邱 健， 殷云龍， 王芝權(quán)， 施 欽， 陳婷婷， 華建峰， 汪貴斌

〔1. 南京林業(yè)大學(xué)南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心， 江蘇 南京 210037； 2. 江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所(南京中山植物園) 江蘇省植物資源研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 江蘇 南京 210014〕

含笑屬(MicheliaLinn.)植物為木蘭科(Magnoliaceae)常綠灌木或喬木，該屬植物形態(tài)優(yōu)美，花色多彩艷麗，表型遺傳多樣性豐富，是中國(guó)極具開(kāi)發(fā)潛力的觀賞植物，也是北亞熱帶地區(qū)普遍引種的園林綠化植物[1-2]。20世紀(jì)80年代初，江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所(南京中山植物園)對(duì)臺(tái)灣含笑〔M.compressa(Maxim.) Sarg.〕進(jìn)行引種并獲得了成功[3]。在含笑屬植物引種過(guò)程中，低溫是影響其生長(zhǎng)和地理分布的重要非生物脅迫之一，低溫脅迫對(duì)植物會(huì)造成一系列生理和生化反應(yīng)，包括組織含水量降低、脯氨酸和可溶性糖等物質(zhì)的積累以及激素調(diào)節(jié)[4]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)臺(tái)灣含笑抗寒性開(kāi)展了較多研究，陳輝等[5]研究了4種常綠闊葉樹(shù)種對(duì)低溫變化的生理響應(yīng)，揭示了臺(tái)灣含笑等植物抗寒性與可溶性糖含量等生理指標(biāo)間的內(nèi)在聯(lián)系。亓白巖等[6-7]通過(guò)對(duì)8種含笑屬植物越冬形態(tài)觀察、葉片生理指標(biāo)檢測(cè)以及解剖結(jié)構(gòu)特征分析，評(píng)價(jià)了臺(tái)灣含笑與含笑屬其他植物間的抗寒性強(qiáng)弱，發(fā)現(xiàn)抗寒性越強(qiáng)的樹(shù)種，其越冬期間部分生理指標(biāo)的變幅越大，解剖結(jié)構(gòu)指標(biāo)間比值也越大。王偉偉等[8]通過(guò)計(jì)算植株半致死溫度以及觀察葉片解剖結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，臺(tái)灣含笑葉片半致死溫度最低，同時(shí)葉片厚度和角質(zhì)層厚度均較厚，因而抗寒性最強(qiáng)。

‘中山含笑’(Michelia‘Zhongshanhanxiao’)是在臺(tái)灣含笑自然授粉后代的育苗過(guò)程中發(fā)現(xiàn)的具有明顯表型變異的子代，具有生長(zhǎng)迅速、枝葉茂密、花大量多、葉大增厚等優(yōu)良特性，其觀賞利用價(jià)值明顯優(yōu)于無(wú)明顯表型變異子代[9]，但目前對(duì)‘中山含笑’的抗寒性并不清楚。在低溫環(huán)境下，植物葉片形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理指標(biāo)變化反映了植物對(duì)逆境的適應(yīng)性及自我調(diào)節(jié)能力[10-11]。依據(jù)越冬率區(qū)分植物抗寒類型是常用且相對(duì)穩(wěn)定的方法，但對(duì)于同一植物不同變種間存在的細(xì)微差異難以準(zhǔn)確區(qū)分，因此需要結(jié)合植物的形態(tài)、生理和解剖結(jié)構(gòu)等指標(biāo)。Meng等[12]在對(duì)樟子松(Pinussylvestrisvar.mongolicaLitv.)及其自然變種彰武赤松(Pinusdensifloravar.zhangwuensisS. J. Zhang, C. X. Li et X. Y. Yuan)的研究中發(fā)現(xiàn)，滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、酶活性和丙二醛等生理指標(biāo)與抗寒性存在密切的相關(guān)性，且葉片氣孔密度較小的品種抗寒性更強(qiáng)。

鑒于此，本研究采用越冬觀察法，通過(guò)測(cè)定植物葉片的可溶性糖和可溶性蛋白質(zhì)含量等生理指標(biāo)，并使用顯微鏡觀察葉片解剖結(jié)構(gòu)，對(duì)‘中山含笑’與臺(tái)灣含笑母樹(shù)及其無(wú)明顯表型變異子代的抗寒性進(jìn)行比較，以期確定‘中山含笑’適宜栽培區(qū)，為豐富江蘇常綠闊葉樹(shù)種資源以及推進(jìn)城市園林建設(shè)奠定基礎(chǔ)，并為選育抗寒性強(qiáng)的含笑屬樹(shù)種提供科學(xué)依據(jù)。

