劉俊澤，鐘修俊，王淑敏，王歡，王佳，王仁廣，李小歡

（長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長(zhǎng)春 130117）

天麻系蘭科（Orchidaceae）植物天麻（Gastrodia elata BL.）地下部分的干燥塊莖[1,2]，是一味廣泛應(yīng)用于中醫(yī)臨床的中藥材，又名定風(fēng)草、獨(dú)搖枝、赤箭[3]?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》和《本草綱目》中記載天麻有“除百病益壽延年”的功效[4]。天麻中含有天麻素（天麻苷）、對(duì)羥基苯甲醇（天麻苷元）和對(duì)羥基苯甲醛等多種酚類物質(zhì)[5]?，F(xiàn)代藥理學(xué)證明，其具有抗炎[6]、抗氧化活性[7]；天麻內(nèi)服，能治小兒驚厥，可鎮(zhèn)靜催眠、延緩衰老、祛風(fēng)安神和增強(qiáng)人體免疫力；還可治療眩暈頭痛[8]、四肢麻木、癲癇抽搐、破傷風(fēng)[9]和心腦血管[10]等疾病。

按天麻塊莖生長(zhǎng)期的形態(tài)，一般劃分為休眠期、萌動(dòng)期、白麻期、箭麻期和耗損期，共5個(gè)物候期。休眠期是指上一年11月中旬至當(dāng)年4月，此階段為麻種（白麻）休眠期，麻種頂部與側(cè)部均未見(jiàn)新芽生長(zhǎng)。萌動(dòng)期是指當(dāng)年4~6月，此階段麻種萌動(dòng)轉(zhuǎn)變?yōu)槟嘎?，母麻頂部與側(cè)部長(zhǎng)出嫩白色新芽（營(yíng)養(yǎng)繁殖莖），新芽頂端分化出小白麻，母麻顏色發(fā)黃。白麻期是指當(dāng)年6~9月，此階段白麻迅速生長(zhǎng)并膨大，但頂部仍是生長(zhǎng)錐，未分化出花莖芽；母麻抽臺(tái)出土，有皺縮現(xiàn)象出現(xiàn)，顏色偏暗。箭麻期是指當(dāng)年9~10月，白麻繼續(xù)生長(zhǎng)膨大，頂生的及少量側(cè)生的大白麻頂端分化出鸚哥嘴，逐漸轉(zhuǎn)化為箭麻；母麻抽臺(tái)出土，開(kāi)花結(jié)果，整體皺縮嚴(yán)重，部分母麻已經(jīng)成為空殼。損耗期是指當(dāng)年11月至第2年3月，天麻進(jìn)入休眠期，如果不采收會(huì)消耗體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)；母麻地上花莖枯萎，頂端殘留莖基，地下塊莖皺縮、中空直至腐爛[11]。

長(zhǎng)白山區(qū)將箭麻期的白麻和箭麻稱為天麻仔子或夢(mèng)生，即沒(méi)有抽臺(tái)出土一直在地下生長(zhǎng)的小天麻，此時(shí)白麻頂端未分化出花莖芽（鸚哥嘴），箭麻頂端已分化出花莖芽（鸚哥嘴），其體內(nèi)漿液充足，個(gè)體飽滿，商品價(jià)格較高。將白麻期和箭麻期的母麻稱為天麻老母，已經(jīng)抽臺(tái)出土，其養(yǎng)分在開(kāi)花結(jié)果過(guò)程中大量消耗，空心化嚴(yán)重，市場(chǎng)價(jià)格較低。目前無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道兩者之間質(zhì)量和有效成分含量等差異，本文以長(zhǎng)白山地區(qū)的烏桿天麻為研究對(duì)象，深入探究母麻與子麻的質(zhì)量差異，意在指導(dǎo)臨床用藥，使其充分發(fā)揮藥用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

樣品來(lái)源：實(shí)驗(yàn)所用的長(zhǎng)白山烏桿天麻母麻與子麻均采購(gòu)自吉林省通化參紀(jì)元商貿(mào)有限公司，樣品經(jīng)長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)王淑敏教授鑒定為蘭科植物天麻（Gastrodia elata BL.）的地下干燥塊莖。

供試試劑：天麻素（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：Y02M6K1）；對(duì)羥基苯甲醇（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：R09D8X50333）；甲醇、乙腈為色譜級(jí)（賽默飛世爾科技有限公司）；磷鉬酸（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）；乙酸乙酯、石油醚、無(wú)水乙醇、鹽酸、磷酸（北京化工廠，分析純）；水為娃哈哈純凈水。

