高麗梅，張紫怡，覃志成

1 山西醫(yī)科大學第五臨床醫(yī)學院腎內科，太原 030000；2 山西省腎臟病重點實驗室

急性腎損傷（AKI）是一組以急性腎功能減退為特征的臨床綜合征，具有高發(fā)病率、高病死率，是全球關注的衛(wèi)生健康問題之一。研究顯示，氧化應激及其全身效應在AKI 的發(fā)生發(fā)展中起著關鍵作用［1］。因此，找到一種針對腎細胞氧化應激的調節(jié)劑，對預防或控制AKI 的發(fā)生發(fā)展具有重要意義。Klotho 是1997 年由KURO-O 等［2］研究自發(fā)性高血壓小鼠模型時發(fā)現(xiàn)的一種基因，當該基因缺陷時，實驗小鼠會表現(xiàn)出生長緩慢、壽命縮短、血管鈣化、骨質疏松等類似人類早衰的特征，其編碼的蛋白為Klotho 蛋白，分為膜型和分泌型兩種。膜型 Klotho是一種單跨膜蛋白，主要表達于腎遠曲小管與近曲小管，作為成纖維生長因子23（FGF23）的共受體，參與機體磷代謝［3］。分泌型Klotho 主要存在于血液中，也有少量存在于尿液和腦脊液，可作用于骨骼、腦、心、肺等遠端器官，發(fā)揮抗衰老、抗氧化、抗凋亡、抗炎及保護血管等多重生物學作用［4］。研究表明，AKI 患者存在Klotho 缺乏，并伴有氧化應激反應增強， Klotho外源性給藥或過表達具有腎保護作用，其潛在機制尚不完全明確［5］。本文總結了Klotho 對AKI 中氧化應激反應的抑制作用，為臨床預防和治療AKI提供更多可能。

1 激活叉頭轉錄因子（FoxOs）活性抑制AKI 中的氧化應激反應

FoxOs是2000年才正式發(fā)布統(tǒng)一命名的蛋白質家族，參與多種細胞生理過程，包括細胞增殖、細胞凋亡、活性氧（ROS）反應以及細胞周期、代謝調節(jié)等［6］，其中FoxO1、FoxO3、FoxO4 和FoxO6 在人類不同組織中廣泛表達。激活FoxOs 可上調諸如過氧化氫酶和含錳的超氧化物歧化酶（Mn-SOD）等多種抗氧化基因表達，進而發(fā)揮抗氧化作用［7］。研究發(fā)現(xiàn)，Klotho 可降低FoxOs 磷酸化水平，并促進其核易位，核FoxO 可直接與Mn-SOD 啟動子結合并上調其表達，從而促進ROS 的去除，并增加對氧化應激的抵抗力［8］。

KUROSU 等［9］研究發(fā)現(xiàn)，Klotho蛋白作為一種循環(huán)激素，可與細胞表面受體結合抑制胰島素/胰島素樣生長因子1（IGF-1）的細胞內信號傳導，發(fā)揮其抗衰老特性。研究證實，F(xiàn)oxOs 是胰島素樣信號傳導的下游靶標［10］。一項對秀麗線蟲的遺傳學研究表明，胰島素/IGF-1 可激活PI3K/Akt 通路，抑制哺乳動物FoxOs 蛋白的線蟲同源基因DAF-16 活性，由此推測Klotho 蛋白可通過激活由胰島素/IGF-1/PI3K/Akt 信號傳導負調節(jié)的FoxOs，進而發(fā)揮抗氧化應激的作用［11］。研究顯示，在他克莫司（Tac）誘導的腎損傷小鼠模型中，其腎組織DNA 氧化損傷標志物8-羥基脫氧鳥苷（8-OHdG）、血肌酐、磷酸化Akt、FoxO3a表達均升高， Mn-SOD 免疫反應性及其mRNA 表達均降低，而補充Klotho可逆轉上述結果，進一步證實Klotho 通過負調節(jié)PI3K/Akt 信號通路，并增強FoxO3a 介導的Mn-SOD 表達，從而減輕Tac 誘導的氧化應激，發(fā)揮腎臟保護作用［12］。

此外，部分研究提出Klotho 還可通過血清和糖皮質激素誘導激酶（SGK）［13］、p53/p21［14］、β-連環(huán)蛋白［15］等途徑調節(jié)FoxOs 活性，進而發(fā)揮抗氧化應激的作用。

