王智敏，馬金伶,2，孫兆勇,2，石瑩瑩，李東炎，石晶盈,

（1.山東省高校食品加工技術(shù)與質(zhì)量控制重點實驗室，山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東泰安 271018；2.山東省濟寧市汶上縣人民政府，山東濟寧 272500）

甘薯中含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，包括多種必需氨基酸、維生素、膳食纖維等營養(yǎng)和功能成分[1-3]。但是，甘薯在采后貯藏過程中容易受病原微生物侵染造成腐爛損失，其中，由長喙殼菌（Ceratocystis fimbriata）侵染引起的甘薯黑斑病是主要的病害之一，長喙殼菌有很強的寄生能力，主要通過傷口侵染甘薯[4]，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失[5-6]。另外，由于甘薯喜溫，低溫貯藏會使甘薯發(fā)生冷害[7-8]，需要在12 ℃以上進行甘薯貯藏，但是此溫度下長喙殼菌仍然可以生長繁殖，因此，目前產(chǎn)業(yè)上多依賴化學(xué)殺菌劑如多菌靈等抑制黑斑病發(fā)生。但是，化學(xué)殺菌劑的長期使用會導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生抗藥性，容易造成環(huán)境污染和農(nóng)藥殘留等諸多問題[9-10]。生物防治憑借無毒無害、無污染且無抗藥性等優(yōu)點，被認(rèn)為是有望降低化學(xué)殺菌劑使用量或替代化學(xué)殺菌劑的有效方法[11-12]。

拮抗微生物的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對于果蔬采后病害控制有重要作用。綠葉假單胞菌（Pseudomonas adaceae）釋放的揮發(fā)性物質(zhì)中含有的3-甲基-1-丁醇、苯乙醇和2-甲基-1-丁醇能有效抑制甘薯黑斑病的菌絲生長和孢子萌發(fā)[13]。萎縮芽孢桿菌（Bacillus atrophaeus）HAB-5產(chǎn)生的烷烴、醇、酸等揮發(fā)性物質(zhì)，對炭疽菌有較高的抑制活性[14]。枯草芽孢桿菌（B. subtilis）CF-3的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物不僅能抑制褐腐菌的生長，而且還激活了桃果實的抗病相關(guān)酶，誘導(dǎo)果實提高抗病性[15]。因此，利用拮抗微生物產(chǎn)生的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物來抑制采后病害，成為采后病害生物防治領(lǐng)域的熱點。

本研究對前期從甘薯表面和甘薯種植的土壤中分離到兩株對甘薯黑斑病有較強抑制作用的菌株解淀粉芽孢桿菌JK和克雷伯氏桿菌GK進行抑菌性能分析[16]。通過熏蒸方法探究揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對甘薯的抑菌效果，通過氣相色譜-離子遷移譜（Gas chromatograph-ion mobility spectrometry，GC-IMS）和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（Gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技術(shù)對分離得到的兩株拮抗菌的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物組分進行分析鑒定，同時在平板上篩選出對黑斑病抑制作用較強的成分，旨在為甘薯黑斑病的防治提供新的拮抗菌株資源，為開發(fā)新型、安全的防腐保鮮劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）JK、克雷伯氏桿菌（Klebsiella pneumoniae）GK、長喙殼菌（Ceratocystis fimbriata） 均由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院果蔬采后貯藏保鮮實驗室分離、鑒定和保存；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）、牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基（NA）、牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基（NB），制備方法參照Liu等[17]；己醛（Hexanal）、2-己酮（2-Hexanone）、乙酸丙酯（Propyl acetate）、2-壬酮（2-Nonanone）、異辛醇（1-Hexanol, 2-ethyl-）、甲基壬基甲酮（2-Undecanone）、2,2,4-三甲基-1,3-戊二醇二異丁酸酯（2,2,4-Trimethyl-1,3-pentanediol diisobutyrate）濃度分別為97%、99.5%、99%、99%、99%、99%、98.5% 購于北京優(yōu)尼康生物科技有限公司和上海麥克林生化科技有限公司；甘薯品種為蘇薯8號采購于山東省泰安市岱岳區(qū)，挑選成熟度一致、大小均勻、果色良好、沒有病蟲害且無機械傷的新薯進行下一步實驗。

