張麗君，李琳瓊，尹大成，高瑀瓏

（南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇南京 210023）

沙門氏菌是一種常見的的食源性致病菌，在自然界中分布較廣，在適宜條件下可迅速生長(zhǎng)繁殖，引起人類急性、慢性和隱性感染病，如食物中毒和腸胃炎等[1]。在食品的生產(chǎn)、儲(chǔ)運(yùn)和銷售過(guò)程中，沙門氏菌極易反復(fù)受到極端溫度、酸、堿、抗生素以及消毒劑等不適生長(zhǎng)環(huán)境條件的脅迫作用，誘發(fā)其產(chǎn)生一系列的適應(yīng)性變化，達(dá)到維持生存的目的[2]。沙門氏菌對(duì)食品加工中的消殺措施的適應(yīng)性變化，潛在地增加了沙門氏菌感染的可能性[3]。已有相關(guān)研究表明，大多數(shù)微生物在不適生長(zhǎng)的環(huán)境中會(huì)通過(guò)特定的抗性蛋白來(lái)保證其生存[4]。Chen等[5]研究發(fā)現(xiàn)，微生物處于高溫、低溫和高滲等一系列壓力環(huán)境下其部分蛋白質(zhì)的表達(dá)會(huì)發(fā)生變化，來(lái)穩(wěn)定膜結(jié)構(gòu)、維持細(xì)胞功能等。

近年來(lái)不斷完善的蛋白組學(xué)技術(shù)已用于研究不同環(huán)境壓力下對(duì)微生物產(chǎn)生的影響以及微生物在這些脅迫下的應(yīng)激機(jī)制[6]。蛋白質(zhì)組學(xué)是用于研究單個(gè)細(xì)胞或一種生物所表達(dá)全部蛋白質(zhì)特征的技術(shù)，主要包括蛋白的表達(dá)水平、翻譯的修飾、蛋白之間的相互作用等[7]。iTRAQ蛋白組技術(shù)具有通量高，靈敏度高，可重復(fù)性高，定量效果好，結(jié)果可靠，適用樣品類別廣泛等優(yōu)點(diǎn)，是系統(tǒng)研究生物學(xué)規(guī)律和相關(guān)機(jī)制的有效工具[8]。Liu等[9]利用iTRAQ蛋白組技術(shù)，探討沙雷氏菌在鉻脅迫下的潛在機(jī)制，發(fā)現(xiàn)差異蛋白主要集中在碳水化合物代謝、應(yīng)激反應(yīng)、氨基酸代謝等方面。張佩佩[10]通過(guò)對(duì)甲型鼠傷寒沙門氏菌進(jìn)行熱處理，發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)生抗熱性，利用iTRAQ蛋白組技術(shù)分析其在熱脅迫前后產(chǎn)生的差異蛋白，發(fā)現(xiàn)5%的差異蛋白參與熱刺激適應(yīng)，其中DNA連接酶（ligB）、逆境壓力反應(yīng)蛋白（dps）、分子伴侶（HdeB）以及未知蛋白ACN8920515和ynaF均下調(diào)，在熱脅迫適應(yīng)中發(fā)揮作用，使甲型鼠傷寒沙門氏菌在熱脅迫下得以存活。但采用iTRAQ技術(shù)從蛋白質(zhì)組學(xué)對(duì)鼠傷寒沙門氏菌的抗酸性機(jī)制的研究，國(guó)內(nèi)外鮮見相關(guān)報(bào)道[11]。

本研究以食源致病菌鼠傷寒沙門氏菌為試材，采用iTRAQ技術(shù)對(duì)鼠傷寒沙門氏菌抗酸性菌株的蛋白組進(jìn)行了分析，找出酸脅迫處理前后菌體之間的差異表達(dá)蛋白，通過(guò)GO功能注釋和富集對(duì)差異蛋白進(jìn)行生物過(guò)程、分子功能和細(xì)胞組分的聚類分析，通過(guò)KEGG注釋和富集對(duì)差異蛋白參與的通路進(jìn)行聯(lián)合分析，篩選出與菌株抗酸性相關(guān)的差異蛋白，并揭示酸脅迫條件下鼠傷寒沙門氏菌在應(yīng)激反應(yīng)、雙組分系統(tǒng)、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)和能量代謝等過(guò)程中相關(guān)蛋白表達(dá)的差異，旨在揭示酸脅迫誘導(dǎo)鼠傷寒沙門氏菌產(chǎn)生抗酸性的機(jī)理，對(duì)優(yōu)化食品加工條件和建立食品安全控制體系具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鼠傷寒沙門氏菌CGMCC 1.1190 中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心；異丙醇、磷酸、檸檬酸、氯化鉀、磷酸二氫鉀、乙腈、甲酸、三氯乙酸、丙酮、溴化四乙銨、十二烷基硫酸鈉、二硫蘇糖醇、鹽酸、三羥甲基氨基甲烷 南京慧杰誠(chéng)生物科技有限公司；所有試劑 均為分析純。

