楊娜娜，吳迪，胡揚(yáng)，韓曉宇，劉樹(shù)森，孫文斌，綦崢，姚辛敏，徐蓓蕾※

（1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150076；2.北京雙鷺?biāo)帢I(yè)有限公司 北京 100043；3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150076）

疲勞是指當(dāng)達(dá)到一定運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度時(shí)，機(jī)體功能下降的一種狀態(tài)[1]，常伴隨著失眠、抑郁和注意力無(wú)法集中等癥狀[2]，近年來(lái)，抗疲勞產(chǎn)品開(kāi)發(fā)已成為新的研究熱點(diǎn)之一[3]。本研究旨在針對(duì)現(xiàn)代人群開(kāi)發(fā)出的一款風(fēng)味天然、成分健康及口感醇香的抗疲勞飲料。

甘麥大棗飲出自于《金匱要略》，處方比例為甘草150 g、大棗10枚、浮小麥1 L[4]，具有養(yǎng)神安神、益脾保肝和緩解疲勞之效[5]。方劑組成簡(jiǎn)單，且皆為藥食同源類中藥，能夠治療精神恍惚、抑郁，還可理氣解憂、改善情緒和睡眠不安。現(xiàn)代研究表明，該方劑常被用于抑郁癥、睡眠障礙、阿爾茨海默病及腸易激綜合征的治療[6-11]。故本研究以此方為基礎(chǔ)，優(yōu)化甘麥大棗藥液提取工藝及其復(fù)合飲料的制備工藝，并對(duì)其抗疲勞、緩解抑郁功能進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及試劑

甘草、浮小麥購(gòu)買自安寧大藥房，經(jīng)哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院金哲雄教授鑒定為豆科植物甘草（Glycyrrhizae uralensis Fisch.）的干燥根和根莖；浮小麥為禾本科植物小麥（Triticum aestivum L.）的干燥輕浮果實(shí)；大棗購(gòu)買于家樂(lè)福超市，經(jīng)哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院金哲雄教授鑒定為鼠李科植物棗（Ziziphus zizyphus）的成熟果實(shí)。娃哈哈純凈水購(gòu)買自杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司；山梨酸鉀（分析純，批號(hào)：20170118）購(gòu)買于天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；白砂糖購(gòu)買于匯源公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

ICR小鼠150只，體重30~40 g，雌雄各半，購(gòu)買自黑龍江省佳木斯市多多藥業(yè)（批號(hào)：S0567）。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

DHG-9140A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海-恒科技有限公司）；Leica（HI1210）水浴鍋；ISO9001分析天平（北京賽多利斯天平有限公司）；LMS-2B型二道生理記錄儀（北京儀器廠）；JZ-180手動(dòng)界面張力儀（濟(jì)南艾克斯工業(yè)測(cè)試系統(tǒng)有限公司）；WB35F型數(shù)碼相機(jī)（三星公司）；DT001型電子體溫計(jì)（倍爾康公司）；LD3100-1型天平（金鉆計(jì)量?jī)x器銷售部），PHS-25酸度計(jì)（上海雷磁），LDZH-150L高溫滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械）。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 工藝流程

取預(yù)處理后大棗、甘草、浮小麥按照比例混合→清洗、干燥、破碎→混合均勻→甘麥大棗藥液提取→過(guò)濾→藥液稀釋→復(fù)合飲料調(diào)配→包裝、滅菌→冷卻→成品。

2.2 技術(shù)要點(diǎn)

準(zhǔn)確稱取原料，通過(guò)單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)確定原料提取工藝，過(guò)濾藥液，再通過(guò)單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)確定藥液稀釋倍數(shù)、甜味劑、酸味劑及防腐劑添加量，將藥液用純凈水稀釋至相應(yīng)倍數(shù)，向稀釋后的藥液中依序加入甜味劑及防腐劑，充分?jǐn)嚢?，確保攪拌均勻。過(guò)濾，得到顏色均勻澄清的橘黃色飲料，采用高溫滅菌鍋滅菌，趁熱裝罐，冷卻至室溫，檢測(cè)其穩(wěn)定性。

2.3 甘草、大棗和小麥的預(yù)處理

挑選無(wú)雜質(zhì)、無(wú)霉變的甘草，清洗，60℃烘干后放入研缽中，破碎至2~4mm的甘草片段，精密稱量6.8g。

挑選無(wú)雜質(zhì)、無(wú)霉變和無(wú)蟲蛀的圓潤(rùn)碩大的大棗原料10枚清洗（約20 g），60℃烘干后去核放入到研缽中，破碎，破碎程度同甘草。