1 研究區(qū)概況和研究方法

1.1 研究區(qū)概況

研究區(qū)位于江蘇省南京市江寧區(qū)祿口街道苗圃地(東經(jīng)118°52′24″、北緯31°41′06″)，氣候類型以亞熱帶季風(fēng)氣候?yàn)橹?，年均?7.6 ℃，極端最高溫37 ℃，極端最低溫-7 ℃，年降水量1 200 mm，無(wú)霜期240 d。土壤類型為黃棕壤，質(zhì)地為沙壤土，酸堿度為pH 4.5～pH 5.5，有機(jī)質(zhì)含量12.52 g·kg-1，全氮含量0.82 g·kg-1，全磷含量0.94 g·kg-1，全鉀含量28.5 g·kg-1。3種供試植物分別為20年生的臺(tái)灣含笑母樹(shù)、6年生的臺(tái)灣含笑無(wú)明顯表型變異子代和6年生的‘中山含笑’，基本生長(zhǎng)信息見(jiàn)表1。使用布魯萊斯測(cè)高器(精度0.1 m)測(cè)量株高；使用卷尺(精度1 mm)測(cè)量地徑和胸徑；使用量桿(精度1 cm)測(cè)量冠層?xùn)|西向和南北向的投影直徑，2個(gè)投影直徑平均值即為冠幅。試驗(yàn)期間每種植物采用同樣的田間管理方式(定期灌溉除草等)，以保證各植物間生長(zhǎng)條件基本一致。

表1 3種供試植物基本生長(zhǎng)信息

1.2 研究方法

1.2.1 越冬適應(yīng)性觀察 試驗(yàn)時(shí)間為2021年12月1日至2022年2月25日，其中，12月最低溫度-5 ℃、最高溫度17 ℃、平均溫度6.7 ℃；翌年1月最低溫度-3 ℃、最高溫度13 ℃、平均溫度4.7 ℃；2月最低溫度-4 ℃、最高溫度22 ℃、平均溫度4.5 ℃，2月10日后溫度回升。試驗(yàn)參考李瑞雪等[13]的方法對(duì)3種供試植物進(jìn)行越冬觀察記錄，依據(jù)葉面凍害情況分為4個(gè)等級(jí)：0級(jí)，無(wú)凍害；1級(jí)，少于10%的葉片(受凍葉面積小于25%)受凍，葉面出現(xiàn)少量細(xì)小褐斑或形成團(tuán)狀褐斑；2級(jí)，10%～50%葉片(受凍葉面積小于50%)受凍，葉面色澤加深，有大面積褐斑產(chǎn)生或褐斑數(shù)量增多，葉緣卷曲泛黃，個(gè)別葉片呈腐爛狀；3級(jí)，大于50%葉片(受凍葉面積大于50%)受凍，葉片呈深褐色，出現(xiàn)大面積腐爛、汁液外滲和落葉的現(xiàn)象。在試驗(yàn)地內(nèi)從各供試植物中隨機(jī)選出10株長(zhǎng)勢(shì)良好、無(wú)病蟲(chóng)害的植株，對(duì)其冠層北側(cè)中上部的當(dāng)年生枝條中部的典型越冬成熟葉片進(jìn)行觀察并記錄葉面凍害情況，每株觀察100枚葉片。

1.2.2 生理指標(biāo)測(cè)定 2021年12月至2022年2月，隨機(jī)從各供試植物冠層北側(cè)中上部當(dāng)年生枝條中部采摘無(wú)病蟲(chóng)害的第3至第5枚成熟且完整的葉片，每次取3個(gè)重復(fù)樣品，每半個(gè)月左右采集1次，共采集6次。葉片采集后迅速用濕紗布包裹，裝入密封塑料袋后帶回實(shí)驗(yàn)室，依次用自來(lái)水和去離子水仔細(xì)清洗并用濾紙吸干表面水分，稱量后放入液氮中速凍，置于-80 ℃冰箱中保存，用于生理指標(biāo)測(cè)定。采用蒽酮比色法[14]195測(cè)定可溶性糖含量；采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法[14]184測(cè)定可溶性蛋白質(zhì)質(zhì)含量；采用酸性茚三酮顯色法[14]250測(cè)定脯氨酸含量；采用氮藍(lán)四唑法[14]167測(cè)定超氧化物歧化酶(SOD)活性；采用硫代巴比妥酸法[14]測(cè)定丙二醛(MDA)含量。生理指標(biāo)數(shù)據(jù)取3次測(cè)定結(jié)果的平均值。