SAF-680T型酶標(biāo)儀、SF-CF-2A型超凈工作臺(tái)上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司；AKTA Purifier 100型純化儀、PHS-3G型pH計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；Easy nLC 1200型液相色譜儀、Q Exactive型質(zhì)譜儀 賽默飛世爾科技有限公司；SM-650D型超聲波破碎儀 南京舜碼儀器設(shè)備有限公司；GL-21M型高速冷凍離心機(jī) 上海市離心機(jī)械研究所有限公司；LDZX-50FBS型立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；GNP-9160型隔水式恒溫培養(yǎng)箱 上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司；ME55型塞多斯精密電子天平 北京塞多斯天平有限公司；SK-1型快速混勻器 金壇市杰瑞爾電器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種活化與預(yù)處理 實(shí)驗(yàn)菌株CGMCC 1.1190采用胰蛋白胨大豆肉湯（Trypticase Soy Broth，TSB）培養(yǎng)。供試菌經(jīng)活化后，接入pH7.2的TSB培養(yǎng)基，于37 ℃、150 r/min搖床振蕩培養(yǎng)18 h，為后續(xù)備用。

1.2.2 鼠傷寒沙門氏菌CGMCC 1.1190抗酸性菌株的獲得 pH2.5檸檬酸脅迫處理：將1.2.1中活化的CGMCC 1.1190以體積分?jǐn)?shù)1%轉(zhuǎn)接至100 mL TSB培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)18 h，取10 mL培養(yǎng)液離心（5000 r/min，4 ℃，10 min），棄上清，重懸于檸檬酸調(diào)節(jié)pH2.5的TSB中進(jìn)行酸脅迫處理，處理30 min，取體積分?jǐn)?shù)為1%經(jīng)pH2.5檸檬酸脅迫后的CGMCC 1.1190接種于100 mL TSB培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)18 h，再取10 mL培養(yǎng)液離心（5000 r/min，4 ℃，10 min），取沉淀，重懸于檸檬酸調(diào)節(jié)pH2.5的TSB中進(jìn)行酸脅迫處理，處理30 min；以此類推，重復(fù)上述搖床振蕩培養(yǎng)和酸脅迫處理12次，后續(xù)備用[12]。

1.2.3 蛋白組樣品的制備 將1.2.1中活化的CGMCC 1.1190原始對(duì)照菌株及1.2.2節(jié)獲得抗pH2.5檸檬酸的菌株分別接種于100 mL TSB中，搖床振蕩培養(yǎng)（37 ℃，150 r/min，24 h），離心（5000 r/min，4 ℃，10 min），取沉淀，將菌體沉淀的離心管置于液氮中，速凍10 min，并標(biāo)記樣品號(hào)為對(duì)照組CK1、對(duì)照組CK2、處理組T1和處理組T2，置于-80 ℃冰箱保存，備用。

1.2.4 iTRAQ標(biāo)記 采用SDT裂解法和TCA丙酮沉淀法提取CGMCC 1.1190菌體蛋白[13]，用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白樣品濃度。取制備的蛋白樣品各100 μg，用FASP法[14]進(jìn)行酶解，酶解后采用C18 Cartridge對(duì)肽段進(jìn)行脫鹽，將上述樣品真空冷凍干燥2 h，加入0.1%、40 μL的甲酸溶液復(fù)溶肽段。用iTRAQ試劑盒對(duì)肽段進(jìn)行標(biāo)記，室溫靜置2 h，標(biāo)記信息分別為：CK1，113；CK2，114；T1，115；T2，116。等量混合經(jīng)iTRAQ標(biāo)記的4組肽段樣品，根據(jù)強(qiáng)陽(yáng)離子交換柱法對(duì)混合后的肽段進(jìn)行預(yù)分離，之后進(jìn)行液相分離和質(zhì)譜分析。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證 本研究選取CGMCC 1.1190菌株酸脅迫前后的8個(gè)顯著差異蛋白的對(duì)應(yīng)表達(dá)基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證和分析。通過(guò)在線設(shè)計(jì)軟件Primer 3.0來(lái)設(shè)計(jì)用于熒光定量PCR的引物，引物見表1。用HiScript? II 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒進(jìn)行CGMCC 1.1190菌體第一鏈cDNA的合成。以cDNA鏈為模板，16S rRNA基因?yàn)閮?nèi)參基因，用ChamQTMSYBR? qPCR Master Mix試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，采用ABI 7500 PCR分析熒光定量PCR反應(yīng)中CGMCC 1.1190菌體對(duì)照菌株和抗酸菌株樣品中8個(gè)待測(cè)基因的RNA相對(duì)表達(dá)含量，對(duì)照組為未經(jīng)過(guò)酸處理的CGMCC 1.1190菌體RNA，設(shè)其表達(dá)水平為1，按照2-△△Ct法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 RT-qPCR驗(yàn)證基因及引物設(shè)計(jì)Table 1 RT-qPCR verification gene and primer design

