徐漢，張喬，王寶慶

（哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江省 哈爾濱市 150076）

千里香[Murraya paniculata(L.)Jack]屬雙子葉植物蕓香科（Rutaceae）九里香屬植物，產(chǎn)于臺(tái)灣、福建、海南等我國(guó)東南部省份[1]。始載于《嶺南采藥錄》，以干燥的葉及枝入藥，味辛、微苦，性溫，具小毒[2]?！稄V西中藥志》[3]記述千里香具有“行氣止痛，活血散瘀，治跌打腫痛、風(fēng)濕、氣痛”等功效，《生草藥性備要》[4]指其常用功效是消腫止痛，散瘀活血。主要的活性成分是黃酮類(lèi)[5-7]、香豆素類(lèi)[8]、揮發(fā)油[9]、萜類(lèi)[10]、多糖[11]和吲哚生物堿[12]類(lèi)。具有調(diào)節(jié)血糖[13]、抗炎[14]、抗菌[15]、抗腫瘤[16]、抗氧化[17]和抗焦慮[18]等藥理作用。目前，越來(lái)越多天然的活性成分被應(yīng)用到各個(gè)領(lǐng)域中。研究表明千里香具有豐富的天然活性成分，值得對(duì)其進(jìn)行更加全面地研究、開(kāi)發(fā)及利用。

煎煮法、蒸餾法和連續(xù)回流提取法等傳統(tǒng)黃酮類(lèi)化合物提取方法存在許多缺點(diǎn)，如提取效率低、提取純度低、提取時(shí)間長(zhǎng)和浪費(fèi)提取溶劑等[19]。超聲提取的主要理論依據(jù)是超聲的空化效應(yīng)、熱效應(yīng)和機(jī)械作用，而且超聲提取具有提取效率高、時(shí)間短、適應(yīng)性廣、提取的藥液雜質(zhì)少、有效成分易于分離和純化、簡(jiǎn)單易行及設(shè)備維護(hù)保養(yǎng)方便等優(yōu)點(diǎn)[20]。微波提取法具有試劑用量少、節(jié)能、污染小、加熱均勻易控制、選擇性良好、萃取效率高及回收率高等優(yōu)點(diǎn)[21]。超聲波-微波聯(lián)合輔助提取法同時(shí)將兩者的優(yōu)點(diǎn)結(jié)合在一起，充分發(fā)揮兩者各自的優(yōu)勢(shì)，提高黃酮類(lèi)化合物的提取得率[22]。查閱千里香相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)國(guó)內(nèi)目前就其總黃酮提取工藝及抗氧化活性方面的報(bào)道較少，缺乏關(guān)鍵性實(shí)驗(yàn)研究，本文意在為千里香總黃酮的有效開(kāi)發(fā)利用提供參考。因此本試驗(yàn)采用超聲波微波輔助提取千里香總黃酮，通過(guò)響應(yīng)面分析試驗(yàn)，得到千里香總黃酮最佳提取工藝。并對(duì)實(shí)驗(yàn)得到的千里香總黃酮進(jìn)行體外抗氧化實(shí)驗(yàn)，以期為千里香在各個(gè)領(lǐng)域中的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

千里香[哈爾濱市道外區(qū)三棵樹(shù)中藥材大市場(chǎng)，經(jīng)哈爾濱商業(yè)大學(xué)金哲雄教授鑒定為Murraya paniculata(L.)Jack]；蘆丁對(duì)照品（上海源葉生物科技有限公司，純度＞98%）；Vc對(duì)照品（默沙克生物，純度＞98%）；DPPH（默沙克生物，純度＞98%）；氯化鋁、乙醇、硫酸亞鐵、過(guò)氧化氫、水楊酸（國(guó)產(chǎn)分析純，上海德榜化工有限公司）。