1.2.3 葉片解剖結(jié)構(gòu)觀測(cè) 2022年2月中旬從各供試植物冠層北側(cè)中上部當(dāng)年生枝條中部采摘無(wú)病蟲(chóng)害的第3至第5枚成熟且完整的葉片，每種供試植物取6枚葉片。從葉片中脈兩側(cè)切取面積1 cm×1 cm的小塊，用FAA固定液進(jìn)行固定，24 h后按常規(guī)石蠟切片法[15]制成永久切片，在Olympus BX41光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)下觀察和拍照。每種供試植物取6個(gè)切片，每個(gè)切片選取3個(gè)視野觀測(cè)，并使用Digimizer 4.5.1軟件測(cè)定葉片解剖結(jié)構(gòu)指標(biāo)，包括角質(zhì)層厚度、上表皮厚度、下表皮厚度、柵欄組織厚度、海綿組織厚度和葉片厚度，并計(jì)算柵海比(柵欄組織厚度/海綿組織厚度)、細(xì)胞結(jié)構(gòu)緊密度(柵欄組織厚度/葉片厚度)、細(xì)胞結(jié)構(gòu)疏松度(海綿組織厚度/葉片厚度)。葉片解剖結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)取18個(gè)觀測(cè)視野的平均值。

1.3 數(shù)據(jù)處理和分析

使用EXCEL 2016軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)整理，使用SPSS 16.0軟件進(jìn)行聚類分析和相關(guān)性分析，并采隸屬函數(shù)法[16]對(duì)各指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。

2 結(jié)果和分析

2.1 越冬適應(yīng)性分析

3種供試植物自然越冬后均有不同程度的凍害表現(xiàn)(圖1)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：‘中山含笑’在自然越冬期間整體長(zhǎng)勢(shì)良好，有4%的葉片葉面出現(xiàn)少量細(xì)小褐斑，典型葉片葉面產(chǎn)生小面積團(tuán)狀褐斑，大部分葉片完好無(wú)損，凍害級(jí)別為1級(jí)；臺(tái)灣含笑母樹(shù)有9%的葉片葉面出現(xiàn)少量細(xì)小褐斑或形成小面積團(tuán)狀褐斑，典型葉片葉面產(chǎn)生較大面積團(tuán)狀褐斑，凍害級(jí)別為1級(jí)；臺(tái)灣含笑無(wú)明顯表型變異子代受凍葉片最多，有16%的葉片受凍，葉片表現(xiàn)為葉面色澤加深，葉緣卷曲泛黃，葉面褐斑數(shù)量較多，典型葉片出現(xiàn)腐爛癥狀，凍害級(jí)別為2級(jí)。3種供試植物凍害程度表現(xiàn)為：臺(tái)灣含笑無(wú)明顯表型變異子代受凍程度最重，臺(tái)灣含笑母樹(shù)次之，‘中山含笑’受凍程度最輕。

Z: ‘中山含笑’Michelia ‘Zhongshanhanxiao’; M: 臺(tái)灣含笑母樹(shù)Mother tree of M. compressa (Maxim.) Sarg.; N: 臺(tái)灣含笑無(wú)明顯表型變異子代Progeny without obvious phenotypic variation of M. compressa.

2.2 生理指標(biāo)變化及綜合評(píng)價(jià)

自然越冬下3種供試植物葉片的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的變化見(jiàn)表2；3種供試植物葉片的超氧化物歧化酶活性和丙二醛含量的變化見(jiàn)表3；基于這5個(gè)生理指標(biāo)的綜合評(píng)價(jià)結(jié)果見(jiàn)表4。

表3 自然越冬下3種供試植物葉片超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量的變化

表4 3種供試植物生理指標(biāo)的綜合評(píng)價(jià)

2.2.1 滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的變化 結(jié)果(表2)顯示：自然越冬期間(2021年12月1日至2022年2月25日)，3種供試植物葉片的可溶性糖含量呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，在2022年1月15日達(dá)到峰值，其中，‘中山含笑’的峰值最高(54.78 mg·g-1)，臺(tái)灣含笑母樹(shù)次之(53.37 mg·g-1)，臺(tái)灣含笑無(wú)明顯表型變異子代最低(51.89 mg·g-1)，但三者間差異不顯著。2021年12月1日至2022年1月15日，臺(tái)灣含笑無(wú)明顯表型變異子代葉片可溶性糖含量的增幅在3種供試植物中最大，為59.32%。2022年2月10日至2022年2月25日，3種供試植物葉片的可溶性糖含量略有下降，但降幅不明顯，依然維持在較高水平。