1.2.6 生物信息學(xué)分析 采用Mascot2.2和Proteome Discover1.4對(duì)質(zhì)譜分析原始數(shù)據(jù)進(jìn)行查庫(kù)鑒定及質(zhì)量分析[15]。通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量、等電點(diǎn)、肽段序列長(zhǎng)度、肽段序列覆蓋度等方面來(lái)對(duì)蛋白質(zhì)鑒定和定量的結(jié)果可信度進(jìn)行評(píng)估。以P≤0.05對(duì)差異蛋白進(jìn)行顯著性篩選，倍數(shù)變化大于1.2或小于0.83的蛋白質(zhì)被定義為差異蛋白，得到CGMCC 1.1190對(duì)照菌株和抗酸菌株之間的上調(diào)和下調(diào)蛋白的數(shù)目。

根據(jù)抗酸性CGMCC 1.1190菌株顯著差異蛋白的表達(dá)特性，采用層次聚類算法對(duì)差異表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行分組歸類，以熱圖的形式將表達(dá)趨勢(shì)相同的基因進(jìn)行聚類[16]，同時(shí)與抗酸性CGMCC 1.1190菌株的生物學(xué)特性建立關(guān)聯(lián)，篩選出符合抗酸性生物學(xué)特性的蛋白表進(jìn)行重點(diǎn)研究。采用Blast2Go軟件對(duì)CGMCC 1.1190酸脅迫前后篩選出的所有差異表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行GO功能注釋[17]，向GO數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)應(yīng)功能的term映射，計(jì)算每個(gè)term中差異蛋白質(zhì)的數(shù)量，然后應(yīng)用Fisher精確檢驗(yàn)CGMCC 1.1190抗酸性菌株與對(duì)照菌株差異蛋白的顯著性[18]，找出差異蛋白顯著富集的GO條目，從而對(duì)CGMCC 1.1190菌株篩選出的差異蛋白行使的生物學(xué)功能進(jìn)行分析。采用KAAS軟件對(duì)CGMCC 1.1190菌株酸脅迫前后篩選出的差異表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行KEGG通路注釋，通過(guò)Fisher精確檢驗(yàn)CGMCC 1.1190抗酸性菌株與對(duì)照菌株差異蛋白的顯著性，找出所有顯著差異表達(dá)蛋白，并對(duì)抗酸性相關(guān)代謝的關(guān)鍵蛋白進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鼠傷寒沙門氏菌CGMCC 1.1190蛋白濃度的測(cè)定結(jié)果

利用BCA法測(cè)定所提取總蛋白的濃度，結(jié)果見表2。由表2可知，CGMCC 1.1190原始對(duì)照菌株（CK1，CK2）提取總蛋白濃度均為2.8 μg/μL，抗pH2.5菌株（T1，T2）提取總蛋白濃度分別為1.7和1.9 μg/μL，提取濃度能滿足后續(xù)蛋白組測(cè)定相關(guān)的要求，樣品的平行性和評(píng)價(jià)均較好。

表2 CGMCC 1.1190對(duì)照組和抗酸組菌株蛋白質(zhì)樣品濃度及評(píng)價(jià)結(jié)果Table 2 Concentration and valuation results of protein samples of CGMCC 1.1190 control strain and the acid-resistant strain

2.2 CGMCC 1.1190蛋白表達(dá)差異分析

2.2.1 CGMCC 1.1190蛋白表達(dá)差異統(tǒng)計(jì) 成功鑒定到的蛋白共2373個(gè)，已定量的蛋白占99.71%，CGMCC 1.1190對(duì)照組和抗酸組的差異蛋白總數(shù)為195個(gè)，其中包括95個(gè)顯著下調(diào)蛋白和100個(gè)顯著上調(diào)蛋白。蛋白質(zhì)定量差異結(jié)果見圖1。

