胡浪，施巍巍，周亞杰，王穎，馮鵬，郭原

（南京中科藥業(yè)有限公司，江蘇 南京 210008）

缺血性腦卒中（ischemic stroke）指多種原因引起的短暫或永久腦血流供應(yīng)障礙，腦組織缺血缺氧壞死，導(dǎo)致神經(jīng)功能缺損，產(chǎn)生包括偏癱、失語、認(rèn)知和學(xué)習(xí)能力受損等一系列臨床綜合征。缺血性腦卒中具有發(fā)病率高、致殘率高、死亡率高以及并發(fā)癥多等特點(diǎn)[1]。缺血性腦卒中屬于腦卒中多種亞型中的主要類型，已成為世界第二大死亡原因和第三大致殘因素[2,3]。目前對于缺血性腦卒中的治療手段包括手術(shù)介入治療和藥物治療。其中，藥物治療是臨床上最常用的手段，如抗凝藥、抗血小板藥和溶栓藥[4,5]。然而這些現(xiàn)存的藥物存在藥物選擇性不高、作用途徑單一及胃腸道反應(yīng)明顯等缺點(diǎn)，因此，尋找新的候選藥物對于防治缺血性腦卒中具有著重要的意義[6]。

大腦中動脈（Middle cerebral artery,MCA）是人類腦卒中的多發(fā)部位，大腦中動脈閉塞（Middle cerebral artery occlusion,MCAO）模型被普遍認(rèn)為是局灶性腦缺血的標(biāo)準(zhǔn)動物模型。

靈芝作為一種名貴的中藥材，以子實(shí)體入藥，含有多種氨基酸、脂肪酸、三萜和多糖類等物質(zhì)。靈芝子實(shí)體醇提物是從靈芝子實(shí)體中經(jīng)乙醇提取后得到的提取物，其主要成分有靈芝多糖、靈芝總?cè)坪桶被岬萚7]。多篇文獻(xiàn)報導(dǎo)靈芝醇提物具有提高免疫力、輔助抑制腫瘤及改善睡眠的作用[8-10]。

本研究建立MCAO/R模型，探索大鼠腦缺血再灌注損傷的抗凝血作用及治療作用，為靈芝子實(shí)體醇提物的進(jìn)一步開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料

1.1 藥物與試劑

靈芝子實(shí)體醇提物（南京中科藥業(yè)有限公司），臨用前用玉米油配成所需濃度的均勻混懸液；氯吡格雷，臨用前0.5%CMC-Na配成所需濃度的均勻混懸液。0.9%氯化鈉注射液（安徽雙鶴藥業(yè)有限責(zé)任公司產(chǎn)品）；水合氯醛（上海凌峰化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品），臨用前用0.9%氯化鈉注射液溶解配制成濃度為3%的澄清溶液。2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC，BioLINK公司），臨用前用PBS緩沖液配制成濃度為1%的溶液；羧甲基纖維素鈉（CMC-Na，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），0.5%CMC-Na的配制：將2.5 g CMC-Na均勻撒在500 mL的超純水表面，室溫下放置過夜，搖勻后使用，藥用級玉米油（Aladdin）。

1.2 動物

SD大鼠，72只，SPF級，雄性，由上浙江省杭州醫(yī)學(xué)院提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK（浙）2019-0002，合格證編號：20201010Aazz0100000536；ICR小鼠，50只，SPF級，雌雄各半，由浙江省杭州醫(yī)學(xué)院提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK（浙）2019-0002，合格證編號：202009 22Abzz0100000176，20200922Abzz0100000485；飼料：顆粒飼料，由中國藥科大學(xué)動物室供給；飼養(yǎng)條件：空調(diào)房間，溫度18~24℃，相對濕度70%。所有動物試驗(yàn)均符合動物倫理委員會標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 儀器

數(shù)顯干燥箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司GZX-9140 MBE）；電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司BS224s型）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（國華電器有限公司產(chǎn)品HH-4）；20℃冰箱（德國SIEMENS公司BCD-254CKK 25V61TI）。

