓮21份材料，其中，‘血色火焰’的可溶性糖含量變幅較大，最大變幅為173.81%；第3類各低溫處理間的可溶性糖含量存在顯著差異，且呈上升或下降或波動變化的趨勢，包括澳洲藍(lán)巨睡蓮、‘貝蒂樓’、‘粉黛’、‘粉火烈鳥’、‘粉鉆’、‘蓋瑞’、‘公牛眼’、‘黑美人’、‘黃金國’、‘藍(lán)女神’、‘瑞秋’、‘泰國之星’、‘仙饌’和‘紫云’14份材料，其中，‘蓋瑞’的可溶性糖含量變幅較大，最大變幅為67.01%。

表2 不同低溫處理下50份熱帶睡蓮材料葉片可溶性糖和丙二醛(MDA)含量的比較

結(jié)果(表2)還顯示：50份熱帶睡蓮材料葉片的MDA含量為0.28～2.73 mg·g-1。隨著溫度降低，可溶性糖含量的變化趨勢整體可分為3類：第1類為穩(wěn)定型，各低溫處理間的MDA含量差異不顯著，包括埃及白睡蓮、‘保羅藍(lán)’、‘粉鉆’、‘公牛眼’、‘紅蟹爪’、‘帕拉米’、‘潘燮’、‘瑞秋’、‘希拉里’和‘血色火焰’10份材料，其中，‘帕拉米’的MDA含量變幅較小，總體變幅為0.0%～13.98%；第2類各低溫處理間的MDA含量存在顯著差異，且總體呈先升后降或先降后升的趨勢，包括澳洲IM睡蓮、澳洲藍(lán)巨睡蓮、‘芭芭拉’、‘查爾斯托馬斯’、‘蒂娜’、‘粉黛’、‘粉火烈鳥’、 ‘甘娜’、‘狐火’、‘黃金國’、‘江南風(fēng)韻’、‘拉薩米’、‘藍(lán)金神蟹人’、‘藍(lán)女神’、‘藍(lán)紫苑’、‘魯比’、‘邁阿密玫瑰’、‘熱帶風(fēng)情’、‘蘇瓦娜’、‘伊斯蘭達(dá)’、‘月光’和‘紫云’22份材料，其中，‘芭芭拉’的MDA含量變幅較大，最大變幅為160.42%；第3類各低溫處理間的MDA含量存在顯著差異，且總體呈上升或下降或波動變化的趨勢，包括‘艾利克斯’、‘安妮艾米特’、‘白藍(lán)星’、‘貝蒂樓’、‘丹泉石’、‘蓋瑞’、‘黑美人’、‘康弘’、藍(lán)星睡蓮、‘日冕紅’、‘圣路易斯金’、‘泰國國王’、‘泰國之星’、‘仙饌’、小花睡蓮、‘雪崩’、印度紅睡蓮和增殖睡蓮18份材料，其中，小花睡蓮的MDA含量變幅較大，最大變幅為89.58%。

2.2.2 低溫處理對游離脯氨酸含量和SOD活性的影響 結(jié)果(表3)顯示：多數(shù)熱帶睡蓮材料葉片的游離脯氨酸含量在100 μg·g-1上下浮動。隨著溫度降低，可溶性糖含量的變化趨勢整體可分為3類：第1類為穩(wěn)定型，各低溫處理間的游離脯氨酸含量差異不顯著，包括埃及白睡蓮、‘安妮艾米特’、‘查爾斯托馬斯’、‘丹泉石’、‘甘娜’、‘公牛眼’、藍(lán)星睡蓮、‘邁阿密玫瑰’、‘瑞秋’和小花睡蓮10份材料，其中，‘丹泉石’的游離脯氨酸含量變幅較小，總體變幅為0.68%～3.29%；第2類各低溫處理間的游離脯氨酸含量存在顯著差異，且呈先升后降或先降后升的趨勢，包括澳洲藍(lán)巨睡蓮、‘白藍(lán)星’、‘保羅藍(lán)’、‘貝蒂樓’、‘蒂娜’、‘粉火烈鳥’、‘蓋瑞’、‘黑美人’、‘狐火’、‘黃金國’、‘康弘’、‘拉薩米’、‘藍(lán)女神’、‘魯比’、‘潘燮’、‘日冕紅’、‘泰國國王’、‘泰國之星’、‘希拉里’、‘仙饌’、‘伊斯蘭達(dá)’、印度紅睡蓮、‘月光’、增殖睡蓮和‘紫云’25份材料，其中，‘紫云’的游離脯氨酸含量變幅度較大，最大變幅為177.54%；第3類各低溫處理間的游離脯氨酸含量存在顯著差異，且呈上升或下降或波動變化的趨勢，包括‘艾利克斯’、澳洲IM睡蓮、‘芭芭拉’、‘粉黛’、‘粉鉆’、‘紅蟹爪’、‘江南風(fēng)韻’、‘藍(lán)金神蟹人’、‘藍(lán)紫苑’、‘帕拉米’、‘熱帶風(fēng)情’、‘圣路易斯金’、‘蘇瓦娜’、‘雪崩’和‘血色火焰’15種，其中，‘雪崩’的游離脯氨酸含量變幅度較大，最大變幅為109.92%。

