石長(zhǎng)波，孫昕萌，趙鉅陽(yáng)，袁惠萍，梁昌謀

（哈爾濱商業(yè)大學(xué)旅游烹飪學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030）

大豆分離蛋白（Soybean Protein Isolate，SPI）是一種優(yōu)質(zhì)的植物蛋白，具有來(lái)源廣泛、價(jià)格低廉且營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)具有可降解、熱穩(wěn)定、無(wú)污染、綠色環(huán)保等優(yōu)良性能。商用SPI通常高溫噴霧干燥生產(chǎn)，這會(huì)引起SPI一定程度的變性和聚集，從而使溶解性等功能性質(zhì)降低，限制了SPI在食品工業(yè)中的應(yīng)用[1]。因此，為了保持或改善噴霧干燥后大豆分離蛋白的功能特性，可以嘗試噴霧干燥前在料液中添加外源物降低噴霧干燥引起的熱變性或者抑制熱聚集[2]。有研究表明，在不使用有機(jī)溶劑的情況下，多酚的加入可防止乳鐵蛋白的熱聚集[3]。Yan等[4]研究了預(yù)熱處理對(duì)多酚-樟子仁分離蛋白結(jié)構(gòu)和功能特性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)加入了多酚后蛋白質(zhì)的聚集程度降低，并且乳化性增強(qiáng)。Liu等[5]發(fā)現(xiàn)酚類化合物中的羥基基團(tuán)可以與蛋白質(zhì)中的游離氨基和色氨酸等發(fā)生反應(yīng)，二者之間的相互作用有助于提高蛋白質(zhì)的變性溫度，從而抑制熱處理中蛋白質(zhì)的聚集。

兒茶素是一種黃酮類多酚化合物[6]，其羥基含量高并且具有多個(gè)適合蛋白質(zhì)結(jié)合的反應(yīng)位點(diǎn)，大量研究已表明SPI側(cè)鏈中的氨基和巰基能夠與兒茶素的酚羥基結(jié)合形成氫鍵，并且蛋白質(zhì)上的某些氨基酸基團(tuán)或殘基也會(huì)和兒茶素的酚羥基或者苯環(huán)結(jié)合形成離子鍵、疏水作用、范德華力等[7]，進(jìn)而改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能特性，進(jìn)一步研究也發(fā)現(xiàn)通過(guò)引入兒茶素可以干預(yù)蛋白質(zhì)熱誘導(dǎo)聚集，并提高其某種功能性和生物活性。Wang等[7]將兒茶素與熱處理后的α-乳清蛋白復(fù)合，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兒茶素的加入提高了α-乳清蛋白的變性溫度，并增強(qiáng)了α-乳清蛋白的抗氧化和乳化活性。Zhou等[8]發(fā)現(xiàn)將兒茶素與冷凍干燥的大豆分離蛋白復(fù)合后，蛋白質(zhì)的抗氧化性和熱穩(wěn)定性增加，并且提高了蛋白的消化率。

盡管目前關(guān)于蛋白質(zhì)與多酚相互作用的研究較多，但多針對(duì)于實(shí)驗(yàn)室條件下制備的冷凍干燥的蛋白質(zhì)，而在實(shí)際加工中SPI往往通過(guò)噴霧干燥技術(shù)制備，而關(guān)于噴霧干燥條件下大豆分離蛋白與兒茶素結(jié)合的研究較少，多酚與SPI相互作用后是否會(huì)受噴霧干燥的影響還尚不明確，通過(guò)兒茶素干預(yù)SPI噴霧干燥過(guò)程中的熱聚集行為這一設(shè)想也有待驗(yàn)證，基于此本研究系統(tǒng)探究了噴霧干燥條件下兒茶素與SPI復(fù)合物的形成機(jī)制，以及兒茶素對(duì)SPI的結(jié)構(gòu)（表面疏水性、巰基含量）包括結(jié)合親和力的變化規(guī)律。通過(guò)對(duì)兒茶素-大豆分離蛋白復(fù)合物結(jié)構(gòu)和功能特性的變化規(guī)律的探究，以期為兒茶素與大豆分離蛋白的復(fù)合提供理論依據(jù)，擴(kuò)大其應(yīng)用領(lǐng)域。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆分離蛋白 實(shí)驗(yàn)室自制；兒茶素 合肥博美生物公司；色拉油 市售；鹽酸、無(wú)水乙醇、氫氧化鈉、二硫蘇糖醇、鹽酸胍、氯化鈉、胃蛋白酶（酶活1:3000）、胰酶（酶活1:4000）、胰脂肪酶（酶活1:30000）、膽鹽（純度≥60%）、二水氯化鈣、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉 阿拉丁試劑公司；其他化學(xué)試劑均為分析純。