SJ-CJ-1D超凈工作臺 蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司；ZQTY-70F恒溫振蕩培養(yǎng)箱 上海知楚儀器有限公司；AL204電子天平 上海梅特勒-托利多儀器有限公司；EPED-E2-20TF實驗室級超純水器 南京易普易達(dá)科技發(fā)展有限公司；YXQ-LS-50S立式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅實業(yè)有限公司；8200氣相色譜-離子遷移譜（GC-IMS） 德國GAS公司；7010 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS） Agilent Technologies Inc。

1.2 實驗方法

1.2.1 拮抗菌菌液熏蒸對甘薯黑斑病病斑擴展抑制率的測定 將在NA平板上生長良好的兩株拮抗菌JK、GK分別接種到1000 mL NB培養(yǎng)基中，在28 ℃180 r/min下培養(yǎng)48 h后，分別將1000 mL菌液倒入容積為20 L的密封罐的隔板下層，對照為相同體積的無菌水，隔板上層放置10個甘薯，用凡士林密封罐蓋，熏蒸1 h。在熏蒸后的甘薯果實上用打孔器打直徑為1 cm，高度為1 cm的圓孔，每個甘薯的同一面每間隔7～8 cm打一個孔，每個甘薯打三個圓孔，去除圓孔中的甘薯表皮，分別立即接種5×105個孢子囊/mL的長喙殼菌孢子囊懸浮液20 μL[18]，對照組接種同上。每個處理重復(fù)三次，每次重復(fù)處理10個甘薯，實驗重復(fù)兩次。于28±1 ℃ RH 90%條件下保濕貯藏，每5 d測量一次病斑，計算病斑擴展抑制率。

抑制率（%）=（對照病斑直徑-處理病斑直徑）/對照病斑直徑×100

1.2.2 拮抗菌揮發(fā)性抑菌物質(zhì)的測定

1.2.2.1 拮抗菌揮發(fā)性代謝產(chǎn)物GC-IMS測定 樣品預(yù)處理：將JK和GK分別接種于100 mL NB液體培養(yǎng)基中，28 ℃ 180 r/min培養(yǎng)48 h后，分別吸取10 mL于20 mL頂空進樣瓶中，對照為相同體積的NB培養(yǎng)基，每個處理重復(fù)兩次，分別記作JK1、JK2，GK1、GK2，CK1、CK2。

GC-IMS條件：色譜柱型號FS-SE-54-CB-1（15 m×0.53 mm，1 μm），IMS溫度45 ℃，色譜柱溫度40 ℃，分析時間20 min，載氣/漂移器N2，離子化模式為正離子模式，以β射線（氚，3H）進行放射處理。

自動頂空進樣條件：進樣體積為300 μL，孵育時間 10 min，孵育溫度40 ℃，進樣針溫度45 ℃，孵化轉(zhuǎn)速500 r/min。載氣流速參照邵悅春等[19]設(shè)定，初始?xì)庀噍d氣流速為2 mL/min，保持2 min后，在10 min內(nèi)線性增至100 mL/min，在20 min內(nèi)線性增至150 mL/min。漂移氣流速為150 mL/min。

每組實驗均重復(fù)兩次，采用GC-IMS儀器配套的LAV（Laboratory Analytical Viewer）分析軟件對拮抗菌的揮發(fā)性氣味進行采集和分析，利用LAV中的Reporter插件對比樣品之間的譜圖差異，Gallery Plot插件構(gòu)建指紋圖譜，直觀對比樣品之間的譜圖差異，采用Dynamic PCA插件對樣品進行動態(tài)主成分分析。同時根據(jù)特征性物質(zhì)保留時間和遷移時間計算每種揮發(fā)性物質(zhì)的保留指數(shù)，通過GC-IMS Library Search中的NIST和IMS數(shù)據(jù)庫對揮發(fā)性代謝成分進行定性分析。

1.2.2.2 拮抗菌揮發(fā)性代謝產(chǎn)物GC-MS測定 采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜法（HS-SPME-GCMS）分離鑒定揮發(fā)性活性物質(zhì)的組分，并對平板抑菌活性進行跟蹤。將JK和GK分別接種于100 mL NB液體培養(yǎng)基中，28 ℃ 180 r/min培養(yǎng)48 h。將萃取頭在250 ℃進樣口老化30 min。50 ℃條件下預(yù)熱10 min后，分別用65 μm PDMS/DVB和75 μm PDMS萃取纖維頭對JK和GK揮發(fā)性物質(zhì)進行頂空吸附，吸附時間30 min[20]。氣相色譜色譜柱為Rtx-5MS 毛細(xì)管色譜柱（30.0 m×0.32 mm×0.25 μm），載氣為He，采用程序升溫的起始溫度為60 ℃，維持2 min，以5 ℃/min 的速率升溫至180 ℃，再以2 ℃/min的速率升溫至250 ℃，維持3 min，運行時間 64 min。質(zhì)譜條件為：電子轟擊離子源及四級桿質(zhì)量檢測器，離子源溫度為230 ℃，接口溫度為250 ℃，熱解析1 min，質(zhì)量掃描范圍45～500 m/z[21-22]。