結(jié)果(表2)還顯示：自然越冬期間，3種供試植物葉片的可溶性蛋白質(zhì)含量呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，在2022年2月10日達(dá)到峰值，其中，‘中山含笑’的峰值最高(1.81 mg·g-1)，臺(tái)灣含笑母樹(shù)次之(1.65 mg·g-1)，臺(tái)灣含笑無(wú)明顯表型變異子代最低(1.55 mg·g-1)，且‘中山含笑’與后二者間差異顯著。2021年12月1日至2022年2月10日，‘中山含笑’葉片可溶性蛋白質(zhì)含量的增幅在3種供試植物中最大，為141.33%。2022年2月10日至2月25日，3種供試植物葉片的可溶性蛋白質(zhì)含量呈下降趨勢(shì)，其中，臺(tái)灣含笑母樹(shù)的降幅最大，為21.21%。

結(jié)果(表2)還顯示：自然越冬期間，3種供試植物葉片的脯氨酸含量呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，在2022年1月15日達(dá)到峰值，其中，‘中山含笑’的峰值最高(67.85 μg·g-1)，臺(tái)灣含笑母樹(shù)次之(62.41 μg·g-1)，臺(tái)灣含笑無(wú)明顯表型變異子代最低(56.40 μg·g-1)，且三者間差異顯著。2021年12月1日至2022年1月15日，‘中山含笑’脯氨酸含量的增幅在3種供試植物中最大，為71.82%。2022年1月15日至2022年2月25日，3種供試植物葉片的脯氨酸含量呈下降趨勢(shì)，其中，‘中山含笑’的降幅最大，為8.18%。

表2 自然越冬下3種供試植物葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的變化

總體上看，3種供試植物葉片的可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)和脯氨酸含量的變化趨勢(shì)相似；從峰值看，‘中山含笑’上述3個(gè)指標(biāo)的峰值均最高，臺(tái)灣含笑無(wú)明顯表型變異子代均最低。

2.2.2 超氧化物歧化酶活性和丙二醛含量的變化 結(jié)果(表3)顯示：自然越冬期間，3種供試植物葉片的超氧化物歧化酶(SOD)活性總體呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，在2022年2月10日達(dá)到峰值，其中，‘中山含笑’的峰值最高(156.83 U·g-1)，臺(tái)灣含笑母樹(shù)次之(143.71 U·g-1)，臺(tái)灣含笑無(wú)明顯表型變異子代最低(133.47 U·g-1)，且三者間差異顯著。2021年12月1日至2022年2月10日，臺(tái)灣含笑母樹(shù)葉片SOD活性的增幅在3種供試植物中最大，為46.45%。2022年2月10至2022年2月25日，3種供試植物葉片SOD活性呈下降趨勢(shì)，其中，‘中山含笑’的降幅最大，為16.72%。

結(jié)果(表3)還顯示：自然越冬期間，3種供試植物葉片的丙二醛(MDA)含量呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，在2022年2月10日達(dá)到峰值，其中，臺(tái)灣含笑無(wú)明顯表型變異子代的峰值最高(34.74 nmol·g-1)，‘中山含笑’次之(32.53 nmol·g-1)，臺(tái)灣含笑母樹(shù)最低(30.15 nmol·g-1)，且三者間差異顯著。2021年12月1日至2022年2月10日，臺(tái)灣含笑無(wú)明顯表型變異子代葉片MDA含量的增幅在3種供試植物中最大，為119.60%。2022年2月10日至2月25日，3種供試植物葉片MDA含量呈下降趨勢(shì)，其中，臺(tái)灣含笑無(wú)明顯表型變異子代的降幅度最大，為18.57%。

總體上看，3種供試植物葉片的SOD活性和MDA含量的變化趨勢(shì)相似；從峰值看，‘中山含笑’葉片SOD活性的峰值最高，MDA含量的峰值較低；臺(tái)灣含笑無(wú)明顯表型變異子代葉片SOD活性的峰值最低，而MDA含量的峰值最高。

