邴一凡，李蘇楠，劉學(xué)琴，楊小龍，王淇漩，鄒翔，曲中原※

（1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院中藥學(xué)專業(yè)教研室，黑龍江 哈爾濱 150076；2.哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院藥物工程技術(shù)研究中心，黑龍江 哈爾濱 150076）

抑郁癥是一種臨床常見的以長期情緒低落為特征的情感障礙類疾病，主要表現(xiàn)為心情低落、興趣減少和失眠等癥狀[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前全球已有超3億人深受抑郁癥困擾[2]，且隨著當(dāng)今新冠肺炎疫情全球性的流行，抑郁癥的發(fā)病率和死亡率也在逐漸升高[3]。抑郁癥與中醫(yī)古籍記載的“臟躁”和“百合病”等疾病的臨床表現(xiàn)相似，屬于中醫(yī)“郁證”范疇[4]。病機(jī)在于情志內(nèi)傷與臟氣素虛相互作用，憂愁和哀思等情志不暢導(dǎo)致肝失疏泄，肝氣不暢，脾失健運(yùn)而形成郁證[5]。目前西醫(yī)主要以口服氟西汀、安非他酮等藥物來改善疾病癥狀，但常伴有短期療效顯著、副作用大及復(fù)發(fā)率高等問題[6]。而中醫(yī)藥對抑郁癥的治療主要以“虛實(shí)兼顧，疏肝解郁”為主，且具有多成分和多靶點(diǎn)協(xié)調(diào)起效及副作用低等獨(dú)特優(yōu)勢[7]。

柴胡作為我國常用大宗藥材，藥用歷史悠久，用于治療寒熱往來、胸肋脹痛及月經(jīng)不調(diào)等癥，在許多治療抑郁癥的經(jīng)典方劑如逍遙散、柴胡疏肝散中發(fā)揮疏肝解郁的功效[8]。南柴胡為傘形科植物狹葉柴胡（Bupleurum scorzonerifolium Willd.）的干燥根[9]，相比于北柴胡（B.chinese DC.），南柴胡藥性更加柔和，更長于疏肝解郁，升陽散邪[10]。研究表明以南柴胡入藥的逍遙散發(fā)揮抗抑郁藥效好，起效時(shí)間更快[11]。盡管南柴胡抗抑郁作用顯著，但其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制尚未闡明?？紤]到揮發(fā)油是南柴胡中含量較高，且具有解熱抗炎、抗驚厥作用的一類有效成分[12,13]，本文基于GC-MS和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討南柴胡揮發(fā)油中抗抑郁的潛在藥效成分及作用機(jī)制，為其深入開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

GC17A-QP5050A氣相色譜 質(zhì)譜聯(lián)用儀（日本島津公司）；HP-5MS毛細(xì)管氣相色譜柱（0.25 mm×30 m×0.25m）；揮發(fā)油提取器；南柴胡藥材購于大慶市林甸縣，由哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院曲中原教授鑒定為傘形科植物狹葉柴胡（B.scorzonerifolium Willd.）的干燥根。

1.2 供試品的提取與制備

精密稱取南柴胡50 g于燒瓶中，加入8倍量水，參照《中國藥典》2020年版四部“2204揮發(fā)油測定”甲法，提取5~7 h，至測定器中油量不再增加，得到淡黃色透明油狀液體。將揮發(fā)油用石油醚溶解，定容到5mL容量瓶中，移至液相進(jìn)樣小瓶中，封口冷藏，備用。

1.3 氣相色譜 質(zhì)譜測定條件

1.3.1 氣相色譜條件 色譜柱：HP-5MS毛細(xì)管氣相色譜柱（0.25 mm×30 m×0.25m）；程序升溫：40℃（2 min）10℃/min 250℃（5 min）20℃/min 280℃；進(jìn)樣口溫度：250℃；載氣：氦氣流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣方式：分流；分流比：10:1。

1.3.2 質(zhì)譜條件 離子源：MS離子源；離子源溫度：230℃；四級桿溫度：150℃；能量：70 eV，掃描范圍：m/z 50~550。

1.4 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測南柴胡揮發(fā)油抗抑郁作用機(jī)制

1.4.1 主要成分及靶點(diǎn)篩選 將鑒定的揮發(fā)油成分分別輸入PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中獲取SMILES號[14]，隨后導(dǎo)入SwissADME平臺（http://www.swissadme.ch）[15]根據(jù)“類藥五原則”（Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge）篩選滿足五原則中兩個(gè)或兩個(gè)以上條件的活性成分。對于不滿足上述條件的化合物，通過進(jìn)一步查閱文獻(xiàn)確定是否為可能的活性成分，隨后利用SwissTargetPrediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）數(shù)據(jù)庫[15]，以P＞0為條件篩選活性化合物的靶點(diǎn)信息。