每組實驗均重復(fù)兩次，色譜分離后，質(zhì)譜掃描每個色譜峰得到質(zhì)譜圖，所得質(zhì)譜信息經(jīng)計算機用標(biāo)準(zhǔn)NIST08質(zhì)譜圖數(shù)據(jù)庫確定香氣物質(zhì)組分種類。用色譜峰面積歸一化法進一步確定各物質(zhì)組分含量。

1.2.3 揮發(fā)性單物質(zhì)的抑菌作用分析 為驗證兩株拮抗菌產(chǎn)生的主要揮發(fā)性物質(zhì)對甘薯黑斑病病原菌的抑菌作用，通過分析兩株拮抗菌共同產(chǎn)生的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的測定結(jié)果（GC-IMS、GC-MS）以及結(jié)合各成分安全性分析和在食品中應(yīng)用現(xiàn)狀，選擇研究己醛（Hexanal）[23]、2-己酮（2-Hexanone）[24]、乙酸丙酯（Propyl acetate）[25]、2-壬酮（2-Nonanone）[26]，同時在GC-MS測定結(jié)果中選擇相對含量較高的物質(zhì)，并根據(jù)各成分安全性、實際應(yīng)用和購買情況，選擇研究異辛醇（1-Hexanol, 2-ethyl-）[27]、甲基壬基甲酮（2-Undecanone）[28]、2,2,4-三甲基-1,3-戊二醇二異丁酸酯（2,2,4-Trimethyl-1,3-pentanediol diisobutyrate）[29]，因此購買以上7種揮發(fā)性物質(zhì)純品分析其對病原菌的抑制情況，平板對扣法對揮發(fā)性物質(zhì)進行抑菌效果的檢測。在NA平板培養(yǎng)基中央放置直徑為5 mm的無菌濾紙片，分別滴加20 μL的七種物質(zhì)（對照不滴加試劑），迅速與放置有直徑8 mm甘薯長喙殼菌菌餅的PDA平板培養(yǎng)基對扣，封口膜密封。每個處理重復(fù)三次。28 ℃下培養(yǎng)96 h，每天觀察并測量病原菌的菌落直徑，并計算抑菌率[30-31]。

1.2.4 揮發(fā)性混合物質(zhì)的抑菌作用分析 將對甘薯黑斑病病原菌有較強抑菌作用的揮發(fā)性物質(zhì)己醛和2-壬酮按照1:1比例混合。在PDA平板培養(yǎng)基上放置直徑為8 mm的甘薯長喙殼菌菌餅，在另一個NA平板培養(yǎng)基上放置直徑5 mm的無菌濾紙片，分別滴加50 μL不同濃度的揮發(fā)性混合物質(zhì)，濃度設(shè)定為0、100、200、1000 μL/L，將兩平板對扣，封口膜密封，28 ℃下培養(yǎng)72 h，每天觀察并測量病原菌的菌落直徑，每個處理三個重復(fù)，試驗重復(fù)兩次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Microsoft Excel 2013整理試驗數(shù)據(jù)，用SigmaPlot 13.0軟件作圖、計算均值及標(biāo)準(zhǔn)偏差。采用IBM SPSS Statistics 20.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，用Duncan” s新復(fù)極差法進行顯著性（P＜0.05）水平檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌菌液熏蒸對甘薯黑斑病病斑擴展的影響

如圖1所示，經(jīng)菌株JK和GK發(fā)酵液熏蒸處理后甘薯黑斑病發(fā)病時間明顯晚于對照，其中，拮抗菌JK發(fā)酵液熏蒸處理的薯塊對病斑的擴展有較強的抑制作用，在處理薯塊15 d后，病斑擴展的抑制率達(dá)61.29%；拮抗菌GK發(fā)酵液熏蒸薯塊15 d后，病斑擴展的抑制達(dá)54.84%。表明兩種拮抗菌菌液中含有抑制甘薯黑斑病的揮發(fā)性代謝成分，且顯著（P＜0.05）抑制病原菌的生長。同時大量研究也表明，細(xì)菌發(fā)酵過程中產(chǎn)生的揮發(fā)性成分對病原菌具有抑制作用[13-15]。如Xu等[32]研究表明用Bacillus tequilensisXK29的發(fā)酵液熏蒸甘薯后，對于甘薯黑斑病有明顯的抑制作用，與本試驗結(jié)果一致。