供試儀器：Aglient1260高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司）；AS超聲波清洗機(jī)（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）；GZX-9140MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州市江南實(shí)驗(yàn)儀器廠）；AUY-220千分之一電子天平（島津國(guó)際貿(mào)易上海有限公司）；ME204E萬(wàn)分之一電子天平（梅特勒托利多公司）；SX2-4-10一體式馬弗爐（上海合恒儀器設(shè)備有限公司）；ZW-21D18A記號(hào)電陶爐（佛山市順德區(qū)小電大器商貿(mào)有限公司）；KDM型調(diào)溫電熱套（山東鄄城華魯電熱儀器有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 性狀鑒別 野生天麻呈長(zhǎng)橢圓形或卵圓形，皺縮而稍彎曲，長(zhǎng)5~10 cm，寬3~5 cm，厚1~3 cm。麻體黃棕色，皺紋多，透明度差。觀察天麻頂端紅棕色干枯芽苞或殘存莖基或莖痕、下部鈍圓并有圓形的疤痕，觀察表面是否有點(diǎn)狀排列環(huán)紋，黃褐色菌素；觀察天麻質(zhì)地，折后斷面是否平坦、呈角質(zhì)狀。聞氣味，應(yīng)有“馬尿臭”味。

1.2.2 TLC定性鑒別 對(duì)照品溶液的制備：精密稱取天麻素、對(duì)羥基苯甲醇各5 mg，分別加入甲醇，定容，制成1 mg/mL，即得。

供試品溶液的制備：取兩種樣品粉末（過(guò)2號(hào)篩）各2 g，加15 mL 70%甲醇，超聲法處理30 min，取濾液，即得。

鑒別方法：采用2020年版《中國(guó)藥典》薄層色譜法（通則0502）[1]。吸取天麻素對(duì)照品2L，兩供試品各8L點(diǎn)于同一硅膠板，以乙酸乙酯 甲醇 水（9:1:0.2）為展開(kāi)劑，吹干噴以10 %磷鉬酸乙醇，105℃下加熱至斑點(diǎn)清晰[13]；吸取對(duì)羥基苯甲醇對(duì)照品4L，兩供試品各9L點(diǎn)于同一硅膠板，以石油醚（60~90℃）乙酸乙酯（1:1）為展開(kāi)劑，吹干后噴10%磷鉬酸乙醇，105℃下加熱至斑點(diǎn)清晰。

1.2.3 質(zhì)量檢查 水分、總灰分、浸出物采用2020年版《中國(guó)藥典》四部方法測(cè)定[1]。同時(shí)在總灰分檢查基礎(chǔ)上增加酸不溶性灰分檢查。

1.2.4 天麻素、對(duì)羥基苯甲醇含量測(cè)定

1.2.4.1 色譜條件 迪馬Diamonsil-C18色譜柱（5m，250 mm 4.6 mm）；流動(dòng)相乙腈-0.05%磷酸溶液（3:97）；流速1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)：220 nm，柱溫：30℃，進(jìn)樣量：10L。按天麻素峰計(jì)算，理論板數(shù)應(yīng)不低于5 000[14,15]。

1.2.4.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取天麻素、對(duì)羥基苯甲醇，分別加乙腈 水（3:97）配制成0.1 mg/mL的天麻素與對(duì)羥基苯甲醇母液。吸取適量?jī)煞N對(duì)照品母液，混合，加乙腈 水（3:97）定容[12,13]，得含天麻素濃度為0.05 mg/mL、對(duì)羥基苯甲醇濃度為0.02 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。

1.2.4.3 供試品溶液的配制 取母麻與子麻粉末（過(guò)2號(hào)篩）各2g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加入50mL稀乙醇溶液，稱定重量，超聲波法提取30 min，冷卻至室溫，補(bǔ)足失重，濾過(guò)，取10 mL濾液，揮干，再用稀乙醇復(fù)溶至25 mL，0.45m微孔濾膜過(guò)濾，即得。

1.2.4.4 方法學(xué)考察 線性關(guān)系考察：精密吸取濃度為0.01 mg/mL、0.02 mg/mL、0.04 mg/mL、0.05 mg/mL、0.06 mg/mL、0.08 mg/mL和0.10 mg/mL的天麻素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，0.004 mg/mL、0.008 mg/mL、0.016 mg/mL、0.02mg/mL、0.024mg/mL、0.032mg/mL和0.040mg/mL的對(duì)羥基苯甲醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按“1.2.4.1”色譜條件進(jìn)行測(cè)定。以橫坐標(biāo)（x）為進(jìn)樣量，縱坐標(biāo)（y）為峰面積進(jìn)行回歸。精密度考察：取同一混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液10L，按“1.2.4.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)測(cè)定6次，記錄天麻素峰面積、對(duì)羥基苯甲醇峰面積，計(jì)算RSD值。穩(wěn)定性考察：取同一供試品溶液10L，按“1.2.4.1”方法于0 h、4 h、8 h、12 h、16 h和24 h進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算RSD值。重復(fù)性考察：取同一批母麻供試品，按“1.2.4.3”方法制備6份供試品溶液，按“1.2.4.1”方法進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算RSD值。加樣回收率考察：精密稱取已知含量的母麻樣品6份，精密向其中加入對(duì)照品，按“1.2.4.3”方法制備供試品溶液，在“1.2.4.1”方法下進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 性狀鑒別結(jié)果