1.4.2 抑郁癥相關(guān)疾病靶點(diǎn)的篩選 采用GeneCards（https://www.genecards.org/）[16]和DrugBank[17（]https://go.drugbank.com/）數(shù)據(jù)庫，以“depression”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索獲得疾病靶點(diǎn)，合并兩個(gè)數(shù)據(jù)庫的靶點(diǎn)信息，刪除重復(fù)值，使用UniPro（thttps://www.uniprot.org/）數(shù)據(jù)庫[18]規(guī)范靶點(diǎn)名稱。

1.4.3 成分 失眠靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將疾病靶點(diǎn)和成分靶點(diǎn)導(dǎo)入Venny 2.1.0（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）中獲得交集靶點(diǎn)。將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING（https://string-db.org/）數(shù)據(jù)庫[19]，構(gòu)建蛋白質(zhì) 蛋白質(zhì)互作（protein-protein interaction networks,PPI）網(wǎng)絡(luò)，然后導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2按大于2倍degree中位數(shù)條件篩選獲得核心靶點(diǎn)。

1.4.4 GO、KEGG富集分析與構(gòu)建“活性成分 靶點(diǎn)通路”網(wǎng)絡(luò) 采用DAVID 6.8（https://david.ncifcrf.gov/）[20]數(shù)據(jù)庫對核心靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體（gene ontology,GO）功能富集分析和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）分析，并采用微生信平臺（http://www.bioinformatics.com.cn/）和OmicShare平臺（https://www.omicshare.com/）進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化。最終構(gòu)建南柴胡揮發(fā)油抗抑郁的“活性成分 核心靶點(diǎn)通路”關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果與分析

2.1 南柴胡揮發(fā)油成分分析

南柴胡揮發(fā)油的總離子流圖見圖1。通過檢索NIST14.L質(zhì)譜庫，比對準(zhǔn)分子離子峰和二級碎片信息結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)共鑒定和表征出28個(gè)化學(xué)成分，并以扣除溶劑峰的色譜圖的全部峰面積作為100%，利用歸一化法確定了各組分在揮發(fā)油中的相對含量，結(jié)果見表1。

圖1 南柴胡揮發(fā)油的GC-MS總離子流圖Fig.1 The GC-MS TIC diagram of essential oil in Bupleurum scorzonerifolium

表1 南柴胡揮發(fā)油成分Table 1 Constituents of volatile oil from Bupleurum scorzonerifolium

2.2 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)南柴胡揮發(fā)油抗抑郁作用機(jī)制

2.2.1 活性成分篩選及靶點(diǎn)預(yù)測將鑒定出的成分分別導(dǎo)入SwissADME平臺，根據(jù)“類藥五原則”最終判斷這28種成分均為潛在活性成分。采用SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫最終篩選出358個(gè)潛在成分靶點(diǎn)。

2.2.2 篩選疾病靶點(diǎn)在GeneCards數(shù)據(jù)庫中得到抑郁相關(guān)靶點(diǎn)13 320個(gè)；DrugBank數(shù)據(jù)庫獲得抑郁相關(guān)靶點(diǎn)1 479個(gè)；合并兩個(gè)數(shù)據(jù)庫的篩選結(jié)果后刪除重復(fù)值，共得到13 552個(gè)疾病相關(guān)靶點(diǎn)。將358個(gè)成分靶點(diǎn)與13 552個(gè)疾病靶點(diǎn)導(dǎo)入Venny 2.1.0獲得272個(gè)交集靶點(diǎn)，作為南柴胡揮發(fā)油抗抑郁作用的潛在靶點(diǎn)，見圖2。

圖2 成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)交集韋恩圖Fig.2 The intersection venn diagram of compound targets and disease targets

2.2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及核心靶點(diǎn)篩選用STRING 11.5數(shù)據(jù)庫對272個(gè)交集靶點(diǎn)進(jìn)行靶點(diǎn)間PPI互作關(guān)系的分析，見圖3。保存TSV文件并導(dǎo)入Cytoscape 3.2.1軟件，根據(jù)大于2倍degree值的條件最終篩選出45個(gè)核心靶點(diǎn)，包括GSK3B、JUN、CXCL8、MMP2、F2R、GNAI3、PRKCA、PTGS2、ESR1、MMP9、EGFR、GNAI1、ESR2、IGF1R、AR、IL6、RXRA和ERBB2等。

圖3 交集靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)Fig.3 The PPI network diagram of intersection targets