圖1 CGMCC 1.1190對(duì)照組和抗酸組菌株的蛋白質(zhì)定量差異結(jié)果柱狀圖Fig.1 Histogram of protein quantitative difference results of CGMCC 1.1190 control strain and the acid-resistant strain

2.2.2 CGMCC 1.1190蛋白表達(dá)模式聚類分析 本研究對(duì)CGMCC 1.1190對(duì)照菌株和抗酸性菌株的差異表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，結(jié)果見圖2，橫坐標(biāo)對(duì)樣品進(jìn)行分析，縱坐標(biāo)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分析。從圖2中可以看出組內(nèi)的數(shù)據(jù)相似性較高，而組間的數(shù)據(jù)相似性較低，說(shuō)明對(duì)照組和抗酸組的差異蛋白質(zhì)表達(dá)量變化說(shuō)明酸脅迫處理對(duì)樣本造成的影響顯著，組內(nèi)平行性較好。100個(gè)上調(diào)蛋白在CGMCC 1.1190抗酸性菌株中的表達(dá)量高于對(duì)照菌株，其中，RNA聚合酶σ因子（rpoS）、膜融合蛋白家族蛋白（STM4260）、外膜孔道蛋白（ompC）、鞭毛絲蛋白（fliC）的變化倍數(shù)分別為1.83、3.34、2.13、1.88；95個(gè)下調(diào)蛋白在CGMCC 1.1190抗酸性菌株中的表達(dá)量高于對(duì)照菌株，其中，LexA阻遏蛋白（lexA）、異檸檬酸脫氫酶（IcdA）、精氨酸脫亞胺酶（arcA）、鳥氨酸氨基甲酰轉(zhuǎn)移酶（arcB）的變化倍數(shù)分別為0.75、0.70、0.55、0.57。

圖2 CGMCC 1.1190對(duì)照組和抗酸組菌株的差異蛋白質(zhì)聚類分析Fig.2 Cluster analysis of differential protein of CGMCC 1.1190 control strain and the acid-resistant strain

2.2.3 CGMCC 1.1190差異表達(dá)功能蛋白分類分析本研究對(duì)CGMCC 1.1190對(duì)照菌株和抗酸性菌株的蛋白質(zhì)圖譜進(jìn)行對(duì)比分析，得到195個(gè)表達(dá)差異顯著的相關(guān)蛋白。在這些差異蛋白中，大多數(shù)蛋白質(zhì)主要參與CGMCC 1.1190內(nèi)部調(diào)節(jié)代謝途徑的生理功能，包括參與應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞膜變化、鞭毛合成、轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)、雙組份系統(tǒng)相關(guān)的蛋白等，表明CGMCC 1.1190抗酸性菌株通過(guò)上述代謝途徑相關(guān)的蛋白來(lái)調(diào)控適應(yīng)酸脅迫環(huán)境。在195個(gè)顯著差異表達(dá)的蛋白中，與應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞膜變化、鞭毛合成、轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)、雙組份系統(tǒng)相關(guān)的蛋白的信息分別見表3～表8。

表3 應(yīng)激相關(guān)蛋白信息Table 3 List of protein information related to stress

表8 與能量代謝相關(guān)蛋白信息Table 8 List of protein information related to energy metabolism

2.2.4 CGMCC 1.1190差異蛋白的GO富集分析GO分析結(jié)果如圖3所示，根據(jù)生物過(guò)程注釋，差異蛋白主要與菌體內(nèi)代謝、應(yīng)激調(diào)節(jié)反應(yīng)有關(guān)；根據(jù)分子功能注釋，差異蛋白主要是各種酶類、修復(fù)蛋白以及轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；根據(jù)細(xì)胞組分注釋，差異蛋白主要涉及細(xì)胞膜組成蛋白，得到注釋的蛋白中膜蛋白占32.7%。

圖3 CGMCC 1.1190對(duì)照組和抗酸組菌株差異表達(dá)蛋白質(zhì)的GO功能注釋及富集分析圖Fig.3 GO function annotation and enrichment analysis map of differentially expressed proteins of Salmonella typhimurium CGMCC 1.1190 control strain and the acid-resistant strain

表4 細(xì)胞膜相關(guān)蛋白信息Table 4 List of protein information associated with membrane