CW-2000超聲微波協(xié)同萃取儀（上海精密儀器儀表有限公司）；JC-UT2000紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（聚創(chuàng)環(huán)保集團(tuán)）；N-1000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（廣州艾欣科學(xué)儀器有限公司）；循環(huán)水真空泵SHB-95（河南秋佐儀器設(shè)備有限公司）；3K30低溫離心機(jī)（上?；鶇R生物科技有限公司）；BS423S電子天平（深圳市新朗普電子科技有限公司）；JY-04A多功能粉碎機(jī)（鶴壁市豐源實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品預(yù)處理及總黃酮提取流程千里香洗凈，35℃烘干，粉碎過(guò)60目篩，保存?zhèn)溆?。稱(chēng)量樣品，設(shè)置超聲波功率和微波功率，將樣品加入萃取器進(jìn)行萃取，離心分離，取上清液，冷凍干燥，得總黃酮。

1.2.2 總黃酮含量測(cè)定方法

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置精密稱(chēng)定蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10.00 mg于容量瓶，并加入90%的乙醇至100 mL，待用。

1.2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密稱(chēng)取標(biāo)準(zhǔn)液0 mL、0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL、6.0 mL于25 mL容量瓶，再分別加入1 mL 1%的AlCl3溶液[23]，定容（90%乙醇）至刻度搖勻。使用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在410 nm波長(zhǎng)處測(cè)定3次，取均值。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度x（mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。在濃度范圍0~0.024 mg/mL的回歸方程是y=15.642 x-0.083 6，R2=0.999 3?？捎糜谇Ю锵憧傸S酮質(zhì)量濃度的測(cè)定。

取樣品溶液，根據(jù)上述方法測(cè)定吸光度值，通過(guò)回歸方程計(jì)算出千里香總黃酮質(zhì)量濃度c，提取率按以下公式計(jì)算[24]。

式中：c表示根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出千里香總黃酮質(zhì)量濃度（mg/mL）；V為樣品液的體積（mL）；Q為稀釋倍數(shù)；M為千里香粉末的質(zhì)量（mg）。

1.2.2.3 精密度試驗(yàn)、重復(fù)性、穩(wěn)定性和加樣回收率試驗(yàn)稱(chēng)取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品1.0 g，共6份，按“1.2.2.2”方法制備供試品溶液并測(cè)定吸光度，測(cè)得RSD為0.62%，表明該儀器精密度良好。

稱(chēng)取樣品粉末1.0 g，共6份，按“1.2.2.2”方法制備供試品溶液并測(cè)定吸光度，測(cè)得RSD為1.6%，表明該方法重復(fù)性良好。

稱(chēng)取樣品粉末1.0 g，按“1.2.2.2”方法制備供試品溶液，每隔10 min測(cè)定吸光度1次，持續(xù)60 min，測(cè)得RSD為2.3%，表明該方法在1 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

稱(chēng)取樣品粉末1.0 g，共6份，每份加入蘆丁對(duì)照品適量，按“1.2.2.2”方法制備供試品溶液并測(cè)定吸光度，按公式計(jì)算得到平均回收率為98.6%，RSD為1.4%，表明該方法準(zhǔn)確度良好。

回收率%=（實(shí)驗(yàn)測(cè)得量－實(shí)驗(yàn)前樣品含量）/加入對(duì)照品含量100%

1.2.3 響應(yīng)面提取優(yōu)化工藝試驗(yàn)

1.2.3.1 提取工藝試驗(yàn)以千里香總黃酮得率作為參照標(biāo)準(zhǔn)，分別對(duì)其料液比、超聲波功率和微波功率進(jìn)行篩選，以確定最佳提取條件。

以千里香粉末和90%乙醇提取液按1:10、1:20、1:30、1:40、1:50（g/mL）的比例加入超聲微波輔助萃取儀中，設(shè)置萃取條件為超聲功率、微波功率和提取時(shí)間分別為300 W、300 W和30 min，進(jìn)行試驗(yàn)。

以千里香粉末和90%乙醇提取液按1:30（g/mL）的比例于超聲微波輔助萃取儀中，設(shè)置超聲功率條件為（100 W、200 W、300 W、400 W、500 W），微波功率和提取時(shí)間條件分別為300 W和30 min，進(jìn)行試驗(yàn)。