2 方法

2.1 靈芝子實(shí)體醇提物的制備方法

取靈芝子實(shí)體粗粉碎，用30倍量95%乙醇回流提取3次，每次2 h，收集濾液，真空干燥4 h，粉碎過篩，即得靈芝子實(shí)體醇提物。

2.2 靈芝子實(shí)體醇提物于MCAO再灌后2 h給藥對大鼠腦缺血損傷的保護(hù)作用

2.2.1 大鼠MCAO/R損傷模型建立取雄性SD大鼠36只（實(shí)際需要72只，因?yàn)槌赡Ｂ蕿?0%左右），體重250~300 g，按體重隨機(jī)分為6組，每組6只，分為醇提物高劑量組（20 mg/kg）、中劑量組（10 mg/kg）和低劑量組（5 mg/kg）3個劑量組，陽性對照氯吡格雷組7.5 mg/kg，假手術(shù)組及缺血模型對照組（均給以等容積的生理鹽水）。MCAO再灌后2 h開始給藥，每日灌胃給藥1次，連續(xù)給藥7 d，給藥容積為0.2 mL/100 g體重。

漁線的制備：將一長40 mm，直徑0.26 mm的漁線的一端用記號筆標(biāo)記，在距離此標(biāo)記端18 mm處用記號筆再做一標(biāo)記，置于生理鹽水中備用。

大鼠MCAO/R模型：造模手術(shù)前24 h禁食不禁水。參考Longa等的方法[11]，采用頸內(nèi)動脈線栓法制備大鼠MCAO模型：大鼠用3%水合三氯乙醛（300 mg/kg）腹腔注射（i.p）麻醉，仰臥手術(shù)臺上，頸部正中切口，暴露右側(cè)頸總動脈，向外牽引二腹肌及胸鎖乳突肌，由頸總動脈分叉處向頭端依次游離，結(jié)扎并剪斷頸外動脈的分支枕骨下動脈和甲狀腺上動脈，在頸外動脈遠(yuǎn)端結(jié)扎，切斷頸外動脈使其主干游離備用，然后分離頸內(nèi)動脈，用絲線在頸外動脈根部打一松扣，夾閉頸總動脈和頸內(nèi)動脈，將漁線（長40 mm，直徑0.26 mm）經(jīng)頸外動脈主干切口緩慢向頸內(nèi)動脈入顱方向推進(jìn)，當(dāng)漁線進(jìn)入頸內(nèi)動脈后松開頸內(nèi)動脈上的動脈夾，以頸總動脈分叉處為標(biāo)記，推進(jìn)18 mm左右時感到阻力，即達(dá)到了較細(xì)的大腦前動脈內(nèi)，阻斷了MCA的所有血供來源，扎緊頸外動脈根部松扣。缺血后2 h，拔出尼龍線，扎緊動脈殘端，縫合皮膚，完成MCAO導(dǎo)致局灶性腦缺血再灌模型。假手術(shù)組大鼠麻醉后，僅暴露頸內(nèi)外動脈分叉，不閉塞MCA。

2.2.2 腦梗塞率和含水量測定神經(jīng)功能評分：MCAO/R后第2天、第4天及末次給藥后30 min，按Bederson等[12]的方法對動物的神經(jīng)功能缺陷進(jìn)行分級評分，標(biāo)準(zhǔn)如下：

0分：未觀察到神經(jīng)癥狀。1分：提尾懸空時，動物的手術(shù)對側(cè)前肢表現(xiàn)為腕肘屈曲，肩內(nèi)旋，肘外展，緊貼胸壁。2分：將動物置于光滑平面上，推手術(shù)側(cè)肩向?qū)?cè)移動時，阻力降低。3分：動物自由行走時向手術(shù)對側(cè)環(huán)轉(zhuǎn)或轉(zhuǎn)圈。4分；軟癱，肢體無自發(fā)活動。

上述指標(biāo)測定后，脫頸椎處死大鼠，取出全腦稱重。在視交叉及其前后各2 mm處做冠狀切4刀，切成5片后迅速將腦片置于5 mL含有1%TTC的磷酸緩沖溶液中，避光溫孵30 min，在溫孵過程中每隔7~8 min翻動1次，溫孵30 min后取出腦片，用數(shù)碼相機(jī)拍照，之后用眼科鑷分離蒼白區(qū)（梗塞區(qū)）和非蒼白區(qū)（正常區(qū)），計(jì)算梗塞百分比如下：