挑選無(wú)雜質(zhì)、無(wú)霉變的浮小麥原料，清洗，60℃烘干后放入到研缽中，破碎，破碎程度同甘草。精密稱量11.3 g。

2.4 甘麥大棗藥液提取工藝優(yōu)化

2.4.1 提取時(shí)間、提取溫度、提取次數(shù)及加水量的選擇精密稱取預(yù)處理后原料，混合均勻。提取條件為60℃下回流提取80 min（溫控水浴鍋調(diào)節(jié)藥液提取溫度），提取1次。依次考察提取時(shí)間、提取溫度、提取次數(shù)及加水量對(duì)甘麥大棗藥液出膏率及感官評(píng)分影響。考察因素及水平見(jiàn)表1。

表1 甘麥大棗藥液提取單因素水平考察表Table 1 Investigation table of extraction factor level of Ganmai Jujube liquid medicine

2.4.2正交試驗(yàn)考察提取時(shí)間、提取次數(shù)以及提取溫度對(duì)感官評(píng)分的影響根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，將影響甘麥大棗藥液提取主要因素提取次數(shù)設(shè)為A（1次、2次和3次）、提取時(shí)間設(shè)為B（30 min、60 min和90 min）、提取溫度設(shè)為C（60℃、80℃和100℃）、加水量設(shè)為D（300 mL、400 mL和500 mL），采用L9（34）正交試驗(yàn)優(yōu)化甘麥大棗藥液最佳提取工藝。正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。

表2 甘麥大棗藥液提取正交試驗(yàn)因素水平考察表Table 2 Investigation table of orthogonal experimental factors for the extraction of Ganmai Jujube liquid medicine

2.5 甘麥大棗復(fù)合飲料制備工藝研究

2.5.1 藥液稀釋倍數(shù)、甜味劑添加量、防腐劑添加量的選擇根據(jù)甘麥大棗藥液最佳提取工藝優(yōu)化結(jié)果進(jìn)一步篩選甘麥大棗復(fù)合飲料制備工藝，考察藥液稀釋倍數(shù)、甜味劑添加量及防腐劑添加量對(duì)甘麥大棗復(fù)合飲料感官評(píng)分影響，單因素試驗(yàn)考察因素水平見(jiàn)表3。

表3 甘麥大棗復(fù)合飲料制備單因素水平考察表Table 3 Investigation table of the single factor level in the preparation of Ganmai Jujube compound beverage

2.5.2 正交試驗(yàn)考察最佳稀釋倍數(shù)以及輔料添加量根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，將甘麥大棗復(fù)合飲料制備工藝主要影響因素藥液稀釋倍數(shù)設(shè)為E（2倍、5倍和10倍），甜味劑添加量設(shè)為F（2%、3%和4%），防腐劑添加量設(shè)為G（0.1%、0.2%和0.3%），采用L9（34）正交試驗(yàn)優(yōu)化甘麥大棗復(fù)合飲料制備工藝。正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表4。

表4 甘麥大棗復(fù)合飲料制備正交試驗(yàn)因素水平考察表Table 4 Investigation table of orthogonal experimental factors for the preparation of the compound beverage of sweet wheat and jujube

2.5.3 感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)感官評(píng)定由12人組成，從飲料外觀性狀、氣味、色澤及滋味4方面進(jìn)行感官評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表5，評(píng)分均值為感官評(píng)定的最終得分。

表5 感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 5 Sensory scoring standard

2.5.4 飲料穩(wěn)定性測(cè)試觀察甘麥大棗復(fù)合飲料50 d內(nèi)外觀性狀變化，并每隔5 d測(cè)定其pH，評(píng)價(jià)其穩(wěn)定性。

2.6 甘麥大棗復(fù)合飲料抗疲勞及抗抑郁研究

2.6.1 甘麥大棗復(fù)合飲料制備根據(jù)“2.4.1”及“2.4.2”實(shí)驗(yàn)結(jié)果制備甘麥大棗復(fù)合飲料，平行制備3組，設(shè)置1 g/kg、0.5 g/kg和0.25 g/kg 3個(gè)濃度組。

