張鵬博，李智星，魏 勇，張逸雪，劉文楷，蔣 松＊

1 石河子大學動物科技學院，新疆石河子 832000

2 新疆天潤乳業(yè)股份有限公司，新疆烏魯木齊 832063

0 引言

嗜冷菌作為影響牛奶質(zhì)量的一類微生物，其數(shù)量的多少直接影響牛奶的風味、口感以及成品乳的保質(zhì)期[1]。牛奶中嗜冷菌數(shù)量最佳的范圍是在1.0×103CFU/mL以下，嗜冷菌超過1.0×103CFU/mL則會與牛奶中的乳蛋白、乳脂肪等作用生成酶，產(chǎn)生凝結(jié)塊及脂肪氫化味[2]。在我國現(xiàn)行的生鮮乳收購標準《GB19301—2010 食品安全國家標準 生乳》中規(guī)定，生鮮乳中微生物菌落數(shù)在2.0×106CFU/mL 以下為合格乳。但一些歐美國家則以嗜冷菌在1.0×103CFU/mL以下為生鮮乳的收購標準，因此國內(nèi)乳品企業(yè)愈發(fā)地重視嗜冷菌的防控，部分優(yōu)秀乳品企業(yè)提高了嗜冷菌的合格標準，以進一步保障乳制品的質(zhì)量安全。

我國乳及其制品中嗜冷菌的菌落總數(shù)標準測定方法為《NY/T 1331—2007 乳與乳制品中嗜冷菌、需氧芽孢及嗜熱需氧芽孢數(shù)的測定》中的MPC平板計數(shù)法，即取乳樣加入指定培養(yǎng)基后于6.5 ℃條件下培養(yǎng)10 d，該方法計數(shù)結(jié)果準確[3]。但國標檢測方法周期長，追溯問題原因困難，各乳品企業(yè)執(zhí)行的檢測標準不同，對原料乳中嗜冷菌數(shù)量的檢測方法也不同?，F(xiàn)階段有直接熒光過濾法、流式細胞術(shù)和聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）法等直接檢測方法，但也均有各自的優(yōu)缺點。此外，以上方法的從生鮮乳采樣到檢測之間都會存在一定的時間間隔，間隔時間不同，均會對檢測結(jié)果造成不同程度的影響。因此，本研究對比了《NY/T 1331—2007 乳與乳制品中嗜冷菌、需氧芽孢及嗜熱需氧芽孢數(shù)的測定》中的MPC中平板計數(shù)法在不同檢測時間時，原料乳中嗜冷菌水平差異，為提高原料乳中嗜冷菌檢測的準確性，制定更加合理的嗜冷菌檢測標準流程提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及設(shè)備

嗜冷菌培養(yǎng)基，北京陸橋計數(shù)股份有限公司；生化培養(yǎng)箱，上海博遠醫(yī)藥生物儀器股份有限公司。

1.2 樣品采集

本試驗采集新疆部分地區(qū)的10個牧場（其中3個現(xiàn)代化牧場、4個傳統(tǒng)牧場、3個養(yǎng)殖小區(qū)）的奶罐車生鮮奶樣，共計120 份（現(xiàn)代化牧場39 份、傳統(tǒng)牧場51 份、養(yǎng)殖小區(qū)30 份），奶罐車混合生鮮乳樣本收集前按照奶樣取樣攪拌標準進行完全混合，遵守無菌采樣規(guī)程，選取上中下三等分混合采集于無菌采樣瓶中采樣后搖勻即時放入4 ℃冰箱中保存。

1.3 檢測方法

同一份奶樣，在取樣后即時進行檢測，之后將樣品放入4℃冰箱中保存，在取樣后12 h和24 h后再次進行檢測。

檢測過程嚴格按照《NY/T 1331—2007 乳與乳制品中嗜冷菌、需氧芽孢及嗜熱需氧芽孢數(shù)的測定》中的MPC中平板計數(shù)法進行檢測。檢測前準備高溫滅菌后的培養(yǎng)皿、無菌吸管及稀釋液，在無菌環(huán)境下，對樣品分別進行10-2和10-3倍稀釋，每個稀釋梯度做3個平行，結(jié)果采取平均值，并以相應稀釋液做空白對照，接種于培養(yǎng)皿后，待其凝固后放置6.5 ℃的低溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d。10 d后將培養(yǎng)好的嗜冷菌用平板計數(shù)法計數(shù)，粘連菌群不分層記作1，分層另計數(shù)，最終統(tǒng)計樣品總數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

本試驗所得數(shù)據(jù)使用SPSS19.0軟件進行單因素方差分析，并利用Duncan法進行多重比較，以P＜0.05表示差異顯著；以P＞0.05表示差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 10-2稀釋梯度下相同養(yǎng)殖模式牧場不同時間嗜冷菌檢測結(jié)果對比