圖1 菌株JK及GK揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對甘薯黑斑病病斑擴展的影響Fig.1 Effects of volatile metabolites of strain JK and GK on disease development of black spot inoculated with C. fimbriata

2.2 拮抗菌揮發(fā)性抑菌物質(zhì)的鑒定結(jié)果

2.2.1 GC-IMS測定的拮抗菌揮發(fā)性代謝產(chǎn)物

2.2.1.1 兩種拮抗菌揮發(fā)性代謝產(chǎn)物差異變化 三組樣品的GC-IMS譜圖如圖2所示，整個圖背景為藍(lán)色，橫坐標(biāo)1.0處紅色豎線為RIP峰（反應(yīng)離子峰，經(jīng)歸一化處理），RIP峰兩側(cè)的每一個點代表一種揮發(fā)性有機物。其中顏色代表物質(zhì)的濃度，白色表示濃度較低，紅色表示濃度較高，顏色越深表示濃度越大，點越大顏色越深表明峰信號越強?？傮w來說，兩種拮抗菌的揮發(fā)性有機物的遷移時間大都集中在1.0～1.5 ms區(qū)間內(nèi)，保留時間在100～300 s區(qū)間，兩種樣品的揮發(fā)性有機物在氣相保留時間300 s內(nèi)完成了GC-IMS分離。

圖2 三組樣品氣相色譜離子遷移譜譜圖Fig.2 GC-IMS of three groups of samples

為了進一步比較不同樣品的差異，選取空白NB培養(yǎng)基CK對照為背景參照，其他樣品的譜圖扣減參比，若兩種拮抗菌揮發(fā)性代謝產(chǎn)物一致，則扣減后的背景為白色；若濃度高于參比，則扣減后的背景為紅色；若濃度低于參比，則扣減后的背景為藍(lán)色。從圖3可以看出以空白培養(yǎng)基作參比時，JK和GK譜圖中的背景顏色為藍(lán)色，表明揮發(fā)性有機物含量均比培養(yǎng)基中的揮發(fā)性有機物少，為更好比較揮發(fā)性有機物的變化情況，框選這些揮發(fā)性有機物的峰，形成樣品指紋圖譜進行對比。

圖3 三組樣品氣相色譜離子遷移譜差異圖Fig.3 Difference diagram of GC-IMS of three groups of samples

2.2.1.2 兩種拮抗菌中揮發(fā)性有機物指紋圖譜對比

由圖4和表1所示，區(qū)域A1中標(biāo)出的物質(zhì)正辛醇（1-Octanol）、甲基環(huán)戊烯醇酮（2-Cyclopenten-1-one-2-hydroxy-3-methyl）、羥基丙酮（Hydroxyacetone）、3-甲基丁醛（3-Methylbutanal）、2-辛酮（2-Octanone）、糠醇（2-Furanmethanol）、4-羥基丁酸內(nèi)酯（Gammabutyrolactone）、2-甲基吡嗪（2-Methylpyrazine）、3-甲基-3-丁烯-1-醇（3-Methyl-3-buten-1-ol）、2-甲基丁酸甲酯（Methyl-2-methylbutanoate）、2-甲基丙醛（2-Methylpropanal）等物質(zhì)僅在培養(yǎng)中存在，在兩株拮抗菌中未發(fā)現(xiàn)，可作為培養(yǎng)基的特征標(biāo)記物，原因可能是被拮抗菌作為營養(yǎng)物質(zhì)在生長過程中被消耗，或者是拮抗菌生長抑制這些物質(zhì)的揮發(fā)。區(qū)域A2中標(biāo)出的1、8、9、27、32、36（未定性出）等物質(zhì)在培養(yǎng)基中含量最高，在兩株拮抗菌中含量較少。區(qū)域B標(biāo)出的物質(zhì)在培養(yǎng)基中未發(fā)現(xiàn)，在兩株拮抗菌中存在，但含量不同。區(qū)域C中物質(zhì)為JK的特征揮發(fā)性有機物，如丁酸（Butanoic acid）、異戊醇（Isoamyl alcohol）、3-甲基-1-丁醇（3-Methyl-1-butanol）等，在培養(yǎng)基和GK中均未發(fā)現(xiàn)。區(qū)域D中標(biāo)出的物質(zhì)如乙酸丙酯（Propyl acetate）、2-己酮（2-Hexanone）、己醛（Hexanal）在GK中含量高于對照和JK菌株。由于有些物質(zhì)在GC-IMS數(shù)據(jù)庫中未能定性，所以有必要結(jié)合GC-MS進行定性。