以千里香粉末和90%乙醇提取液按1:30（g/mL）的比例于超聲微波輔助萃取儀中，設(shè)置微波功率條件為（100 W、200 W、300 W、400 W、500 W），超聲功率和提取時(shí)間條件分別為300 W和30 min，進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.3.2 響應(yīng)面試驗(yàn)以單因素實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為參考，選擇料液比（A），超聲功率（B），微波功率（C）3個(gè)要素為自變量，以千里香總黃酮得率（Y）為響應(yīng)值，利用響應(yīng)面法對(duì)提取條件進(jìn)行優(yōu)化，用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合和結(jié)果分析，試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 因素與水平表Table 1 Factor and level table

1.2.3.3 提取時(shí)間的優(yōu)化以響應(yīng)面優(yōu)化得到的提取工藝條件為基礎(chǔ)，設(shè)置提取時(shí)間為10 min、20 min、30 min、40 min、50 min進(jìn)行試驗(yàn)，以總黃酮得率為指標(biāo)，對(duì)千里香總黃酮最佳提取時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.4 千里香總黃酮體外抗氧化活性測(cè)定

1.2.4.1 對(duì)DPPH自由基的清除作用配置濃度分別為0.05 mg/mL、0.10 mg/mL、0.15 mg/mL、0.20 mg/mL、0.25mg/mL、0.30mg/mL的千里香總黃酮溶液各2mL，向其中分別加入濃度為0.2 mmol/L的DPPH溶液2 mL，暗處?kù)o置，充分反應(yīng)30 min，于517 nm處測(cè)定吸光度為Ai；相同條件方法下用無(wú)水乙醇代替DPPH，測(cè)得吸光度為Aj；相同條件方法下用蒸餾水代替樣品溶液，測(cè)得吸光度為Ao。

同等條件方法下用Vc標(biāo)準(zhǔn)品作為對(duì)照[25]。

DPPH自由基清除率=[1(AiAj）/Ao]100%

1.2.4.2 對(duì)羥自由基的清除作用配置濃度分別為0.05 mg/mL、0.10 mg/mL、0.15 mg/mL、0.20 mg/mL、0.25mg/mL、0.30mg/mL的千里香總黃酮溶液各1mL，向其中分別加入濃度為8 mmol/L的FeSO4溶液、C7H6O3-C2H6O溶液、H2O2溶液混合溶液1 mL，充分反應(yīng)，靜置1 h。于517 nm處測(cè)定其吸光度為Az；相同條件方法下用蒸餾水代替樣品溶液，測(cè)得吸光度為Ax；同時(shí)將H2O2替換，測(cè)得的吸光度為Ay；相同條件方法用Vc標(biāo)準(zhǔn)品作為對(duì)照[26]。

羥自由基清除率=[1(AzAy）/Ax]100%。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1.1 料液比的篩選

由圖1所示，千里香總黃酮得率隨著料液比的增大呈現(xiàn)先上升后略有下降的趨勢(shì)，當(dāng)料液比為1:30 g/mL時(shí)，千里香總黃酮得率達(dá)到峰值；當(dāng)料液比在1:30~1:50 g/mL時(shí)，千里香總黃酮得率略有下降。這可能是由于提取時(shí)間的推移雜質(zhì)成分逐漸析出而影響到黃酮成分的析出，而且超聲時(shí)間越長(zhǎng)，細(xì)胞破碎的越完全，可能會(huì)使某些黃酮類(lèi)成分發(fā)生氧化，縮合等反應(yīng)而導(dǎo)致總黃酮的得率降低[27]，所以選擇料液比條件為1:30。

圖1 料液比對(duì)千里香總黃酮得率的影響Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on the rate of total flavonoids in Murraya paniculata(L.)Jack

2.1.2 超聲功率的篩選

由圖2所示，千里香總黃酮得率在0~300 W的范圍內(nèi)隨超聲功率的變大而升高，并在300 W時(shí)到達(dá)峰值。當(dāng)超聲波功率超過(guò)300 W后，千里香總黃酮得率逐漸降低。可能是因?yàn)槌暡ň哂休^強(qiáng)的機(jī)械剪切作用，長(zhǎng)時(shí)間作用會(huì)使總黃酮結(jié)構(gòu)破壞，導(dǎo)致總黃酮的得率下降。另外長(zhǎng)時(shí)間作用導(dǎo)致細(xì)胞壁破裂造成細(xì)胞內(nèi)的雜質(zhì)成分更易于溶出，這也可能是總黃酮得率下降的原因[28]。所以選擇超聲波功率為300 W。