結(jié)果(表3)還顯示：50份熱帶睡蓮材料的SOD活性差異不大，數(shù)值較為集中。隨著溫度降低，可溶性糖含量的變化趨勢整體可分為3類：第1類為穩(wěn)定型，各低溫處理間的SOD活性差異不顯著，包括‘艾利克斯’、澳洲IM睡蓮、澳洲藍(lán)巨睡蓮、‘粉黛’、‘蓋瑞’、‘甘娜’、‘公牛眼’、‘紅蟹爪’、藍(lán)星睡蓮、‘帕拉米’、‘希拉里’、‘血色火焰’和‘月光’13份材料，其中，‘月光’的SOD活性變幅較小，總體變幅為0.34%～5.47%；第2類各低溫處理間的SOD活性存在顯著差異，且呈先升后降或先降后的趨勢，包括埃及白睡蓮、‘安妮艾米特’、‘芭芭拉’、‘白藍(lán)星’、‘保羅藍(lán)’、‘貝蒂樓’、‘查爾斯托馬斯’、‘蒂娜’、‘粉火烈鳥’、‘粉鉆’、‘康弘’、‘拉薩米’、‘藍(lán)女神’、‘藍(lán)紫苑’、‘邁阿密玫瑰’、‘潘燮’、‘熱帶風(fēng)情’、‘日冕紅’、‘瑞秋’、‘圣路易斯金’、‘泰國國王’、‘伊斯蘭達(dá)’、增殖睡蓮和‘紫云’24份材料，其中，‘藍(lán)紫苑’的SOD活性變幅度較大，最大變幅為61.76%；第3類各低溫處理間的SOD活性存在顯著差異，且呈上升或下降或波動變化的趨勢，包括‘丹泉石’、‘黑美人’、‘狐火’、‘黃金國’、‘江南風(fēng)韻’、‘藍(lán)金神蟹人’、‘魯比’、‘蘇瓦娜’、‘泰國之星’、‘仙饌’、小花睡蓮、‘雪崩’和印度紅睡蓮13份材料，其中，‘黑美人’的SOD活性變幅度較大，最大變幅為24.80%。

表3 不同低溫處理下50份熱帶睡蓮材料葉片游離脯氨酸含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性的比較

2.3 相關(guān)性分析

基于50份熱帶睡蓮材料的半致死溫度(LT50)在3.69 ℃～-5.85 ℃范圍內(nèi)，選取4 ℃、0 ℃和-6 ℃低溫處理下各生理生化指標(biāo)的均值進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果見表4。結(jié)果顯示：熱帶睡蓮材料的LT50值與可溶性糖含量、丙二醛(MDA)含量、游離脯氨酸含量呈極顯著正相關(guān)，與超氧化物歧化酶(SOD)活性呈極顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.460、0.578、0.395和-0.440。MDA含量與可溶性糖含量呈極顯著正相關(guān)，與游離脯氨酸含量呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.468和0.350。表明熱帶睡蓮會通過多種生理生化反應(yīng)來應(yīng)對低溫脅迫，且部分生理生化指標(biāo)間存在顯著關(guān)聯(lián)性。

表4 低溫處理下50份熱帶睡蓮材料生理生化指標(biāo)間的相關(guān)系數(shù)1)

2.4 聚類分析

半致死溫度(LT50)是衡量植物耐寒性的重要依據(jù)，因此選LT50值作為重要篩選因子，同時為避免產(chǎn)生大的誤差，選用與LT50值的相關(guān)系數(shù)絕對值大于0.4的指標(biāo)〔可溶性糖含量、丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性〕作為k均值聚類分析的依據(jù)，結(jié)果(表5)顯示：50份材料聚為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ 4類。