圖4 通過GC-IMS檢測出的兩種拮抗菌中揮發(fā)性有機物指紋圖譜對比Fig.4 Comparison of fingerprints of volatile organic compounds from two antagonistic bacteria by GC-IMS

表1 兩種拮抗菌及NB培養(yǎng)基揮發(fā)性有機物定性分析Table 1 Qualitative analysis of volatile organic compounds in two antagonistic and Nutrient Broth

2.2.1.3 兩種拮抗菌中揮發(fā)性有機物指紋圖譜主成分分析 根據(jù)圖4構(gòu)建的兩種拮抗菌揮發(fā)性產(chǎn)物指紋圖譜，采用Dynamic PCA插件進行PCA處理，比較2種拮抗菌揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的差異，如圖5所示，培養(yǎng)基和兩種拮抗菌分據(jù)PCA圖的兩側(cè)，區(qū)分非常明顯，兩種拮抗菌差異區(qū)分亦非常明顯，分據(jù)PCA兩端。

圖5 兩種拮抗菌和NB培養(yǎng)基所產(chǎn)揮發(fā)性成分的PCAFig.5 PCA of the volatile compounds from the two antagonistic bacteria and Nutrient Broth

2.2.2 GC-MS測定的拮抗菌揮發(fā)性代謝產(chǎn)物 如表2所示，在 GC-MS分析后，對測得的每種化合物依據(jù)NIST標(biāo)準(zhǔn)譜庫對比及相對保留值進行定性，去除對照組中含有的物質(zhì)后，JK和GK所產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)分別為17和9種（其中兩種萃取頭測定出的相同物質(zhì)，以峰面積大的萃取頭為準(zhǔn)），屬于酮類、烷類、醇類、酯類、醛類等物質(zhì)，這與Rajaofera等[14]的報道一致，萎縮芽孢桿菌HAB-5發(fā)酵產(chǎn)生的揮發(fā)性有機化合物也主要包括烷烴、烯烴、醇類和有機酸。其中十四甲基六硅氧烷（Hexasiloxane, tetradecamethyl-）和2-壬酮（2-Nonanone）是菌株JK和GK揮發(fā)性代謝產(chǎn)物中共有的物質(zhì)，峰面積分別為3.98%和1.22%。

表2 菌株JK和GK揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的主要成分及相對含量Table 2 Relative content of main volatile components of strain JK and GK

2.3 揮發(fā)性單物質(zhì)的抑菌作用

如表3所示，七種物質(zhì)中異辛醇（1-Hexanol, 2-ethyl-）對病原菌的抑制率最高，能完全抑制病原菌的生長，己醛（Hexanal）、2-壬酮（2-Nonanone）和2,2,4-三甲基-1,3-戊二醇二異丁酸酯（2,2,4-Trimethyl-1,3-pentanediol diisobutyrate）的抑菌率分別為93.15%、81.19%和58.62%，對病原菌的抑制效果較好，但是2-己酮（2-Hexanone）、甲基壬基甲酮（2-Undecanone）和乙酸丙酯（Propyl acetate）抑菌作用較弱。

表3 七種揮發(fā)性單物質(zhì)對甘薯黑斑病病原菌的抑制作用Table 3 Antifungal activity of seven compounds against C. fimbriata

2.4 揮發(fā)性混合物質(zhì)的抑菌作用

異辛醇（1-Hexanol, 2-ethyl-）能完全抑制甘薯黑斑病病原菌的生長，其次是己醛（Hexanal）和2-壬酮（2-Nonanone）?？紤]到己醛和2-壬酮的安全性高，常被用作食品添加劑，同時在果蔬病害的防治上已有明顯的效果。此前有研究者發(fā)現(xiàn)用己醛熏蒸香蕉果實后，在800 ppm濃度下，香蕉果實的炭疽菌和焦腐病菌兩種病原菌的菌絲生長被完全抑制[23]。同時Romina等[26]發(fā)現(xiàn)2-壬酮能明顯抑制灰霉病菌的生長。因此結(jié)合安全性和實際應(yīng)用效果選擇將己醛和2-壬酮兩者混合后探究其抑菌效果。如圖6所示，當(dāng)混合液濃度為100、200、1000 μL/L時對甘薯黑斑病病原菌的生長均有很強的抑制作用。在培養(yǎng)72 h后，100 μL/L的混合物濃度抑菌率達(dá)到70%，濃度為200 μL/L時，菌斑直徑不再增加，病原菌停止生長。