2.3 靈芝子實(shí)體醇提物對小鼠出血時間和凝血時間的影響

2.3.1 采用斷尾法檢測受試藥對小鼠出血時間的影響

取健康清潔級ICR小鼠50只，體重18~22 g，按體重隨機(jī)分為5組，每組10只，分別為靈芝子實(shí)體醇提物高劑量組（40 mg/kg）、靈芝子實(shí)體醇提物中劑量組（20 mg/kg）和靈芝子實(shí)體醇提物低劑量組（10 mg/kg）、陽性對照氯吡格雷組15 mg/kg和空白組（給以等容積的生理鹽水）。每天灌胃給藥1次，連續(xù)給藥7 d，給藥容積為0.2 mL/10g體重。末次給藥后30 min，將其尾部垂直，用毫米尺測量，并在距尾尖5 mm處作標(biāo)記，然后用手術(shù)刀片在鼠尾標(biāo)記處垂直切斷，待血液自行溢出開始計(jì)時，每隔30 s用濾紙吸去血滴1次，直至血液自然停止（濾紙吸時無血為止）即為出血時間，記錄出血時間。

2.3.2 采用玻片法檢測受試藥對小鼠凝血時間的影響動物分組、給藥劑量及給藥方式同出血時間測定試驗(yàn)。末次給藥后30 min，以內(nèi)徑為1 mm的玻璃毛細(xì)管插入小鼠眼眶內(nèi)，使血自動流出，棄去第1滴血，再分別滴血于清潔載玻片的兩端，血滴直徑為5~10 mm，立即開始計(jì)時，此后每隔10 s用干燥針頭挑動血液1次，至針頭能挑起纖維蛋白絲為止，即為凝血時間，用秒表記錄凝血時間。將結(jié)果進(jìn)行組間t檢驗(yàn)比較[13]。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件為SPSS 22.0，多組間比較方差齊性時采用單因素方差分析進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，兩兩比較；采用ANOVA檢驗(yàn)，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 靈芝子實(shí)體醇提物于MCAO再灌后2 h給藥對大鼠腦缺血損傷的保護(hù)作用

結(jié)果表明，MCAO/R后第2、4、7天時，模型組大鼠均有較高的神經(jīng)行為學(xué)評分，說明模型組的大鼠神經(jīng)功能缺陷嚴(yán)重。與模型組相比，靈芝子實(shí)體醇提物高劑量組（20 mg/kg）和中劑量組（10 mg/kg）均能顯著降低腦缺血大鼠的神經(jīng)功能評分，低劑量組（5 mg/kg）僅在第4天表現(xiàn)出神經(jīng)功能改善的作用（P＜0.05）；與空白組相比，模型組大鼠腦梗死面積和腦含水量均顯著升高（P＜0.01），與模型組相比，靈芝子實(shí)體醇提物3個劑量組均能顯著降低腦梗死面積和含水量（P＜0.01，P＜0.05），且整體效果與陽性藥氯吡格雷相似。結(jié)果見圖1、表1和表2。

表1 醇提物于MCAO再灌后2 h給藥對大鼠神經(jīng)行為學(xué)的影響（mean±SD，n=6）Table 1 The effects of alcohol extracts on neurobehavioral in rats 2 h after MCAO reperfusion(mean±SD,n=6)

表2 醇提物于MCAO再灌后2 h給藥對大鼠腦梗死率及腦含水量的影響（mean±SD，n=6）Table 2 The effect of alcohol extract administration on cerebral infarction rate and cerebral water content in rats 2 h after MCAO reperfusion(mean±SD,n=6)

圖1 2 h給藥局灶性腦缺血（MCAO）/再灌注大鼠腦TTC染色代表圖（n=8）Fig.1 ImagesofTTC stainingin thebrainofratswithfocalcerebral ischemia(MCAO)/reperfusion after 2 h administration(n=8)

3.2 靈芝子實(shí)體醇提物對小鼠出血時間和凝血時間的影響

結(jié)果表明，靈芝子實(shí)體醇提物給藥7 d內(nèi)，小鼠未出異常的行為學(xué)變化，和空白組相比。靈芝子實(shí)體醇提物僅高劑量組（40 mg/kg）對小鼠出血時間和凝血時間有顯著的延長作用（P＜0.05），中劑量組（20 mg/kg）和低劑量組（10 mg/kg）對小鼠出血時間和凝血時間均無延長作用（P＞0.05）；陽性藥氯吡格雷對小鼠出血時間和凝血時間有顯著的延長作用（P＜0.01），結(jié)果見表3。

表3 醇提物對小鼠出血時間和凝血時間的影響（mean±SD，n=10）Table 3 Effects of alcohol extracts on the bleeding time and coagulation time in mice(mean±SD,n=10)