表5 鞭毛相關(guān)蛋白信息Table 5 List of protein information related to flagella

2.2.5 CGMCC 1.1190差異蛋白的KEGG生物通路分析 KEGG分析發(fā)現(xiàn)CGMCC 1.1190對(duì)照菌株和抗酸性菌株的差異蛋白質(zhì)富集于60條代謝通路上，顯著性分析結(jié)果見圖4～圖5。由圖4～圖5可知，CGMCC 1.1190菌株的差異蛋白質(zhì)主要影響了6個(gè)代謝通路，其中雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)途徑參與的蛋白質(zhì)有19個(gè)，三羧酸循環(huán)途徑參與的蛋白質(zhì)有10個(gè)，碳固定途徑參與的蛋白質(zhì)有10個(gè)，氧化還原途徑參與的蛋白質(zhì)有7個(gè)，丙酮酸代謝途徑參與的蛋白質(zhì)有7個(gè)，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)參與的蛋白質(zhì)有6個(gè)。與CGMCC 1.1190對(duì)照菌株相比，抗酸性菌株的蛋白質(zhì)在雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)、三羧酸循環(huán)、碳固定等通路差異顯著。

圖4 CGMCC 1.1190對(duì)照組和抗酸組菌株差異表達(dá)蛋白質(zhì)的KEGG通路注釋及富集分析圖Fig.4 KEGG pathway function annotation and enrichment analysis map of differentially expressed proteins of CGMCC 1.1190 control strain and the acid-resistant strain

圖5 CGMCC 1.1190對(duì)照組和抗酸組菌株差異表達(dá)蛋白質(zhì)的KEGG顯著性分析Fig.5 KEGG significance analysis of differentially expressed proteins between CGMCC 1.1190 control strain and the acid-resistant strain

表6 雙組分系統(tǒng)相關(guān)蛋白信息Table 6 List of protein information related to two-component system

表7 ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)相關(guān)蛋白信息Table 7 List of protein information related to ABC transfer system

2.2.6 CGMCC 1.1190部分差異表達(dá)基因的RT-qPCR驗(yàn)證 為驗(yàn)證本研究中iTRAQ蛋白組數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，在經(jīng)檸檬酸調(diào)節(jié)pH為2.5的TSB培養(yǎng)基反復(fù)脅迫后的CGMCC 1.1190中選取8個(gè)差異顯著蛋白（5個(gè)上調(diào)蛋白和3個(gè)下調(diào)蛋白），進(jìn)行RT-qPCR驗(yàn)證，結(jié)果見圖6。8個(gè)目的基因的RT-qPCR結(jié)果與8個(gè)差異蛋白的iTRAQ蛋白組測(cè)定結(jié)果在表達(dá)幅度上有一定的差異，但其表達(dá)趨勢(shì)基本一致。

圖6 CGMCC 1.1190對(duì)照組和抗酸組菌株部分基因的RTqPCR驗(yàn)證Fig.6 RT-qPCR verification of some genes between CGMCC 1.1190 control strain and the acid-resistant strain

3 討論

3.1 抗酸性鼠傷寒沙門氏菌CGMCC 1.1190與應(yīng)激相關(guān)蛋白的分析

微生物常處于不適的環(huán)境中，應(yīng)激蛋白指大多數(shù)菌體在遭受外界壓力時(shí)合成的蛋白，在菌體迅速回應(yīng)逆境等方面發(fā)揮重要作用[19]。對(duì)比分析CGMCC 1.1190對(duì)照菌株和抗酸性菌株的蛋白組，當(dāng)菌體經(jīng)過(guò)酸脅迫后，RNA聚合酶σ因子（rpoS）蛋白水平上調(diào)約1.8倍，其處于調(diào)控較上游的位置并控制休克蛋白表達(dá)，保護(hù)環(huán)境壓力下的菌體，對(duì)其適應(yīng)性有調(diào)控作用[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，RNA聚合酶σ因子對(duì)CGMCC 1.1190菌體適應(yīng)酸脅迫環(huán)境起到一定的調(diào)控作用。熱休克蛋白是一種保護(hù)性蛋白，通過(guò)參與蛋白的正確折疊、維持細(xì)胞骨架等來(lái)提高細(xì)胞的耐熱等應(yīng)激能力，使菌體細(xì)胞內(nèi)的生理過(guò)程保持穩(wěn)定[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，抗酸性CGMCC 1.1190的小熱休克蛋白（ibpA）表達(dá)增加，表明其對(duì)菌株的耐酸能力也具有一定的調(diào)控作用，該調(diào)控作用可能與菌株產(chǎn)生耐熱性的過(guò)程類似。RecA蛋白和LexA阻遏蛋白是與菌體遭受環(huán)境脅迫后與修復(fù)機(jī)制相關(guān)的蛋白，當(dāng)SOS系統(tǒng)被激活，recA和單鏈DNA會(huì)結(jié)合生成recA-ssDNA，誘導(dǎo)LexA阻遏蛋白進(jìn)行自我降解，增加重組酶和聚合酶的表達(dá)，修復(fù)損傷[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，抗酸性CGMCC 1.1190的recA蛋白表達(dá)增加，lexA阻遏蛋白表達(dá)減少，表明在經(jīng)過(guò)酸脅迫后，CGMCC 1.1190抗酸性與菌體內(nèi)部SOS系統(tǒng)的激活有關(guān)，菌體通過(guò)相關(guān)蛋白的協(xié)同作用修復(fù)損傷來(lái)提高其在酸環(huán)境下的生存能力。