圖2 超聲功率對(duì)千里香總黃酮得取率的影響Fig.2 The effect of ultrasonic power on the rate of total flavonoids in Murraya paniculata(L.)Jack

2.1.3 微波功率的篩選

由圖3所示，在100~400 W范圍內(nèi)千里香總黃酮得率隨微波功率的增大而增大，在超過(guò)400 W后，千里香總黃酮的得率明顯降低?？赡苁怯捎谖⒉◤?qiáng)烈的穿透力，微波的穿透力隨著微波功率的提高而不斷增強(qiáng)，在一定范圍內(nèi)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞壁的破裂，細(xì)胞內(nèi)的有效成分更易溶出，使千里香總黃酮得率增加。然而過(guò)高的功率和過(guò)強(qiáng)的穿透力也會(huì)加速千里香中其他成分的析出，而且功率過(guò)高還會(huì)使料液比發(fā)生變化而影響千里香總黃酮的得率[22]。所以微波功率選擇400 W。

圖3 微波功率對(duì)千里香總黃酮得率的影響Fig.3 The effect of microwave power on the rate of total flavonoids in Murraya paniculata(L.)Jack

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化結(jié)果

根據(jù)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)得到的試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 2 Response surface experiment design and results

表3 方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance

運(yùn)用Design Expert 11對(duì)千里香總黃酮得率進(jìn)行數(shù)據(jù)分析得到各因素的回歸擬合方程為：

Y=9.65+0.182 7A+0.019 6B+0.236 4C+0.248 9AB+0.301 3AC-0.079 5BC-1.05A2-0.586 1B2-1.19C2

由表3結(jié)果顯示，P＜0.000 1，說(shuō)明該回歸模型存在極顯著差異。決定系數(shù)R2=0.979 5，修正系數(shù)R2Adj=0.953 1，低變異系數(shù)CV=2.52，則證明該回歸模型擬合度良好。且失擬項(xiàng)P=0.287 2＞0.05，則表示該模型擬合度較高，不受失擬因素影響。證明該模型對(duì)預(yù)測(cè)千里香總黃酮得率穩(wěn)定可靠。由表3可看出，A2、B2、C2具有極顯著差異，A、C、AB、AC具有顯著差異[29]。從表中F值可知，各因素對(duì)千里香總黃酮得率的影響順序?yàn)槲⒉üβ剩–）＞料液比（A）＞超聲功率（B）。

料液比、超聲功率、微波功率交互作用對(duì)千里香總黃酮得率的等高線與響應(yīng)面3D圖，見(jiàn)圖4至圖6。通過(guò)等高線與響應(yīng)面3D圖，可以清楚看到各因素間相互影響的顯著性[30]。

圖4 超聲功率與料液比交互作用對(duì)千里香總黃酮提取率影響Fig.4 Effect of ultrasonic power and solid-liquid ratio interaction on extraction rate of total flavonoids from Murraya paniculata(L.)Jack

圖6 微波功率與料液比交互作用對(duì)千里香總黃酮提取率的影響Fig.6 Effect of interaction between microwave power and solid-liquid ratio on the extraction rate of total flavonoids from Murraya paniculata(L.)Jack

從圖4至圖6中發(fā)現(xiàn)不同條件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。當(dāng)響應(yīng)面的結(jié)果走勢(shì)陡峭時(shí)，則證明此條件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響程度較大。觀察3組實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出實(shí)驗(yàn)的3組條件均對(duì)千里香總黃酮得率都具有較大影響；料液比與微波功率間關(guān)系對(duì)得率的影響相對(duì)較大。

2.3 提取時(shí)間對(duì)千里香總黃酮得率的影響

參照1.2.2.2的流程及計(jì)算公式計(jì)算得出千里香總黃酮提取率見(jiàn)圖7。

由圖7所示，在10~30 min范圍內(nèi)千里香總黃酮得率隨微波功率的增大而增大。在超過(guò)30 min后，提取率有下降，可能是長(zhǎng)時(shí)間的加熱接觸，破壞了黃酮類(lèi)成分的結(jié)構(gòu)，使其熱敏性物質(zhì)被分解破壞。因此，選擇30 min作為千里香總黃酮的提取時(shí)間。