母麻呈橢圓形，略扁，稍彎，表皮有褶皺，長(zhǎng)5~13cm，寬2~5 cm，厚1~2 cm。通體黃白色至黃棕色，有縱皺紋及橫環(huán)紋，頂端有殘存的花莖基，另端有直徑0.5 cm左右的圓臍狀疤痕。質(zhì)地堅(jiān)硬，不易折斷，斷面淡棕黃色，角質(zhì)樣，較平坦。有辛辣氣味，味甘。

子麻塊莖細(xì)小，呈長(zhǎng)條狀，稍彎，表皮有褶皺，長(zhǎng)8~11 cm，寬1.5~2 cm，厚0.5~1.5 cm。加工后通體黃棕色至褐色，多見(jiàn)縱皺紋，頂端無(wú)花莖芽，另端有直徑0.1~0.2 cm的圓臍狀疤痕，質(zhì)地脆，較母麻易折，斷面深棕色，角質(zhì)樣，較平坦。同樣有辛辣氣味，味甘。

圖1 天麻干燥塊莖Fig.1 Dry tubers of Gastrodia elata

2.2 TLC定性鑒別結(jié)果

由圖2-A顯示，天麻母麻與子麻提取物與天麻素對(duì)照品經(jīng)顯色后在相同位置顯現(xiàn)特異性藍(lán)紫色斑點(diǎn)，說(shuō)明天麻母麻與子麻中均含有天麻素成分。展開(kāi)劑中中等極性乙酸乙酯所占比例大，說(shuō)明天麻素在中等極性條件下分離效果良好。

由圖2-B顯示，天麻母麻與子麻提取物與對(duì)羥基苯甲醇對(duì)照品經(jīng)顯色后在相同位置顯現(xiàn)特異性紫紅色斑點(diǎn)，說(shuō)明天麻母麻與子麻中均含有對(duì)羥基苯甲醇成分。天麻中對(duì)羥基苯甲醇相比其他成分極性小，脂溶性大，選用非極性和中等極性的石油醚、乙酸乙酯為展開(kāi)劑，分離效果明顯。

圖2 TLC定性鑒別結(jié)果Fig.2 TLC qualitative identification results

2.3 質(zhì)量檢查結(jié)果

水分、總灰分、酸不溶性灰分和浸出物檢查結(jié)果見(jiàn)表1和表2。

表1 母麻水分、總灰分、酸不溶性灰分和稀乙醇浸出物檢查結(jié)果Table 1 Results of moisture,total ash,acid-insoluble ash and diluted ethanol extract of parent Gastrodia elata %

表2 子麻水分、總灰分、酸不溶性灰分和稀乙醇浸出物檢查結(jié)果Table 2 Results of moisture,total ash,acid-insoluble ash and diluted ethanol extract of subsidiary Gastrodia elata %

2020年版《中國(guó)藥典》第一部天麻藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定，天麻藥材水分含量應(yīng)不得多于15.0%，總灰分含量應(yīng)不得多于4.5%，浸出物含量不得少于15.0%。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果天麻母麻樣品與天麻子麻樣品水分、總灰分、浸出物含量均符合藥典規(guī)定。母麻平均水分含量為8.22%高于子麻的7.97%；天麻母麻平均總灰分含量為3.41%高于子麻的2.93%；母麻平均酸不溶性灰分含量為0.20%高于子麻的0.19%；母麻浸出物含量為27.58%高于子麻的19.61%。

2.4 方法學(xué)考察結(jié)果

2.4.1 線性關(guān)系考察天麻素、對(duì)羥基苯甲醇方程分別為y=18 670x-0.438 0（R2=1）、y=35 340x-1.197 2（R2=1），各在0.1~1.0g、0.04~0.40g有良好線性關(guān)系。

2.4.2 精密度考察 測(cè)得天麻素和對(duì)羥基苯甲醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液峰面積RSD分別為0.17%和0.48%，說(shuō)明儀器精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性考察 供試品溶液中天麻素與對(duì)羥基苯甲醇RSD分別為0.68%和0.61%，說(shuō)明此溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4 重復(fù)性考察 測(cè)得天麻素和對(duì)羥基苯甲醇RSD值分別為0.24%和1.81%，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)方法重復(fù)性良好。