3.2 抗酸性CGMCC 1.1190與膜相關(guān)蛋白的分析

細(xì)菌膜蛋白在其生命活動(dòng)中起著重要的作用，主要維持細(xì)胞膜的完整、流動(dòng)性、參與菌體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸以及物質(zhì)代謝[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，抗酸性CGMCC 1.1190部分膜蛋白的表達(dá)量發(fā)生改變，其中ompC基因編碼的外膜孔道蛋白C表達(dá)水平顯著上調(diào)。戎建榮等[24]發(fā)現(xiàn)，在高滲環(huán)境中，大腸桿菌通過(guò)改變外膜孔道蛋白C的表達(dá)水平減少膽鹽滲入菌體細(xì)胞；受到抗菌藥物脅迫的細(xì)菌，其外膜孔道蛋白C蛋白表達(dá)有助于降低菌體內(nèi)抗菌藥物的濃度、增加耐受力。本研究結(jié)果表明外膜孔道蛋白C對(duì)CGMCC 1.1190的抗酸性起到一定的調(diào)控作用，通過(guò)改變細(xì)胞膜的通透性，如降低細(xì)胞膜對(duì)H+的通透性來(lái)幫助細(xì)菌適應(yīng)酸脅迫環(huán)境。Tol-Pal系統(tǒng)是革蘭氏陰性菌高度保守的膜蛋白系統(tǒng)之一，主要由Tol-Pal系統(tǒng)蛋白（tolB）、肽多糖相關(guān)蛋白（pal）、Tol-Pal系統(tǒng)蛋白（tolA）、Tol-Pal系統(tǒng)蛋白（tolR）和Tol-Pal系統(tǒng)蛋白（tolQ）組成，其中tolA、tolQ和tolR構(gòu)成細(xì)菌的內(nèi)膜蛋白，tolB和pal構(gòu)成細(xì)菌外膜復(fù)合體，Tol-Pal系統(tǒng)維持革蘭氏陰性菌細(xì)胞膜的完整性和穩(wěn)定性。Prouty等[25]研究發(fā)現(xiàn)，鼠傷寒沙門氏菌耐受膽鹽的能力與Tol-Pal系統(tǒng)的調(diào)控有關(guān)。本研究CGMCC 1.1190抗酸性菌株Tol-Pal系統(tǒng)蛋白均上調(diào)，表明酸脅迫后CGMCC 1.1190產(chǎn)生的抗酸性與其Tol-Pal膜蛋白系統(tǒng)的調(diào)控有關(guān)，可能通過(guò)增加細(xì)胞膜的完整性和穩(wěn)定性來(lái)幫助其抵抗并適應(yīng)極端酸脅迫環(huán)境。因此，膜蛋白表達(dá)量的變化可能是CGMCC 1.1190酸脅迫菌株比原始菌株更抗酸的原因之一。

3.3 抗酸性CGMCC 1.1190與鞭毛相關(guān)蛋白的分析

細(xì)菌的鞭毛是一種位于菌體表面的細(xì)絲狀蛋白質(zhì)附屬物，主要與細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)性和大分子蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)[26]。Duan等[27]通過(guò)對(duì)比研究大腸桿菌fliC基因缺失株的運(yùn)動(dòng)能力和侵襲能力，發(fā)現(xiàn)大腸桿菌fliC缺失株的運(yùn)動(dòng)能力和侵襲能力顯著低降低。本研究發(fā)現(xiàn)，抗酸性CGMCC 1.1190的鞭毛相關(guān)差異蛋白均上調(diào)，其中鞭毛絲蛋白（fliC）上調(diào)約1.9倍，表明抗酸性CGMCC 1.1190的運(yùn)動(dòng)能力對(duì)其抗酸性有重要影響。細(xì)菌鞭毛蛋白調(diào)控的運(yùn)動(dòng)性也是生物被膜形成初期和成熟期的決定性因素，大腸桿菌運(yùn)動(dòng)性的強(qiáng)弱與生物被膜形成能力呈正相關(guān)[28]。這與本研究結(jié)果一致，表明鞭毛蛋白調(diào)控的運(yùn)動(dòng)性增強(qiáng)可以促進(jìn)菌體形成具有抵抗能力的生物被膜。本研究中鞭毛相關(guān)蛋白表達(dá)的變化表明抗酸性CGMCC 1.1190可能通過(guò)調(diào)控鞭毛蛋白的表達(dá)來(lái)增強(qiáng)運(yùn)動(dòng)能力，促進(jìn)生物被膜的形成，使其抗酸性增強(qiáng)。