表5 基于生理生化指標(biāo)的50份熱帶睡蓮材料的k均值聚類分析

Ⅰ類為不耐寒型，包括‘公牛眼’、‘康弘’、‘藍(lán)女神’、‘邁阿密玫瑰’、‘潘燮’、‘圣路易斯金’、‘蘇瓦娜’和印度紅睡蓮8份材料。LT50值大多高于0 ℃，均值為1.05 ℃；可溶性糖含量的均值最大，MDA含量的均值較大，SOD活性的均值最小。

Ⅱ類為弱耐寒型，包括‘艾利克斯’、‘安妮艾米特’、‘芭芭拉’、‘丹泉石’、‘蒂娜’、‘粉黛’、‘粉紅烈鳥’、‘狐火’、‘泰國之星’、‘仙饌’、小花睡蓮和‘雪崩’12份材料。LT50值在-3.74 ℃～3.02 ℃之間，均值為-0.69 ℃，除‘丹泉石’、‘粉黛’和‘泰國之星’外，該類其他材料的LT50值均低于0 ℃；可溶性糖含量的均值較大，MDA含量的均值最大，SOD活性的均值較小。

Ⅲ類為中等耐寒型，包括澳洲IM睡蓮、澳洲藍(lán)巨睡蓮、‘白藍(lán)星’、‘保羅藍(lán)’、‘貝蒂樓’、‘查爾斯托馬斯’、‘粉鉆’、‘紅蟹爪’、‘黃金國’、‘拉薩米’、‘藍(lán)金神蟹人’、藍(lán)星睡蓮、‘魯比’、‘帕拉米’、‘熱帶風(fēng)情’、‘日冕紅’、‘瑞秋’、‘泰國國王’和‘月光’19份材料。LT50均值為-3.16 ℃，僅‘日冕紅’的LT50值高于0 ℃，該類其他材料的LT50值大多低于-2 ℃；可溶性糖和MDA含量的均值較小，SOD活性的均值較大。

Ⅳ類為強(qiáng)耐寒型，包括埃及白睡蓮、‘蓋瑞’、‘甘娜’、‘黑美人’、‘江南風(fēng)韻’、‘藍(lán)紫苑’、‘希拉里’、‘血色火焰’、‘伊斯蘭達(dá)’、增殖睡蓮和‘紫云’11份材料；LT50值在-5.85 ℃～-1.77 ℃之間，均值為-3.94 ℃；可溶性糖和MDA含量的均值較小，SOD活性的均值最大。

總體上看，耐寒性越強(qiáng)的材料的可溶性糖和MDA含量越低，SOD活性越高。

3 討論和結(jié)論

傳統(tǒng)的植物耐寒性測定方法通常將半致死溫度或某種單一指標(biāo)作為評價依據(jù)[17-18]，例如在葡萄(VitisviniferaLinn.)[19]、杜鵑花(RhododendronsimsiiPlanch.)[20]和鳶尾(IristectorumMaxim.)[21]的耐寒性比較研究中均利用電解質(zhì)外滲法測定半致死溫度，證明半致死溫度均值作為植物耐寒性基本指標(biāo)具有可靠性[22]。然而，盡管半致死溫度可以在一定程度上反映植物抗寒性，但植物抗寒能力是植物體內(nèi)多物質(zhì)參與抗逆反應(yīng)的綜合作用的結(jié)果[23]，并不由單一因子決定[24]，植物的耐寒性也會受到其他因子影響。相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：可溶性糖含量[25]、丙二醛(MDA)含量[26]、超氧化物歧化酶(SOD)活性[27]均與植物的抗寒性密切相關(guān)[28]。本研究結(jié)果顯示：‘查爾斯托馬斯’按照其半致死溫度-5.36 ℃來判斷應(yīng)屬于耐寒性較強(qiáng)的材料，然而其SOD活性在低溫脅迫中表現(xiàn)出顯著下降的趨勢，最大降幅達(dá)到31.62%，可能是由于細(xì)胞中的功能蛋白受到低溫破壞，在低溫環(huán)境中調(diào)節(jié)能力較弱，無法適應(yīng)低溫環(huán)境[29]。同樣，‘希拉里’半致死溫度為-1.77 ℃，初步判斷其耐寒性一般，然而其MDA含量在-12 ℃～4 ℃低溫脅迫中無顯著差異，說明其細(xì)胞質(zhì)膜受到低溫脅迫損害較小，在低溫下可繼續(xù)發(fā)揮活性氧清除系統(tǒng)的作用，能較好地適應(yīng)低溫環(huán)境[30-31]。