2.2.3 基于生理指標(biāo)的綜合評(píng)價(jià) 運(yùn)用隸屬函數(shù)法對(duì)3種供試植物的上述5個(gè)生理指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，結(jié)果(表4)顯示：‘中山含笑’的平均隸屬函數(shù)值最大，為0.569，其中，可溶性糖含量、脯氨酸含量和超氧化物歧化酶活性的隸屬函數(shù)值在3種供試植物中均最大，分別為0.661、0.625和0.621；臺(tái)灣含笑無(wú)明顯表型變異子代的平均隸屬函數(shù)值最小，為0.431。通過(guò)生理指標(biāo)隸屬函數(shù)值排序可知，中山含笑’的抗寒性最強(qiáng)，臺(tái)灣含笑母樹(shù)次之，臺(tái)灣含笑無(wú)明顯表型變異子代最弱。

2.3 解剖結(jié)構(gòu)分析

2.3.1 葉片解剖結(jié)構(gòu)特征 3種供試植物的葉片解剖結(jié)構(gòu)指標(biāo)和解剖圖分別見(jiàn)表5和圖2。結(jié)果顯示：‘中山含笑’葉片角質(zhì)層最厚(4.54 μm)，臺(tái)灣含笑無(wú)明顯表型變異子代葉片角質(zhì)層最薄(3.20 μm)；‘中山含笑’葉片角質(zhì)層厚度與臺(tái)灣含笑母樹(shù)及其無(wú)明顯表型變異子代間差異顯著。3種供試植物葉片上、下表皮均由一層不規(guī)則細(xì)胞緊密排列而成，且上表皮厚度均大于下表皮厚度，其中，臺(tái)灣含笑母樹(shù)葉片的上、下表皮最厚，‘中山含笑’葉片上、下表皮最薄；3種供試植物間的上、下表皮厚度均差異顯著，變異系數(shù)分別為17.35%和18.94%。葉片柵欄組織和海綿組織厚度以‘中山含笑’最厚，臺(tái)灣含笑母樹(shù)次之，臺(tái)灣含笑無(wú)明顯表型變異子代最??；3種供試植物間葉片柵欄組織厚度差異顯著，變異系數(shù)為6.65%；‘中山含笑’葉片海綿組織厚度與臺(tái)灣含笑母樹(shù)無(wú)顯著差異，二者與臺(tái)灣含笑無(wú)明顯表型變異子代差異顯著，3種供試植物海綿組織厚度的變異系數(shù)為6.92%。臺(tái)灣含笑母樹(shù)葉片最厚(347.92 μm)，臺(tái)灣含笑無(wú)明顯表型變異子代葉片最薄(303.63 μm)，3種供試植物間的葉片厚度差異顯著，變異系數(shù)為6.51%。葉片柵海比、細(xì)胞結(jié)構(gòu)緊密度和細(xì)胞結(jié)構(gòu)疏松度的值基本上以‘中山含笑’最大，臺(tái)灣含笑無(wú)明顯表型變異子代次之，臺(tái)灣含笑母樹(shù)最小；3種供試植物間的柵海比無(wú)顯著差異，細(xì)胞結(jié)構(gòu)緊密度差異顯著；細(xì)胞結(jié)構(gòu)疏松度表現(xiàn)為‘中山含笑’與臺(tái)灣含笑無(wú)明顯表型變異子代無(wú)顯著差異，二者與臺(tái)灣含笑母樹(shù)差異顯著。

表5 3種供試植物葉片解剖結(jié)構(gòu)指標(biāo)的比較

cu: 角質(zhì)層Cuticle; ue: 上表皮Upper epidermis; pp: 柵欄組織Palisade parenchyma; sp: 海綿組織Spongy parenchyma; le: 下表皮Lower epidemis; vb: 維管束Vascular bundle.

2.3.2 葉片解剖結(jié)構(gòu)指標(biāo)篩選 采用分層聚類的方法對(duì)上述9個(gè)葉片解剖結(jié)構(gòu)指標(biāo)進(jìn)行分析，結(jié)果(圖3)顯示：在歐氏距離5處，9個(gè)指標(biāo)分為3類：Ⅰ類包括細(xì)胞結(jié)構(gòu)緊密度、細(xì)胞結(jié)構(gòu)疏松度、柵海比、角質(zhì)層厚度、下表皮厚度和上表皮厚度；Ⅱ類包括柵欄組織厚度和海綿組織厚度；Ⅲ類僅包括葉片厚度。

CTR: 細(xì)胞結(jié)構(gòu)緊密度Cell tense ratio; CSR: 細(xì)胞結(jié)構(gòu)疏松度Cell spongy ratio; P/S: 柵海比Palisade parenchyma and spongy parenchyma ratio; CT: 角質(zhì)層厚度Cuticle thickness; LET: 下表皮厚度Lower epidermis thickness; UET: 上表皮厚度Upper epidermis thickness; PPT: 柵欄組織厚度Palisade parenchyma thickness; SPT: 海綿組織厚度Spongy parenchyma thickness; LT: 葉片厚度Leaf thickness.