2.2.4富集分析及“成分靶點(diǎn)通路”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建利用DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫對16個(gè)核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO分析和KEGG分析。根據(jù)P＜0.05原則，GO分析最終篩選到264個(gè)生物學(xué)過程（bioprogress,BP），47個(gè)細(xì)胞組分（cell components,CC）和57個(gè)分子功能（molicular function,MF）。利用微生信平臺前10個(gè)條目進(jìn)行可視化，見圖4。結(jié)果表明，上述核心靶點(diǎn)參與的生物學(xué)過程主要包括：MAPK級聯(lián)的正調(diào)節(jié)（positive regulation of MAPK cascade）、ERK1和ERK2級聯(lián)的正調(diào)節(jié)（positive regulation of ERK1 and ERK2 cascade）、血管平滑肌細(xì)胞。KEGG根據(jù)P＜0.05的條件共篩選到132條通路，利用OmicShare平臺對前10條進(jìn)行可視化分析，結(jié)果見圖5。結(jié)果表明南柴胡揮發(fā)油可能通過雌激素信號通路（Estrogen signaling pathway）、Rap1信號通路（Rap1 signaling pathway）、Reaxin信號通路（Reaxin signaling pathway）、PI3K-Akt信號通路（PI3K-Akt signaling pathway）和cAMP信號通路（cAMP signaling pathway）等發(fā)揮抗抑郁功效，進(jìn)一步構(gòu)建了“成分靶點(diǎn)通路”網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果見圖6。

圖4 GO富集分析結(jié)果Fig.4 Results of GO enrichment analysis

圖5 KEGG富集分析結(jié)果Fig.5 Results of KEGG enrichment analysis

圖6 成分靶點(diǎn)通路網(wǎng)絡(luò)Fig.6 The diagram of component target pathway network

3 討論

《丹溪心法·六郁》中記載：“氣血沖和，萬病不生，一有怫郁，諸病生焉，故人身諸病，多生于郁”，暗示人的情志變化會影響臟腑功能而導(dǎo)致抑郁[21]。研究發(fā)現(xiàn)肝失疏泄導(dǎo)致氣行不暢，脾胃失調(diào)，心腎不交，與情志關(guān)系密切，因此目前普遍認(rèn)為抑郁癥的治療應(yīng)以疏肝為主，協(xié)調(diào)四臟為輔[22]。南柴胡作為柴胡傳統(tǒng)基源之一，獨(dú)有“敗油氣”，功偏于“升”，長于疏肝散熱，因此本文從揮發(fā)油角度探討南柴胡治療抑郁癥的潛在活性成分并預(yù)測其機(jī)制。

文獻(xiàn)報(bào)道揮發(fā)油可通過皮膚和呼吸道直接作用于呼吸系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)，從而起到改善身心健康的作用[23]，但目前對揮發(fā)油的抗抑郁作用機(jī)制仍缺乏系統(tǒng)研究。本試驗(yàn)運(yùn)用GC-MS在南柴胡揮發(fā)油中鑒定了28個(gè)化合物，占揮發(fā)油總量的99.31%。據(jù)報(bào)道-蒎烯具有抗焦慮和緩解壓力的作用[24,25]。此外-蒎烯和-紅沒藥烯等也是治療抑郁癥的潛在成分[26]。因此推測南柴胡抗抑郁作用與揮發(fā)油成分活性有關(guān)。進(jìn)一步通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對上述成分的潛在靶點(diǎn)和通路進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果顯示這28種成分主要作用于ESR1、GSK3B、JUN、CXCL8、MMP2、F2R、GNAI3和PRKCA等45個(gè)核心靶點(diǎn)，通過雌激素、Rap1、Reaxin、PI3KAkt和cAMP等信號通路發(fā)揮抗抑郁作用。ESR1為雌激素受體，是抑郁癥治療的重要靶點(diǎn)，雌激素與腦內(nèi)受體結(jié)合后，會促進(jìn)神經(jīng)突觸間五羥色胺、去甲腎上腺素等激素的釋放，從而改善抑郁癥癥狀[27]。Rap-1由新型cAMP靶分子-Epac激活，其中Epac分為Epac-1和Epac-2，Epac-2主要在腦部和腎上腺中表達(dá)，研究表明，抑郁癥自殺患者海馬體中表現(xiàn)出Rap-1表達(dá)和cAMP的結(jié)合活性降低[28]。Relaxin-3是Reaxin家族與抑郁癥最為相關(guān)的一種神經(jīng)肽，主要在哺乳動物腦中-氨基丁酸（GABA）投射神經(jīng)元中大量表達(dá)，通過與其受體RXFP3結(jié)合在抑郁癥的治療中起著重要作用[29]。PI3K/Akt信號通路與抑郁癥密切相關(guān)，有報(bào)道顯示PI3K/Akt信號通路的激活會促進(jìn)IL-1和TNF-等炎癥因子的釋放，影響患者的睡眠質(zhì)量，進(jìn)而加重抑郁的病情[30]。

綜上所述，本研究首次采用GC-MS結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)明確了南柴胡揮發(fā)油抗抑郁作用藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)、潛在作用靶點(diǎn)及通路，可為合理利用南柴胡資源，研發(fā)具有抗抑郁作用的大健康產(chǎn)品及提升南柴胡質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)。