相關(guān)性分析結(jié)果顯示：熱帶睡蓮材料的MDA含量與可溶性糖含量呈極顯著正相關(guān)。二者都通過細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)[32]與酶活性[33]參與低溫脅迫反應(yīng)。從整體變化趨勢看，隨著溫度從4 ℃降低到-12 ℃，在實(shí)驗(yàn)初期階段，各材料為了應(yīng)對低溫脅迫，選擇水解更多淀粉提高細(xì)胞的滲透壓[34]，同時低溫使活性氧清除系統(tǒng)的酶活性降低，導(dǎo)致材料在該階段逐漸積累了大量的MDA和可溶性糖；在實(shí)驗(yàn)后期由于脅迫加劇，植物細(xì)胞膜因結(jié)構(gòu)遭到破壞而透性喪失，無法維持細(xì)胞正常生理功能[35]，導(dǎo)致該階段材料的MDA和可溶性糖含量下降或產(chǎn)生波動；有些耐寒性較差的材料，在實(shí)驗(yàn)初期4 ℃時細(xì)胞結(jié)構(gòu)就遭到嚴(yán)重低溫破壞[36]，其MDA或可溶性糖含量在實(shí)驗(yàn)初期劇增至頂峰，后呈持續(xù)下降趨勢，如‘藍(lán)女神’和‘泰國之星’等。而耐寒性較強(qiáng)的材料，水解反應(yīng)相對穩(wěn)定，細(xì)胞維持原有的代謝機(jī)制便可以應(yīng)對脅迫，在整個降溫過程中MDA和可溶性糖含量均無顯著變化，如埃及白睡蓮和‘紅蟹爪’等。說明耐寒性較強(qiáng)的材料的MDA和可溶性糖含量大多處于較低水平。

通過比較半致死溫度可以得出熱帶睡蓮材料的耐寒性，但結(jié)果帶有局限性，無法實(shí)現(xiàn)更系統(tǒng)、更科學(xué)的分級。為了克服單一指標(biāo)的缺陷，進(jìn)一步指導(dǎo)熱帶睡蓮的生產(chǎn)推廣，本研究在前人研究的基礎(chǔ)上[37-38]，采用相關(guān)性分析篩選出與半致死溫度關(guān)聯(lián)度較高的3個指標(biāo)，即可溶性糖含量、MDA含量和SOD活性，基于上述4個生理生化指標(biāo)進(jìn)行k均值聚類分析，建立的評價體系能更全面地反映植物的真實(shí)抗寒能力。本研究結(jié)果顯示：50份熱帶睡蓮材料可分為不耐寒型、弱耐寒型、中等耐寒型和強(qiáng)耐寒型4類，總體上看，耐寒性越強(qiáng)的材料的可溶性糖和MDA含量越低，SOD活性越高。其中，埃及白睡蓮表現(xiàn)出強(qiáng)耐寒性，‘狐火’表現(xiàn)為弱耐寒性，這一結(jié)論與吉琴[39]的研究結(jié)果相似。依據(jù)研究測定的半致死溫度及評價體系，結(jié)合中國氣候地理相關(guān)研究，可為不同地區(qū)引種耐寒性的熱帶睡蓮提供參考。

此外，由于本文研究的是50份熱帶睡蓮離體葉片在人工低溫處理下的生理生化反應(yīng)，與整個植株在自然低溫下的生理生化反應(yīng)有一定的差距，并且沒有對低溫下發(fā)生的生理生化反應(yīng)進(jìn)行全面研究，不能代替復(fù)雜自然條件下的低溫情況。因此，熱帶睡蓮種質(zhì)資源在全國范圍內(nèi)的引種栽培應(yīng)根據(jù)當(dāng)?shù)氐酿B(yǎng)護(hù)條件以及田間種植試驗(yàn)數(shù)據(jù)，調(diào)整不同熱帶睡蓮的養(yǎng)護(hù)措施，具體還有待后續(xù)的深入研究。