進(jìn)一步對(duì)各類中指標(biāo)間的相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果(表6)顯示：細(xì)胞結(jié)構(gòu)緊密度與角質(zhì)層厚度和柵海比呈極顯著正相關(guān)，與上、下表皮厚度呈極顯著負(fù)相關(guān)；細(xì)胞結(jié)構(gòu)疏松度與上表皮厚度和柵海比分別呈顯著和極顯著負(fù)相關(guān)，與下表皮厚度呈顯著正相關(guān)；角質(zhì)層厚度與上表皮厚度和下表皮厚度分別呈顯著和極顯著負(fù)相關(guān)；上表皮厚度與下表皮厚度呈極顯著正相關(guān)。柵欄組織厚度和海綿組織厚度呈極顯著正相關(guān)。

表6 3種供試植物葉片解剖結(jié)構(gòu)指標(biāo)間的相關(guān)性分析1)

根據(jù)各解剖結(jié)構(gòu)指標(biāo)間的相關(guān)性大小計(jì)算3類指標(biāo)的相關(guān)指數(shù)。結(jié)果(表7)顯示：Ⅰ類中細(xì)胞結(jié)構(gòu)緊密度的相關(guān)指數(shù)最大，為0.335，選擇為該類的典型指標(biāo)；Ⅱ類中柵欄組織厚度和海綿組織厚度的相關(guān)指數(shù)相同，且海綿組織厚度和柵欄組織厚度的變異系數(shù)相差不大，因此選擇更能反映葉肉組織結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的柵欄組織厚度作為該類的典型指標(biāo)；Ⅲ類中僅葉片厚度1個(gè)指標(biāo)，選擇為該類的典型指標(biāo)。

表7 3種供試植物葉片解剖結(jié)構(gòu)指標(biāo)的相關(guān)指數(shù)及排序

2.3.3 基于葉片解剖結(jié)構(gòu)指標(biāo)的綜合評(píng)價(jià) 運(yùn)用隸屬函數(shù)法對(duì)3種供試植物的3個(gè)葉片典型解剖結(jié)構(gòu)指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，結(jié)果(表8)顯示：‘中山含笑’的平均隸屬函數(shù)值最大，為0.686，其中，細(xì)胞結(jié)構(gòu)緊密度和柵欄組織厚度的隸屬函數(shù)值在3種供試植物中均最大，分別為0.679和0.770；臺(tái)灣含笑無(wú)明顯表型變異子代的平均隸屬函數(shù)值最小，為0.267。通過(guò)葉片典型解剖結(jié)構(gòu)指標(biāo)隸屬函數(shù)值排序可知，中山含笑’的抗寒性最強(qiáng)，臺(tái)灣含笑母樹(shù)次之，臺(tái)灣含笑無(wú)明顯表型變異子代最弱。

表8 3個(gè)供試植物葉片典型解剖結(jié)構(gòu)指標(biāo)的綜合評(píng)價(jià)

3 討論和結(jié)論

植物越冬適應(yīng)性觀察法是通過(guò)觀察植株葉片受凍組織和未受凍組織的顏色，進(jìn)而確定植物受凍害程度，能夠很好地反映出植物在越冬期間的凍害情況[17]。高馳等[18]通過(guò)對(duì)7種重樓屬(ParisLinn.)植物越冬觀察發(fā)現(xiàn)，抗寒能力不同的樹(shù)種葉片有不同的外觀表現(xiàn)。本研究中，與同齡的臺(tái)灣含笑無(wú)明顯表型變異子代相比，在自然越冬期間(2021年12月1日至2022年2月25日)的各個(gè)階段，‘中山含笑’均表現(xiàn)出了更強(qiáng)的抗寒性，未出現(xiàn)葉緣卷曲泛黃、腐爛的現(xiàn)象，僅少數(shù)葉片受凍產(chǎn)生褐斑。‘中山含笑’作為臺(tái)灣含笑自然變異種，其不僅長(zhǎng)勢(shì)明顯高于同齡的臺(tái)灣含笑無(wú)明顯表型變異子代，且多數(shù)生理指標(biāo)和葉片解剖結(jié)構(gòu)指標(biāo)的隸屬函數(shù)值也最大，而臺(tái)灣含笑無(wú)明顯表型變異子代的多數(shù)生理指標(biāo)和葉片解剖結(jié)構(gòu)指標(biāo)的隸屬函數(shù)值最小。因此，綜合3種供試植物的越冬表現(xiàn)以及各指標(biāo)隸屬函數(shù)分析結(jié)果可知：‘中山含笑’的抗寒性最強(qiáng)，臺(tái)灣含笑母樹(shù)次之，臺(tái)灣含笑無(wú)明顯表型變異子代最弱。