2.6.2 動(dòng)物分組及給藥將150只小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、百憂解對(duì)照組、甘麥大棗飲高濃度組（1g/kg）、甘麥大棗飲中濃度組（0.5 g/kg）和甘麥大棗飲低濃度組（0.25 g/kg），每組30只小鼠?？瞻讓?duì)照組小鼠灌胃給予純凈水；百憂解對(duì)照組小鼠灌胃給予百憂解；甘麥大棗飲料組分別灌胃給予高、中、低濃度的甘麥大棗飲料，灌胃劑量均為10 mL/（kg d），2次/d，連續(xù)5 d。在末次灌胃1 h后進(jìn)行試驗(yàn)。

2.6.3 小鼠懸尾試驗(yàn)在離小鼠尾尖部大概1cm處用膠貼上絲線一端，絲線另一端連接二導(dǎo)記錄儀的張力換能器，小鼠頭部離臺(tái)面約7 cm，保持室內(nèi)溫度恒定（25±1）℃。懸掛總時(shí)長(zhǎng)為6 min，用二導(dǎo)記錄儀記錄2 min后小鼠累積不動(dòng)時(shí)間。

2.6.4 小鼠強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)將小鼠放入高135 cm、直徑30cm的裝滿水的塑料桶內(nèi)，保持水溫恒定（24±1）℃，用數(shù)碼相機(jī)記錄下小鼠游泳的過(guò)程，總共6 min，記錄2 min后小鼠累積不動(dòng)時(shí)間。小鼠不再掙扎或漂浮于水面上，四肢輕微動(dòng)作以保持頭部能露出水面即可記錄為不動(dòng)時(shí)間。

2.6.5 拮抗利血平試驗(yàn)對(duì)小鼠腹腔注射利血平4 mg/kg，記錄小鼠肛溫、眼瞼下垂率及小鼠出圈率。肛溫：注射利血平4 h后，將電子體溫計(jì)插入小鼠肛門內(nèi)約1 cm左右，測(cè)量其肛溫，記錄溫度，比較不同組之間肛溫的差異。眼瞼下垂：注射利血平1 h后，觀察小鼠眼瞼，并記錄眼瞼下垂個(gè)數(shù)，計(jì)算百分率（%）。出圈率：腹腔注射利血平1 h后，把小鼠放在直徑8cm的圓圈內(nèi)觀察15 s，并記錄各組的出圈小鼠數(shù)量，計(jì)算出圈率。

2.7 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 甘麥大棗提取工藝單因素考察結(jié)果

3.1.1 提取時(shí)間、提取溫度、提取次數(shù)及加水量對(duì)甘麥大棗藥液感官評(píng)分影響提取時(shí)間、提取溫度、提取次數(shù)及加水量對(duì)甘麥大棗藥液感官評(píng)分與出膏率影響分別見(jiàn)圖1~4、圖5~8，結(jié)果表明，當(dāng)提取時(shí)間為60 min、提取溫度為80℃、提取次數(shù)為3、加水量為300 mL時(shí)，甘麥大棗藥液感官評(píng)分分別為76、78、88和83，出膏率分別為12.5%、11.8%、12.1%和10%。

圖1 提取時(shí)間對(duì)甘麥大棗藥液感官評(píng)分的影響Fig.1 Effect of the extraction time on the sensory score

圖5 不同提取時(shí)間對(duì)甘麥大棗藥液出膏率的影響Fig.5 Effect of the different extraction time on the extraction rate of Ganmai Jujube liquid medicine

圖2 提取溫度對(duì)對(duì)甘麥大棗藥液感官評(píng)分的影響Fig.2 Effect of the extraction temperature on sensory score

圖3 提取次數(shù)對(duì)對(duì)甘麥大棗藥液感官評(píng)分的影響Fig.3 Effect of the extraction time on sensory score

圖4 加水量對(duì)甘麥大棗藥液感官評(píng)分的影響Fig.4 Effect of the water addition on the sensory score of Ganmai Jujube liquid medicine

圖6 不同提取溫度對(duì)甘麥大棗藥液出膏的影響Fig.6 Effect of the different extraction temperature on the paste extraction of Ganmai Jujube liquid medicine

圖7 不同提取次數(shù)對(duì)甘麥大棗藥液出膏率的影響Fig.7 Effect of the different extraction time on the paste yield of Ganmai Jujube liquid medicine.