由表1可見，在10-2稀釋梯度下，現(xiàn)代化牧場即時檢測結(jié)果和間隔12 h和間隔24 h的檢測結(jié)果差異均顯著（P＜0.05）。傳統(tǒng)牧場即時檢測結(jié)果與間隔12 h和間隔24 h的檢測結(jié)果差異顯著（P＜0.05）；間隔12 h與間隔24 h的檢測結(jié)果差異不顯著（P＞0.05）。而養(yǎng)殖小區(qū)即時檢測結(jié)果與間隔24 h的檢測結(jié)果差異顯著（P＜0.05），與間隔12 h的檢測結(jié)果差異不顯著（P＞0.05）；間隔12 h和間隔24 h檢測結(jié)果差異不顯著（P＞0.05）。

表1 10-2稀釋梯度下相同養(yǎng)殖模式牧場不同時間嗜冷菌檢測結(jié)果對比

2.2 10-3稀釋梯度下相同養(yǎng)殖模式牧場不同時間嗜冷菌檢測結(jié)果對比

由表2可見，在10-3稀釋梯度下，現(xiàn)代化牧場即時檢測結(jié)果和間隔12 h和間隔24 h的檢測結(jié)果差異均顯著（P＜0.05）。傳統(tǒng)牧場即時檢測結(jié)果與間隔12 h和間隔24 h的檢測結(jié)果差異顯著（P＜0.05）；間隔12 h與間隔24 h的檢測結(jié)果差異不顯著（P＞0.05）。而養(yǎng)殖小區(qū)即時檢測結(jié)果與間隔24 h的檢測結(jié)果差異顯著（P＜0.05），與間隔12 h的檢測結(jié)果差異不顯著（P＞0.05）；間隔12 h和間隔24 h檢測結(jié)果差異不顯著（P＞0.05）。

表2 10-3稀釋梯度下相同養(yǎng)殖模式牧場不同時間嗜冷菌檢測結(jié)果對比

3 討論

嗜冷菌是一類在低溫條件下仍可以生長的微生物[4]。這就導致了原料乳在4 ℃保存時嗜冷菌仍能生長繁殖。嗜冷菌在牛奶中與其主要營養(yǎng)成分作用生成耐熱酶，并且這些耐熱酶無法通過高溫降解，導致商品乳中營養(yǎng)成分大大的遭到破壞。人們在不斷地追求牛奶品質(zhì)的提升，將原料乳中嗜冷菌菌落總數(shù)控制在合格的范圍內(nèi)即可對牛奶品質(zhì)造成最小的影響。由此，檢測嗜冷菌對牛奶品質(zhì)的判定就顯得尤為重要[5]。

根據(jù)各牧場的數(shù)據(jù)反饋，牧場實驗室嗜冷菌檢測總數(shù)要遠遠小于乳品廠實驗室檢測，主要原因有兩點：其一，新疆地區(qū)占地面積較大，原料乳在運輸中路途遙遠，雖然運輸過程會保證奶罐溫度恒定，但原料乳是嗜冷菌良好的培養(yǎng)基，這使得嗜冷菌仍然會生長繁殖[6]，而這會導致實驗室檢測與牧場自檢的結(jié)果相差甚大。其二，考慮到原料乳中需要檢測的指標較多，采樣后不能即時進行微生物檢測，樣品需要冷藏，與上述原因同理，導致樣品中嗜冷菌不斷繁殖。本研究結(jié)果表明，在10-2和10-3兩個稀釋梯度下，3個不同模式牧場嗜冷菌結(jié)果均隨著檢測間隔時間的增加而增加，其中現(xiàn)代化牧場和傳統(tǒng)牧場嗜冷菌即時檢測結(jié)果和間隔12 h和24 h的檢測結(jié)果均存在顯著性差異，而由于養(yǎng)殖小區(qū)多為散戶家養(yǎng)，管理不統(tǒng)一，導致原料奶的嗜冷菌菌落總數(shù)差異較大，又因平板計數(shù)法統(tǒng)計菌落總數(shù)的局限性，導致養(yǎng)殖小區(qū)嗜冷菌即時檢測和間隔24 h差異顯著（P＜0.05），間隔12 h檢測結(jié)果與即時檢測和間隔24 h檢測結(jié)果無顯著差異（P＞0.05）。

由此可見，雖然降低牛奶嗜冷菌數(shù)量的主要任務(wù)在于牧場的嚴格把控，但數(shù)據(jù)的準確性在于檢測人員對國標法的嚴格執(zhí)行，因此在不能縮短奶車運輸?shù)那疤嵯?，可以縮短采樣至檢測的時間間隔，使數(shù)據(jù)更具有說服力，以確定嗜冷菌污染的真正原因。在4 ℃冷藏原料乳的條件下，嗜冷菌仍能較快的生長繁殖，并逐漸演變成原料乳中的優(yōu)勢菌群，故應縮短生鮮乳從擠出的一刻到消殺滅菌的時間，以有效地控制原料乳中嗜冷菌的增長。同時，牧場也應對奶廳進行嚴格規(guī)范的衛(wèi)生管理，對工作人員加強培訓，從根本上解決牛奶中嗜冷菌基數(shù)大的問題[7]。

4 結(jié)論

檢測間隔時間對原料乳中嗜冷菌檢測結(jié)果存在影響，樣品檢測間隔時間越久，最終檢測出結(jié)果越大，導致最終結(jié)果不具有準確性和說服性。