2 激活核因子紅系2 相關因子2（Nrf2）抑制AKI中的氧化應激反應

Nrf2 是一種抗氧化應激的轉錄因子，具有六個功能域，分為Neh1～6 結構域；當靜息狀態(tài)下，Neh2結構域與Kelch 樣ECH 相關蛋白1（Keap1）結合，促進Nrf2 泛素化并被蛋白酶體系統(tǒng)降解，所以細胞內的Nrf2 一般維持在較低水平。然而，當暴露于氧化應激條件下，Keap1 失去泛素連接酶活性，導致Nrf2易位到細胞核中，并與小MAF（sMAF）家族蛋白形成異二聚體，進一步與抗氧化反應元件（ARE）的增強子序列結合，誘導一系列如血紅素加氧酶1（HO-1）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）、Mn-SOD 等抗氧化因子的表達［16］。

有研究通過體外高糖刺激足細胞及體內糖尿病小鼠模型誘導氧化應激實驗，發(fā)現(xiàn)相比于對照組，Klotho高表達組總Nrf2、核Nrf2及其下游靶標如Mn-SOD 表達均升高，而這種增強作用被Nrf2 抑制劑完全抑制，這表明Klotho 誘導的抗氧化應激作用至少部分是由Nrf2信號介導的［17］。CUI等［18］通過H2O2誘導建立人臍靜脈內皮細胞氧化損傷模型，結果顯示Klotho可激活Nrf2的核易位，并增加抗氧化酶如Mn-SOD、HO-1 活性，增強血管內皮細胞存活率，而應用PI3K 抑制劑可阻斷Klotho 蛋白誘導的Nrf2/HO-1 激活和細胞保護作用。因此，Klotho 激活Nrf2 的能力主要取決于其激活PI3K/Akt信號級聯(lián)的能力，從而增強細胞的抗氧化防御能力。

3 激活環(huán)磷酸腺苷/蛋白激酶A（cAMP/PKA）信號通路抑制AKI中的氧化應激反應

cAMP 是ATP 在腺苷酸環(huán)化酶（ACs）催化下產生的核苷酸，是第一個被發(fā)現(xiàn)的第二信使，主要通過蛋白激酶A（PKA）及其下游效應因子如cAMP 反應元件結合蛋白（CREB）等調節(jié)各種靶基因的轉錄，進而參與許多生理和病理過程，在細胞信號傳導中起著關鍵作用［19］。PKA 通常處于無催化活性狀態(tài)，當與cAMP 結合時被激活，進而磷酸化許多蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，當cAMP/PKA 信號通路激活時，可抑制如NOX2、NOX4（NADPH 氧化酶同源物，脈管系統(tǒng)ROS主要來源）等氧化劑的活性，并促進如Mn-SOD、谷胱甘肽等抗氧化因子的生成，進而減輕氧化應激損傷［20］。

一項體外實驗表明，Klotho 能增加人臍靜脈內皮細胞cAMP 產物，并促進Mn-SOD 表達、增強SOD活性，而應用cAMP 抑制劑后上述改變被抑制，表明Klotho可通過cAMP依賴性途徑上調抗氧化劑產生，進而發(fā)揮抗氧化應激作用［21］。WANG 等［22］建立了Klotho 基因轉染的大鼠主動脈平滑?。≧ASM）細胞模型，結果顯示相較于對照組，Klotho 轉染組RASM細胞內cAMP 水平和PKA 活性增加，并且PKA 的激活是呈cAMP依賴性的，而競爭性cAMP抑制劑的應用抑制了cAMP 依賴性PKA 的活性，進而消除了Klotho 誘導的Nox2 蛋白表達抑制，提示Klotho 誘導的Nox2 蛋白表達抑制可能由cAMP/PKA 途徑介導的。因此，Klotho 可通過cAMP/PKA 信號通路發(fā)揮抗氧化應激作用。

4 減輕內質網(wǎng)應激（ERS）抑制AKI 中的氧化應激反應

內質網(wǎng)（ER）是真核細胞中氧化性蛋白、脂質等合成的重要細胞器，在氧化還原平衡等方面發(fā)揮重要作用。在應激（如低氧、病原體感染、脂質累積等）條件下，ER 穩(wěn)態(tài)被破壞，使未折疊和錯誤折疊蛋白累積，超過內質網(wǎng)調控能力，即觸發(fā)ERS，而脂質代謝異常及大量蛋白質折疊可產生大量的ROS［23］。體內和體外研究均已證明，ERS在缺氧再灌注（I/R）誘導的腎損傷中起關鍵作用［24］。研究顯示，ERS 可能通過激活蛋白激酶RNA 樣ER 激酶（PERK）、激活轉錄因子6α（ATF6α）和肌醇需求酶1α（IRE1α）途徑誘導氧化應激［25］。