圖8 不同加水量對(duì)甘麥大棗藥液出膏率影響Fig.8 Effect of the different water addition on the paste yield of Ganmai Jujube liquid medicine

3.1.2正交試驗(yàn)考察提取因素結(jié)果由表6和表7可知，影響出膏率4個(gè)因素的主次關(guān)系為A＞B＞C＞D，影響感官評(píng)分4個(gè)因素主次關(guān)系為D＞B＞A＞C，比較了K1，K2，K3及k1、k2、k3值，綜合兩個(gè)正交試驗(yàn)結(jié)果及試驗(yàn)成本，確定甘麥大棗藥液的提取優(yōu)選工藝為A3B2C1D1，即加入300 mL水，60℃提取3次，每次60 min。

表6 甘麥大棗藥液提取工藝正交試驗(yàn)結(jié)果Table 6 Orthogonal experimental results of the extraction technology of Ganmai Jujube liquid medicine

表7 提取工藝正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果Table 7 Results of the variance analysis of the orthogonal test of the extraction process

3.2 甘麥大棗復(fù)合飲料制備工藝

3.2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果在確定甘麥大棗藥液最佳提取工藝基礎(chǔ)上進(jìn)一步通過(guò)單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)優(yōu)化其制備工藝，對(duì)其最佳稀釋倍數(shù)、甜味劑添加量及防腐劑添加量進(jìn)行考察，結(jié)果見(jiàn)圖9~11。結(jié)果表明，當(dāng)藥液稀釋5倍、甜味劑添加量為3%、防腐劑添加量為0.2%時(shí)，甘麥大棗復(fù)合飲料顏色澄清均勻，味道酸甜可口，具有甘麥大棗的天然香氣，沉淀周期適中，且沉淀物少。

圖9 藥液稀釋倍數(shù)對(duì)甘麥大棗復(fù)合飲料感官評(píng)分影響Fig.9 Effect of the dilution ratio of the liquid medicine on the sensory score of Ganmai Jujube compound beverage

圖10 甜味劑添加量對(duì)甘麥大棗復(fù)合飲料感官評(píng)分影響Fig.10 Effect of the sweetener addition on the sensory score of Ganmai Jujube compound beverage

圖11 防腐劑添加量對(duì)甘麥大棗復(fù)合飲料感官評(píng)分影響Fig.11 Effect of the preservative addition on the sensory score of Ganmai Jujube compound beverage

3.2.2 酸味劑添加量選擇的結(jié)果由于藥液中帶有大棗的原始酸味，在藥液中添加不同含量的酸味劑，經(jīng)過(guò)感官評(píng)分，對(duì)飲料未造成明顯影響，所以本次試驗(yàn)希望保留原料的天然風(fēng)味，暫不添加酸味劑。

3.2.3 甘麥大棗復(fù)合飲料制備工藝正交試驗(yàn)結(jié)果根據(jù)甘麥大棗復(fù)合飲料制備工藝單因素考察結(jié)果，進(jìn)一步進(jìn)行正交試驗(yàn)。正交試驗(yàn)及方差分析結(jié)果見(jiàn)表8和表9，結(jié)果表明甘麥大棗復(fù)合飲料最佳制備工藝為A2B2C1，即藥液稀釋倍數(shù)為5，甜味劑添加量為3%，防腐劑添加量為0.1%。由數(shù)據(jù)可知，影響感官評(píng)分的3個(gè)因素主次關(guān)系為A＞B＞C，即藥液稀釋倍數(shù)對(duì)飲料的感官評(píng)分具有顯著性影響。

表8 甘麥大棗復(fù)合飲料制備工藝正交試驗(yàn)結(jié)果Table 8 Orthogonal test results of the preparation technology of the compound beverage of sweet wheat and jujube

表9 甘麥大棗復(fù)合飲料制備工藝正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果Table 9 Results of ANOVA of the orthogonal Test on the preparation technology of Ganmai Jujube Compound Beverage

3.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果

根據(jù)實(shí)驗(yàn)篩選出最佳制備工藝制成甘麥大棗復(fù)合飲料，測(cè)定其pH為6.23，且口感醇香，具有甘草、小麥和大棗的天然風(fēng)味，酸甜適中，飲料呈均勻澄清的橘黃色。

50 d內(nèi)每隔5 d測(cè)定其pH分別為6.14、6.35、6.22、6.19、6.05、6.28、6.37、6.22、6.08、6.23和6.12，且飲料無(wú)異味，無(wú)沉淀及懸浮物出現(xiàn)，色澤穩(wěn)定無(wú)明顯變化，證明該制備工藝制得的甘麥大棗復(fù)合飲料穩(wěn)定性良好。