4 討論

缺血性腦卒中是腦卒中的一種，又稱腦梗死或者中風(fēng)，其發(fā)病率逐年上升，若治療不及時，一般伴隨認(rèn)知和/或行動障礙等副作用，給患者及其家庭帶來巨大影響[14,15]。在所有的卒中病例中，大約87%屬于缺血性腦卒中[16]。缺血性腦卒中的治療目前仍是研究的難點(diǎn)之一。根據(jù)缺血性腦卒中的發(fā)病部位、病因、診療思路及現(xiàn)在研究者的新發(fā)現(xiàn)，缺血性腦卒中動物模型分為局灶性缺血性腦卒中和全腦缺血性腦卒中，常用造模方法有線栓法、開顱電凝阻斷法、血栓形成法、栓子栓塞阻斷法和球囊導(dǎo)管法等，造模使用的動物有大鼠、小鼠、家兔和家犬等[17]。不同動物、不同造模方法的缺血性腦卒中模型有各自的優(yōu)缺點(diǎn)，選擇合適的動物模型對試驗(yàn)研究極其重要。線栓法制作的局灶性腦缺血模型由于與人類腦缺血后的病理改變比較接近，在腦缺血實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用較為廣泛[18]。本文參考Longa等的方法，采用大鼠MCAO/R損傷模型，具有以下優(yōu)點(diǎn)：無需開顱，避免外力干擾損傷腦組織、腦缺血再灌注時間易于把握且造模所需腦梗死部位及栓塞的血管明確、重復(fù)性好等[19]。

靈芝作為一種藥食兩用珍貴中藥材，在中國已經(jīng)有2 000多年的食用歷史。靈芝針對心臟血管疾病預(yù)防及治療具有很好的功效，而且安全性高，未發(fā)現(xiàn)不良反應(yīng)[20]。文獻(xiàn)報道，靈芝通過特定信號分子和途徑發(fā)揮其生物學(xué)作用，通過降低血糖、調(diào)節(jié)血脂、穩(wěn)定血壓以及保護(hù)心肌細(xì)胞和大腦細(xì)胞等多條途徑和靶點(diǎn)，對心腦血管疾病具有較好的協(xié)同治療作用[21]。靈芝子實(shí)體醇提物對靈芝中的靈芝多糖、靈芝三萜和氨基酸等多種功效成分進(jìn)行了富集[22]，提示我們靈芝醇提物對心腦血管疾病可能具有一定的療效，值得進(jìn)一步深入研究。

本文采用對大鼠的神經(jīng)功能缺陷進(jìn)行分級評分和檢測腦梗塞率和含水量的方法進(jìn)行模型評價，結(jié)果表明，模型組的大鼠神經(jīng)功能缺陷嚴(yán)重；模型組大鼠腦梗死面積和腦含水量均顯著升高，說明腦缺血再灌注模型建立成功。

靈芝子實(shí)體醇提物在MCAO/R后2 h給藥能顯著降低腦缺血再灌注大鼠的腦梗死面積和腦含水量，并改善行為學(xué)變化，并且表現(xiàn)出與陽性藥氯吡格雷相似的治療效果。缺血性腦卒中的藥物治療方案很多，但是目前沒有特效藥。藥物治療作為保守治療的一種，是患者比較容易接受的治療方式，但不同藥物產(chǎn)生的療效和副反應(yīng)有所不同。靈芝子實(shí)體醇提物目前無毒副作用的報道，對該品種的深入研究具有良好的市場前景。

本文同時研究了靈芝子實(shí)體醇提物對小鼠出血時間和凝血時間的影響，結(jié)果表明靈芝子實(shí)體醇提物高劑量組（40 mg/kg）能顯著延長小鼠出血時間和凝血時間，且與陽性藥氯吡格雷效果類似。以上結(jié)果說明靈芝子實(shí)體醇提物可有效改善患者血液流變學(xué)指標(biāo)，具有抗凝血的作用，再次提示我們靈芝子實(shí)體醇提物或許是對缺血性腦卒中治療藥物的有效補(bǔ)充。

綜上所述，應(yīng)用大鼠局灶性腦缺血（MCAO）再灌注損傷模型對靈芝子實(shí)體醇提物的抗缺血性腦卒中藥效學(xué)的研究，結(jié)果表明醇提物在2 h內(nèi)給藥時可以改善腦缺血癥狀并抗凝血，但其具體的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。