植物遭受低溫脅迫會(huì)產(chǎn)生一定的適應(yīng)能力，而抗寒性強(qiáng)的植物在面對(duì)低溫凍害時(shí)具有強(qiáng)大的生理適應(yīng)機(jī)制，可使自身的發(fā)育和生理代謝能夠正常運(yùn)轉(zhuǎn)[19]。研究結(jié)果表明：可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)和脯氨酸是植物細(xì)胞內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，能夠促進(jìn)細(xì)胞吸水和保水，其含量與植物的抗性呈正相關(guān)[20-21]。本研究中，自然越冬期間，3種供試植物葉片的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)(可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)和脯氨酸)含量均隨著時(shí)間的推移呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，Pociecha等[22]認(rèn)為這是一種普遍現(xiàn)象，說(shuō)明3種供試植物在低溫脅迫下可以通過(guò)增加可溶性糖等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)滲透壓，防止細(xì)胞脫水。同時(shí)可溶性蛋白質(zhì)含量的增加有助于合成逆境響應(yīng)蛋白及保護(hù)性酶，這與曾光輝等[23]在茶樹(shù)〔Camelliasinensis(Linn.) O. Ktze.〕上的研究結(jié)果是一致的?？购詮?qiáng)的樹(shù)種遭遇低溫脅迫時(shí)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量要高于抗寒性弱的樹(shù)種，且增幅也較大[24]。本研究中，‘中山含笑’葉片的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量峰值均高于臺(tái)灣含笑母樹(shù)及其無(wú)明顯表型變異子代，且增幅總體也較大，驗(yàn)證了‘中山含笑’抗寒性最強(qiáng)。王偉偉等[8]研究發(fā)現(xiàn)，含笑屬植物的半致死溫度在-16 ℃～-11 ℃，而本試驗(yàn)中樣品采集地的最低溫度僅為-5 ℃，在2022年2月10日后隨著自然平均溫度升高，3種供試植物葉片的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量均出現(xiàn)了一定程度的下降，說(shuō)明-5 ℃的低溫脅迫未能對(duì)植物細(xì)胞膜造成不可逆轉(zhuǎn)的損傷。

Campos等[11]研究認(rèn)為，丙二醛含量的變化可以反映植物細(xì)胞膜的受損程度和逆境脅迫抵御能力。本研究中，自然越冬期間，3種供試植物葉片的丙二醛含量均隨著時(shí)間的推移呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，這與馬娟娟等[16]對(duì)北美冬青〔Ilexverticillata(Linn.) A. Gray〕的低溫脅迫試驗(yàn)結(jié)果一致，說(shuō)明3種供試植物細(xì)胞膜功能均受到了抑制。從12月份到翌年2月份，‘中山含笑’和臺(tái)灣含笑母樹(shù)葉片的丙二醛含量積累較慢，而臺(tái)灣含笑無(wú)明顯表型變異子代丙二醛含量迅速增加，其增幅最大且峰值最高，表明其活性氧自由基積累最多，細(xì)胞膜受損程度最大，抗寒性最差。植物在正常狀態(tài)下時(shí)，體內(nèi)活性氧自由基的生成與清除處于動(dòng)態(tài)平衡，低溫脅迫能夠打破植物體內(nèi)活性氧自由基的動(dòng)態(tài)平衡，而植物為適應(yīng)低溫環(huán)境會(huì)提高超氧化物歧化酶活性來(lái)迅速清除體內(nèi)積累的活性氧自由基，從而對(duì)自身進(jìn)行保護(hù)[25-26]。本研究結(jié)果顯示：3種供試植物葉片的超氧化物歧化酶活性隨著時(shí)間的推移總體呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，且在2022年2月10日達(dá)到峰值，說(shuō)明低溫脅迫激發(fā)了植物體內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)，對(duì)體內(nèi)產(chǎn)生的活性氧自由基進(jìn)行調(diào)節(jié)以抵御低溫脅迫[27]。Airaki等[28]在對(duì)五彩椒(CapsicumannuumLinn.)的研究中發(fā)現(xiàn)，抗氧化酶活性在一定范圍內(nèi)與植物抗寒性呈正相關(guān)。本研究中，‘中山含笑’的超氧化物歧化酶活性在整個(gè)越冬期間均高于臺(tái)灣含笑母樹(shù)及其無(wú)明顯表型變異子代，即抗寒性強(qiáng)的植物保護(hù)酶活性相對(duì)較高。