3.4 甘麥大棗復(fù)合飲料抗疲勞及抗抑郁作用研究

3.4.1 小鼠懸尾實(shí)驗(yàn)及強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果小鼠懸尾實(shí)驗(yàn)及強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表10和圖12。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，甘麥大棗復(fù)合飲料能夠減少小鼠懸尾不動(dòng)時(shí)間及游泳累積不動(dòng)時(shí)間，均具有顯著性差異，說(shuō)明甘麥大棗復(fù)合飲料能夠起到一定的抗疲勞作用。

表10 小鼠懸尾實(shí)驗(yàn)及強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)（±）Table 10 Results of the mouse tail suspension experiment and the forced swimming experiment（ ±）

圖12 小鼠懸尾不動(dòng)時(shí)間及小鼠游泳累計(jì)不動(dòng)時(shí)間Fig.12 Immobility time of the mouse tail suspension and the accumulative immobility time of the mouse swimming

3.4.2拮抗利血平試驗(yàn)的結(jié)果甘麥大棗飲料能夠顯著提高小鼠肛溫及小鼠出圈率，降低利血平導(dǎo)致的小鼠眼瞼下垂率。結(jié)果見(jiàn)表11和圖13。

表11 小鼠肛溫、眼瞼下垂率及出圈率（±）Table 11 Anal temperature,blepharoptosis rate and out-of-loop rate of mice(±)

圖13 甘麥大棗復(fù)合飲料拮抗利血平實(shí)驗(yàn)Fig.13 Experiment on the ntagonistic ffect of Ganmai Jujube ompound everage on eserpine

4 討論

有研究表明，利血平可導(dǎo)致抑郁——一種中樞神經(jīng)的不良反應(yīng)[12]，作為治療輕中度高血壓的安定藥，利血平作用效果緩慢，持續(xù)作用時(shí)間較長(zhǎng)，能夠消耗周圍交感神經(jīng)末梢的腎上腺素，抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)，是一種阻斷性抗高血壓藥。其能夠產(chǎn)生鎮(zhèn)靜作用，但不會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物嗜睡及麻醉。低劑量注射后會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物出現(xiàn)眼瞼下垂、瞳孔縮小及體溫下降等抑郁癥狀，能夠誘導(dǎo)動(dòng)物抑郁模型，具有造模時(shí)間短、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。百憂解又名氟西汀[13]，其作為選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑（selectiveserotoninreuptakeinhibitor,SSRIs）的代表藥物[14]，目前已有大量研究證明其對(duì)抑郁癥具有良好治療作用[15-17]，故本研究選取百憂解作為對(duì)照藥物，采用注射低劑量利血平誘導(dǎo)小鼠抑郁模型，并通過(guò)懸尾實(shí)驗(yàn)和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)建立壓迫環(huán)境，使動(dòng)物無(wú)法回避，產(chǎn)生“絕望扭曲行為”[18-20]，即不動(dòng)狀態(tài)，提高小鼠對(duì)抗抑郁藥物敏感狀態(tài)。該方法常用于抗疲勞、抗抑郁類研究。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中可看出，甘麥大棗飲料可以有效地縮短小鼠懸尾不動(dòng)時(shí)間及小鼠游泳不動(dòng)時(shí)間，使注射利血平組的小鼠肛溫上升、眼瞼下垂率降低及小鼠出圈率上升，說(shuō)明甘麥大棗飲料具有一定的抗疲勞及緩解抑郁作用。

甘麥大棗湯方劑組成簡(jiǎn)單，且皆為藥食同源類中藥，現(xiàn)代研究表明，甘麥大棗湯具有寧心安神，緩急調(diào)脾之效[21]，其加減方常用于抑郁癥治療[22]。隨著現(xiàn)代生活節(jié)奏加快，抑郁癥患病率逐年上升[23]，患者常伴有疲勞、長(zhǎng)時(shí)間情緒低落及情感障礙等癥狀，已經(jīng)嚴(yán)重危害人們的身心健康，而甘麥大棗湯中浮小麥能夠養(yǎng)心護(hù)肝，配以甘草和中緩急、大棗益心脾，既可補(bǔ)養(yǎng)心脾之虛，又可緩肝之急。目前對(duì)甘麥大棗湯的研究主要集中于其抗抑郁機(jī)制，并未見(jiàn)有相關(guān)保健飲料報(bào)道。本研究在確定甘麥大棗復(fù)合飲料制備工藝基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究該飲料抗疲勞、緩解抑郁功能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，甘麥大棗復(fù)合飲料制備工藝簡(jiǎn)單，風(fēng)味天然，且具有一定的抗疲勞和緩解抑郁功能，為甘麥大棗湯的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供了新思路。