3.4 抗酸性CGMCC 1.1190與雙組分系統(tǒng)相關(guān)蛋白的分析

雙組分系統(tǒng)（Two-Component System，TCS）是存在于細(xì)菌內(nèi)的一種信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)，與細(xì)菌的群體感應(yīng)、致病性、耐藥性、毒力因子表達(dá)和生物被膜生成等生物學(xué)功能密切相關(guān)，是細(xì)菌適應(yīng)環(huán)境變化并響應(yīng)多種刺激的一種調(diào)節(jié)機(jī)制[29]。TCS與細(xì)菌的群體感應(yīng)有關(guān)，群體感應(yīng)是細(xì)菌之間信號(hào)傳遞的重要機(jī)制，當(dāng)細(xì)胞密度增加達(dá)到一定閾值，細(xì)菌通過(guò)信號(hào)傳遞影響特定基因的表達(dá)，來(lái)調(diào)控微生物群體的生理特征[30]。何綠琴[31]通過(guò)構(gòu)建轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白（qseB）/感應(yīng)蛋白（qseC）缺失株，發(fā)現(xiàn)副豬嗜血桿菌生物膜生成能力降低，抵御不良環(huán)境能力減弱，毒力下降。雙組分系統(tǒng)組氨酸激酶?jìng)鞲械鞍祝╡nvZ）/DNA結(jié)合雙轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子（ompR）主要與細(xì)菌的滲透調(diào)節(jié)相關(guān)，通過(guò)對(duì)膜孔道蛋白進(jìn)行正向或負(fù)向的調(diào)控來(lái)影響膜內(nèi)外離子轉(zhuǎn)運(yùn)、平衡滲透壓力[32]。雙組分系統(tǒng)精氨酸脫亞胺酶（arcA）/鳥氨酸氨基甲酰轉(zhuǎn)移酶（arcB）對(duì)厭氧和需氧生長(zhǎng)下細(xì)菌的呼吸代謝、生物合成和運(yùn)動(dòng)能力有調(diào)控作用，主要影響菌體的能量代謝過(guò)程。武珊珊[33]研究發(fā)現(xiàn)沙門氏菌arcA/arcB缺失株對(duì)氨基糖苷類抗生素的抗性有所提高，但其引起的耐藥性變化的機(jī)理尚未闡明。本研究發(fā)現(xiàn)，抗酸性 CGMCC 1.1190雙組分系統(tǒng)病毒性傳感器組氨酸激酶（phoP）/病毒性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白（phoQ）、qseB/qseC、envZ/ompR的蛋白水平均上調(diào)，雙組分系統(tǒng)arcA/arcB蛋白水平下調(diào)，表明CGMCC 1.1190雙組分系統(tǒng)與其抗酸性調(diào)控具有密切關(guān)系。

3.5 抗酸性CGMCC 1.1190與ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)相關(guān)蛋白的分析

ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)相關(guān)蛋白是指含有ATP結(jié)合區(qū)域的蛋白，主要功能包括營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)和排出有害物質(zhì)等[34]。謝騰飛[35]研究發(fā)現(xiàn)，冷脅迫后的副溶血性弧菌通過(guò)抑制ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的量來(lái)保護(hù)菌體免于低溫?fù)p傷。MalEFGK是位于菌體內(nèi)膜上的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白復(fù)合體，麥芽糖/麥芽糊精導(dǎo)入ATP結(jié)合蛋白（malK）負(fù)責(zé)與運(yùn)輸系統(tǒng)的能量偶聯(lián)；麥芽糖/麥芽糊精運(yùn)輸系統(tǒng)滲透酶蛋白（malF）負(fù)責(zé)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)；麥芽糖/麥芽糊精結(jié)合周質(zhì)蛋白（malE）是麥芽糖攝取的關(guān)鍵，參與麥芽糖的ABC運(yùn)輸系統(tǒng)[36]。本研究發(fā)現(xiàn)，CGMCC 1.1190抗酸性菌株的菌體中構(gòu)成MalEFGK復(fù)合物的3種蛋白（malK、malF、malE）表達(dá)水平均下調(diào)，表明CGMCC 1.1190在酸脅迫后可能通過(guò)改變細(xì)胞膜的通透性和控制轉(zhuǎn)運(yùn)物質(zhì)來(lái)保護(hù)菌體、抵抗不良環(huán)境。