圖6 不同濃度的混合揮發(fā)性物質(zhì)對甘薯黑斑病病原菌生長的影響Fig.6 Inhibition of different concentrations of the artificial mixture of volatile metabolites on the growth of C. fimbriata

3 討論與結(jié)論

與化學(xué)殺菌劑相比較，生物防治被認(rèn)為是一種安全高效的防治手段。Bu等[33]發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌L1-21對番茄的灰霉病有明顯的抑制作用。Mu等[34]的研究結(jié)果表明，從土壤中分離到的萎縮芽孢桿菌J-1可以有效控制蘋果輪紋病。本研究從甘薯表面及甘薯地土壤中分離到兩株對甘薯黑斑病有較強抑制作用的菌株解淀粉芽孢桿菌JK和克雷伯氏桿菌GK，可產(chǎn)生揮發(fā)性抑菌成分。

許多研究發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物能夠作用于果蔬，抑制病原菌的生長，延緩果蔬發(fā)病。Zhang等[35]發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌ZD01發(fā)酵產(chǎn)生的6-甲基-庚酮對馬鈴薯上的茄鏈格孢菌有明顯抑制作用。Xu等[32]發(fā)現(xiàn)特基拉芽孢桿菌發(fā)酵能產(chǎn)生21中揮發(fā)性化合物，其中異戊酸、異丁酸和2-甲基丁酸能有效抑制甘薯長喙殼菌的生長。本研究分別用JK和GK發(fā)酵液熏蒸處理甘薯果實后，發(fā)現(xiàn)熏蒸后出現(xiàn)病斑的時間晚于對照，同時期內(nèi)病斑直徑顯著小于對照，說明兩株拮抗菌發(fā)酵其產(chǎn)生的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物可有效的抑制黑斑病，延緩甘薯薯塊發(fā)病。通過GC-IMS和GC-MS對菌株JK和GK的揮發(fā)性物質(zhì)進行檢測，發(fā)現(xiàn)揮發(fā)性物質(zhì)主要有酮類、烷類、醇類、酯類、醛類等物質(zhì)。經(jīng)過平板抑菌實驗發(fā)現(xiàn)己醛、2-壬酮、異辛醇和2,2,4-三甲基-1,3-戊二醇二異丁酸酯是抑制黑斑病的主要氣體成分，己醛和2-壬酮對黑斑病的抑制率分別為93.15%和81.19%，將兩者按照1:1的比例混合后，混合液濃度為100 μL/L時，對甘薯黑斑病病原菌菌絲生長的抑制率達(dá)到70%，濃度高于200 μL/L時，菌絲停止生長。

芽孢桿菌在發(fā)酵過程中除了可以產(chǎn)生具有抑菌作用的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物之外，發(fā)酵液中的代謝產(chǎn)物對病原菌也有抑制作用。汪靜杰等[36]研究發(fā)現(xiàn)篩選到的拮抗菌株解淀粉芽孢桿菌的發(fā)酵濾液中含有明顯抑制球孢白僵菌的物質(zhì)，經(jīng)提取鑒定后，確定有效成分為芬枯草菌素和伊枯草菌素。Zhang等[37]發(fā)現(xiàn)從番茄根際中分離到的解淀粉芽孢桿菌對多種植物病原菌有廣譜抑菌性，鑒定抑菌物質(zhì)為伊枯草素和芬枯草菌素，說明發(fā)酵菌液中含有能抑制真菌生長的物質(zhì)。因此在后續(xù)研究中可以對分離到的兩株拮抗菌中的活性物質(zhì)進行進一步研究。

本研究中的兩株拮抗菌生長所需營養(yǎng)簡單，繁殖速度快，產(chǎn)生的揮發(fā)代謝產(chǎn)物對于黑斑病有較強的抑制效果，在甘薯采后病害控制中有一定的應(yīng)用前景，為減少化學(xué)殺菌劑的使用提供了新途徑。