CUI等［26］建立了H2O2誘導人臍靜脈血管內皮細胞損傷模型，結果發(fā)現(xiàn)相較于模型組，Klotho 干預組內質網(wǎng)相關蛋白表達下降，細胞存活率升高，而這種結果隨著PI3K 抑制劑LY294002 的應用被完全逆轉，提示Klotho 蛋白可明顯減輕H2O2誘導的內皮細胞損傷，其機制可能與激活PI3K/Akt 通路，抑制內皮細胞ERS 有關。有研究將腎毒性血清（NTS）注入小鼠體內建立腎損傷模型，結果顯示相較于對照組， NTS 組尿蛋白、尿素及未折疊蛋白反應途徑的主要調節(jié)因子 78 kDa 葡萄糖調節(jié)蛋白（GRP78）水平更高，提示該模型可誘導ERS，且Klotho 干預組對比NTS 組腎損傷及GRP78 含量降低，表明Klotho 的腎臟保護特性至少部分是通過ERS 調節(jié)介導的［27］。此外，陳鋮等［28］通過硫酸吲哚酚（IS）誘導人臍靜脈內皮細胞損傷，探討ERS 是否參與此過程及可能的機制，結果發(fā)現(xiàn)與IS組比較，Klotho組ERS相關蛋白表達均降低，同時磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）上調，而Klotho 蛋白的這種作用可被AMPK通路抑制劑阻斷，提示Klotho 蛋白可能通過激活AMPK 通路而改善內質網(wǎng)應激，從而拮抗IS 對內皮細胞的損傷作用。

5 減輕線粒體功能障礙抑制AKI 中的氧化應激反應

腎臟是人類最需要能量的器官之一，線粒體含量僅次于心臟。研究發(fā)現(xiàn)，線粒體功能障礙在AKI的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，而內源性ROS 的主要來源是線粒體的氧化磷酸化系統(tǒng)，并且包括清除氧自由基的關鍵酶Mn-SOD 在內的抗氧化劑亦在線粒體基質中表達，從而保持氧化還原平衡［29］。當腎細胞缺血缺氧時，線粒體ROS 生成增多而抗氧化系統(tǒng)受損，導致腎組織受到氧化應激損傷［30］。MIAO等［31］建立了單側腎缺血再灌注（UIRI）小鼠模型，結果發(fā)現(xiàn)相較于UIRI 組，Klotho 干預組ROS 水平下降，線粒體相關蛋白表達升高，同時線粒體結構的異常改變得到改善，這些結果表明Klotho 在保護腎細胞線粒體功能方面發(fā)揮著重要作用。然而目前關于Klotho 通過改善線粒體功能障礙發(fā)揮抗氧化作用的研究仍較少，具體機制有待進一步探討。

6 促進促紅細胞生成素受體（EPOR）表達抑制AKI中的氧化應激反應

促紅細胞生成素（EPO）是一種由腎臟產生的糖蛋白激素，因其與血細胞表面EPOR 結合而促進造血被廣泛熟知。EPOR 除表達于血細胞，也表達于非造血組織，如腎臟、心臟、大腦等。EPOR 可分為兩類，一類為EPOR 的同源二聚體（EPOR）2，一類為EPOR 和β 共同受體（βCR）形成的異源二聚體（EPOR/βCR），EPO與（EPOR）2結合促進紅細胞生成，而與EPOR/βCR 結合具有抗氧化、抗凋亡、抗炎等作用［32］。有研究通過葡萄糖氧化酶（GO）培養(yǎng)人腎小管上皮細胞誘導氧化應激模型，結果發(fā)現(xiàn) GO 確實誘導了細胞內ROS 的積累，而應用EPO 可減少ROS的產生，并提高EPOR 的膜表達，提示EPO 可通過抑制ROS 的產生來保護人腎小管上皮細胞免受氧化應激損傷，而這種保護作用是由EPOR 介導的［33］。HU 等［34］通過H2O2誘導進行了腎細胞毒性實驗，結果發(fā)現(xiàn)Klotho 可上調腎臟EPOR 表達，放大EPO 觸發(fā)的信號通路，保護腎細胞免受氧化應激損傷，相反 EPOR 缺失會導致這種作用部分被消除，這表明EPOR 是參與Klotho 細胞抗氧化應激的下游信號傳導因子。

綜上所述，Klotho 改善AKI 的抗氧化應激機制主要包括激活FoxOs、Nrf2、cAMP/PKA 信號通路及減輕內質網(wǎng)應激、減輕線粒體功能障礙、促進EPOR表達等。而參與這些過程的通路相互關聯(lián)或重疊，目前了解還不夠全面，有待進一步深入研究，從而為開發(fā)新型抗氧化劑提供理論基礎，也為臨床AKI 患者的預防和治療提供新的思路。