圖7 提取時(shí)間對(duì)提取率的影響Fig.7 The influence of extraction time on the extraction rate

通過(guò)對(duì)以上結(jié)果的分析整理發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)優(yōu)化后的最佳提取條件為料液比為1:31.07（g/mL），超聲功率為303.14 W，微波功率為411.23 W，提取時(shí)間為30 min，此條件下千里香總黃酮理論提取率為9.67%。由于實(shí)驗(yàn)操作需要，將千里香總黃酮的最佳提取條件調(diào)整：料液比為1:31（g/mL）、超聲功率為303 W，微波功率為411 W，提取時(shí)間30 min。采用優(yōu)化后的提取條件進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)測(cè)得的千里香總黃酮得率為9.53%與理論值9.67%接近，證明該實(shí)驗(yàn)方法具有可行性。

2.4 千里香總黃酮的體外抗氧化研究

2.4.1 千里香總黃酮和Vc對(duì)DPPH自由基的清除作用如圖8所示，在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)濃度范圍內(nèi)，質(zhì)量濃度的增大，千里香總黃酮和Vc對(duì)DPPH自由基清除率隨之增強(qiáng)，在0.30 mg/mL時(shí)達(dá)到最大值，自由基清除率為千里香總黃酮83.16%、Vc 91.88%，且在高濃度時(shí)千里香總黃酮的清除率略低于Vc，從而可以證明千里香總黃酮也具有良好的抗氧化活性，其活性隨濃度升高而增強(qiáng)。

圖8 千里香總黃酮和Vc對(duì)DPPH自由基清除率的影響Fig.8 Effects of total flavonoids of Murraya paniculata(L.)Jack and Vc on the DPPH free radical scavenging rate

2.4.2 千里香總黃酮和Vc對(duì)羥自由基的清除作用如圖9所示，在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)濃度范圍內(nèi)，隨著質(zhì)量濃度的升高，千里香總黃酮和Vc對(duì)羥自由基清除率隨之增強(qiáng)，在0.30 mg/mL達(dá)到最大，清除率分別為千里香總黃酮85.15%、Vc 93.88%，整體千里香總黃酮的清除率略低于Vc，但說(shuō)明千里香總黃酮具有良好的抗氧化活性，且與其質(zhì)量濃度成正相關(guān)。

圖9 千里香總黃酮和Vc對(duì)羥自由基清除率的影響Fig.9 Effects of total flavonoids of Murraya paniculata(L.)Jack and Vc of thyme on the hydroxyl radical scavenging rate

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以千里香為研究對(duì)象，對(duì)千里香總黃酮采用超聲波微波聯(lián)合輔助提取，利用單因素試驗(yàn)對(duì)提取條件（料液比、超聲功率和微波功率）進(jìn)行考察，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)。結(jié)果表明響應(yīng)面分析的模型良好，準(zhǔn)確度高。且對(duì)千里香總黃酮得率的影響為微波功率＞料液比＞超聲功率，且提取千里香總黃酮最優(yōu)條件：料液比為1:31（g/mL）、超聲功率為303 W，微波功率為411 W，提取時(shí)間為30 min。采用優(yōu)化后的提取條件，千里香總黃酮得率為9.53%，與預(yù)測(cè)值9.67%接近。在體外抗氧化活性試驗(yàn)中，千里香總黃酮在0.05~0.3 mg/mL范圍內(nèi)對(duì)DPPH及羥自由基的清除率均隨著質(zhì)量濃度得升高而變大，在0.30 mg/mL時(shí)清除率達(dá)到最大分別為83.16%和85.15%。表明千里香總黃酮有良好的抗氧化作用，且抗氧化活性與其質(zhì)量濃度成正相關(guān)。通過(guò)本次研究可知，采用超聲波微波聯(lián)合輔助提取千里香總黃酮，具有操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)快速和數(shù)據(jù)準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，且在抗氧化實(shí)驗(yàn)中證明其總黃酮具有良好的活性。本研究可為千里香總黃酮的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)與應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。