2.4.5 加樣回收率考察 天麻素和對(duì)羥基苯甲醇的加樣回收率結(jié)果見(jiàn)表3，結(jié)果均符合規(guī)定。

表3 母麻中天麻素加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Experimental results of gastrodin addition and recovery in parent Gastrodia elata

表4 母麻中對(duì)羥基苯甲醇加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Experimental results of adding and recovering p-hydroxybenzyl alcohol in parent Gastrodia elata

2.5 樣品含量測(cè)定結(jié)果

2020年版《中國(guó)藥典》規(guī)定含天麻素與對(duì)羥基苯甲醇的總量不得少于0.25%，含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表5，色譜圖見(jiàn)圖3。

表5 天麻素、對(duì)羥基苯甲醇含量測(cè)定結(jié)果Table 5 Determination results of gastrodin and p-hydroxybenzyl alcohol %

圖3 天麻素、對(duì)羥基苯甲醇HPLC色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of gastrodin and p-hydroxybenzyl alcohol

3 討論與結(jié)論

天麻在我國(guó)分布廣泛，資源豐富，但野生天麻資源稀少[16]，市場(chǎng)中多流通天麻的栽培種，藥材質(zhì)量差異明顯。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，天麻中所含的天麻素和對(duì)羥基苯甲醇在失眠、驚厥、抑郁和認(rèn)知障礙等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面有顯著療效，作用機(jī)制多樣，兩成分具有一定抗氧化活性，可提高自由基清除能力、降低腦內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化物的產(chǎn)生，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞[17]；可維持腦內(nèi)乙酰膽堿、谷氨酸（Glu）、-氨基丁酸（GABA）、5-羥色胺（5-HT）、多巴胺（DA）、去甲腎上腺素（NE）、5-吲哚乙酸（5-HIAA）、高香草酸（HVA）和二羥苯乙酸（DOPAC）等多種神經(jīng)遞質(zhì)遞質(zhì)平衡[18,19]；調(diào)節(jié)炎癥因子水平，抑制細(xì)胞凋亡，上調(diào)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá)[6]。因此，天麻素與對(duì)羥基苯甲醇的含量對(duì)天麻藥材質(zhì)量的評(píng)價(jià)尤為重要。

故本實(shí)驗(yàn)采用2020年版《中國(guó)藥典》中天麻的鑒別、檢查和含量測(cè)定的方法，比較了長(zhǎng)白山烏桿天麻母麻與子麻的質(zhì)量。結(jié)果顯示，母麻與子麻的性狀特征具有明顯的區(qū)別，外觀有明顯區(qū)別。二者均屬于蘭科植物天麻的干燥塊莖，均可加工成天麻藥材進(jìn)行應(yīng)用。母麻中水分、總灰分、酸不溶性灰分以及浸出物指標(biāo)均高于子麻，而子麻中活性成分天麻素及對(duì)羥基苯甲醇均較母麻高，推測(cè)這些成分在生長(zhǎng)旺期積累量高，隨著母麻生長(zhǎng)期的延長(zhǎng)，此類次級(jí)代謝產(chǎn)物不斷地分解代謝，因此含量降低。但是，天麻母麻與子麻的藥效差異還需進(jìn)一步探究，在質(zhì)量對(duì)比上也應(yīng)進(jìn)一步細(xì)化，可選取同株的母麻與子麻進(jìn)行進(jìn)一步研究。

目前從外觀質(zhì)地和化學(xué)成分含量方面評(píng)價(jià)具有一定的指導(dǎo)價(jià)值，但中藥發(fā)揮作用往往是多活性成分相互作用的結(jié)果，隨著檢測(cè)技術(shù)手段的進(jìn)步，可應(yīng)用更多的方法進(jìn)行天麻質(zhì)量分析，如Chen等[20]將近紅外光譜與化學(xué)計(jì)量學(xué)相結(jié)合來(lái)區(qū)分野生型和栽培型天麻。Zuo等[21]應(yīng)用近紅外光譜技術(shù)檢測(cè)天麻在蒸煮過(guò)程中4種成分含量及水分變化，可對(duì)炮制中天麻進(jìn)行快速在線監(jiān)測(cè)和質(zhì)量控制。上述方法有望取代目前的主觀色彩判斷和費(fèi)時(shí)的HPLC或UV/Vis方法，為不單只靠化學(xué)指標(biāo)評(píng)價(jià)天麻商品等級(jí)提供思路，為天麻的采收加工以及商品等級(jí)的劃分提供指導(dǎo)，保證臨床用藥的安全性和有效性。