3.6 抗酸性CGMCC 1.1190與能量代謝相關(guān)蛋白的分析

微生物代謝需要的能量是菌體在酶的作用下通過(guò)其細(xì)胞內(nèi)一系列氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生的，微生物提供能量的途徑以三羧酸循環(huán)和糖酵解為主，能量代謝的正常進(jìn)行是保證菌體正常生長(zhǎng)的必要條件[37]。本研究探討CGMCC 1.1190抗酸性菌株的蛋白組，發(fā)現(xiàn)參與三羧酸循環(huán)的蛋白表達(dá)多上調(diào)，包括異檸檬酸脫氫酶（IcdA）、異檸檬酸裂解酶（aceA）、檸檬酸裂合酶（citG）等，表明CGMCC 1.1190菌體在適應(yīng)酸脅迫環(huán)境時(shí)消耗了大量能量來(lái)維持自身正常的生理代謝。本研究發(fā)現(xiàn)， 抗酸性CGMCC 1.1190丙酮酸分解代謝途徑的磷酸烯醇式丙酮酸碳羧化酶（PckA）活躍，說(shuō)明其分解產(chǎn)生了更多能量以維持酸脅迫下菌體細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，CGMCC 1.1190菌體內(nèi)氨基烷基膦酸酯N-乙酰轉(zhuǎn)移酶（phnO）上調(diào)，該路徑可以促進(jìn)CoA生成。有研究報(bào)道，當(dāng)生物體遭受外界脅迫作用，可以通過(guò)CoA激活體內(nèi)的免疫應(yīng)答來(lái)抵抗外部脅迫[38]。由此推測(cè)，酸脅迫下CGMCC 1.1190菌體內(nèi)的CoA的表達(dá)變化激活了菌體內(nèi)的應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致抗酸性增加。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)ITRAQ蛋白組技術(shù)對(duì)鼠傷寒沙門氏菌CGMCC 1.1190在經(jīng)檸檬酸調(diào)節(jié)pH為2.5的TSB基質(zhì)中進(jìn)行多次酸脅迫處理后的差異表達(dá)蛋白進(jìn)行研究，共檢測(cè)到2373個(gè)蛋白，其中195個(gè)差異蛋白，包括95個(gè)顯著下調(diào)蛋白和100個(gè)顯著上調(diào)蛋白。通過(guò)對(duì)CGMCC 1.1190菌株的差異蛋白進(jìn)行GO分析和KEGG分析，發(fā)現(xiàn)抗酸性菌株高表達(dá)應(yīng)激蛋白相關(guān)基因，可以通過(guò)合成一些應(yīng)答外界刺激的蛋白質(zhì)來(lái)幫助CGMCC 1.1190增強(qiáng)抗酸性；高表達(dá)細(xì)胞膜相關(guān)蛋白來(lái)增加CGMCC 1.1190菌體細(xì)胞膜的完整性；高表達(dá)鞭毛相關(guān)蛋白來(lái)增強(qiáng)CGMCC 1.1190菌體的運(yùn)動(dòng)能力和增加保護(hù)性生物被膜的形成；高表達(dá)雙組分系統(tǒng)相關(guān)蛋白來(lái)響應(yīng)酸信號(hào)，通過(guò)調(diào)控酸激蛋白的產(chǎn)生增強(qiáng)CGMCC 1.1190菌體的抗酸性；低表達(dá)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)相關(guān)蛋白來(lái)降低細(xì)胞膜對(duì)H+的通透性，達(dá)到保護(hù)菌體的作用；高表達(dá)能量代謝途徑相關(guān)蛋白來(lái)為CGMCC 1.1190菌體應(yīng)對(duì)酸脅迫提供能量、維持穩(wěn)態(tài)。綜上可知，CGMCC 1.1190在經(jīng)過(guò)pH2.5的檸檬酸脅迫，能通過(guò)蛋白水平的表達(dá)變化啟動(dòng)一系列應(yīng)答機(jī)制并生存下來(lái)。