葉片在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中會(huì)形成與當(dāng)?shù)丨h(huán)境相適應(yīng)的外部形態(tài)和解剖結(jié)構(gòu)[29]，植物抗寒性與葉片解剖結(jié)構(gòu)存在密切關(guān)系[7,30-31]。李瑞雪等[13]認(rèn)為，含笑屬植物葉片柵欄組織越厚，柵海比越大，抗寒性越強(qiáng)。本研究通過(guò)聚類分析和相關(guān)性分析，從9個(gè)解剖結(jié)構(gòu)指標(biāo)中篩選出細(xì)胞結(jié)構(gòu)緊密度、柵欄組織厚度和葉片厚度作為3個(gè)典型指標(biāo)，以消除冗余信息的影響。細(xì)胞結(jié)構(gòu)緊密度為柵欄組織厚度與葉片厚度的比值，柵欄組織為薄壁細(xì)胞，有利于各種物質(zhì)的進(jìn)出，柵欄組織越厚，細(xì)胞結(jié)構(gòu)緊密度越大，表現(xiàn)出的抗寒性也越強(qiáng)[32]。本研究發(fā)現(xiàn)，3種供試植物葉片解剖結(jié)構(gòu)中，‘中山含笑’細(xì)胞結(jié)構(gòu)緊密度和柵欄組織厚度均大于臺(tái)灣含笑母樹(shù)及其無(wú)明顯表型變異子代，與抗寒性評(píng)價(jià)一致。譚殷殷等[33]研究發(fā)現(xiàn)，葉片厚度可以作為抗寒性鑒定的典型指標(biāo)。本研究中葉片厚度雖然也作為反映抗寒性的主要指標(biāo)之一，但3種供試植物的葉片厚度以臺(tái)灣含笑母樹(shù)最厚，這與其抗寒性評(píng)價(jià)結(jié)論略有不同，這可能與本研究中葉片厚度變異系數(shù)較小有關(guān)?！猩胶Α哂兄θ~茂密、花大量多、葉大增厚等優(yōu)良特性，其角質(zhì)層厚度、海綿組織厚度、柵海比和細(xì)胞結(jié)構(gòu)疏松度均大于臺(tái)灣含笑母樹(shù)。但‘中山含笑’上、下表皮在3種供試植物中最薄，與其抗寒性評(píng)價(jià)結(jié)果相反，這可能是由于含笑屬植物抗寒性不僅與上、下表皮有關(guān)，還與表皮上的氣孔密度有關(guān)[34]。

綜上所述，自然越冬期間3種供試植物均出現(xiàn)了一定程度的凍害，其中臺(tái)灣含笑無(wú)明顯表型變異子代受凍程度最重，‘中山含笑’受凍程度最輕?！猩胶Α┖客獾钠溆嗌碇笜?biāo)的峰值均為3種供試植物中最高，臺(tái)灣含笑無(wú)明顯表型變異子代葉片丙二醛含量的增幅最大且峰值最高，臺(tái)灣含笑母樹(shù)各生理指標(biāo)介于二者之間。3種供試植物中，‘中山含笑’細(xì)胞結(jié)構(gòu)緊密度和柵欄組織厚度均最大，臺(tái)灣含笑無(wú)明顯表型變異子代的柵欄組織厚度和葉片厚度均最小。綜合自然越冬表現(xiàn)及各指標(biāo)隸屬函數(shù)分析結(jié)果可知：‘中山含笑’的抗寒性最強(qiáng)，臺(tái)灣含笑母樹(shù)次之，臺(tái)灣含笑無(wú)明顯表型變異子代最弱。低溫對(duì)植物的影響是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，植物的耐寒性是受多因子調(diào)控的，后續(xù)將對(duì)植物自然越冬期間內(nèi)源激素變化和抗寒相關(guān)基因表達(dá)開(kāi)展進(jìn)一步的研究。