LS55熒光分析儀 珀金埃爾默股份有限公司；TMS-Touch 250N質(zhì)構(gòu)儀 美國(guó)Food Technology Corporation；H-PTD20流變儀 奧地利安東帕有限公司；L535-1型離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大豆分離蛋白的提取及復(fù)合物的制備 參考Zheng等[9]的制備方法。將400 g豆粕溶于6 L蒸餾水中，充分溶解后將溶液pH調(diào)為7.8。攪拌2 h后離心（8000×g，20 min），取離心后的上清液用2 mol/L HCl將溶液pH調(diào)至4.5，再次離心（8000×g，10 min），用5倍體積蒸餾水將沉淀溶解，攪拌均勻后離心（8000×g，10 min），取離心后的沉淀加入適量蒸餾水，并將溶液pH調(diào)至7.0，此時(shí)得到SPI溶液。

根據(jù)前期研究結(jié)果，將兒茶素按照大豆分離蛋白質(zhì)量濃度的0.25%、0.5%、0.75%、1%、1.25%、1.5%、1.75%比例添加到SPI溶液中，并將此溶液在25 ℃下攪拌24 h后，于4 ℃在磷酸鹽緩沖溶液中透析（截留分子量為8000～14000 kDa）48 h，此時(shí)得到兒茶素-大豆分離蛋白復(fù)合物溶液。為模擬SPI商業(yè)熱加工條件，復(fù)合后的溶液進(jìn)行噴霧干燥處理，制備不同結(jié)合親和力的熱誘導(dǎo)復(fù)合物干燥樣品。其中噴霧干燥條件參考Chen等[10]并做適當(dāng)改動(dòng)，進(jìn)風(fēng)溫度根據(jù)前期研究結(jié)果設(shè)置為170 ℃，料液流速3.5 mL/min，所有干燥樣品備用待測(cè)。

1.2.2 兒茶素/大豆分離蛋白復(fù)合物結(jié)合親和力的測(cè)定 參考劉雅云[11]多酚荷載率和裝載含量的測(cè)定方法并做適當(dāng)修改。大豆分離蛋白包埋兒茶素比率（荷載率）通過(guò)公式計(jì)算：

式中：未結(jié)合的兒茶素是指復(fù)合物經(jīng)過(guò)離心后（8818×g，20 min）沉淀中兒茶素的含量（mg）。取離心后沉淀部分加入無(wú)水乙醇將其溶解，再次離心（8818×g，20 min）后，測(cè)定上清液在280 nm處的吸光值，兒茶素的具體含量由標(biāo)準(zhǔn)曲線換算。此外大豆分離蛋白與兒茶素復(fù)合物裝載兒茶素的含量（裝載量）通過(guò)下公式計(jì)算：

式中：包埋兒茶素的含量指大豆分離蛋白結(jié)合兒茶素的含量（mg），加入大豆分離蛋白的含量根據(jù)雙縮脲法進(jìn)行測(cè)定，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出具體含量（g）。

1.2.3 表面疏水性（H0）的測(cè)定 按照J(rèn)iang等[12]的方法，使用8-苯氨基-奈酚-磺酸（ANS）對(duì)SPI和兒茶素-大豆分離蛋白復(fù)合物（SPI-C）的表面疏水性進(jìn)行檢測(cè)。用10 mmol/L，pH7.0 的磷酸鹽緩沖溶液配制不同質(zhì)量比的SPI-C復(fù)合物，將樣品溶液置于10000×g下離心30 min，取2 mL濃度為0.1 mg/mL的樣品溶液與20 μL濃度為8 mmol/L的ANS混合。激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為390、468 nm，狹縫寬度設(shè)為5 nm，掃描速度設(shè)置為10 nm/s，在以上參數(shù)下記錄熒光強(qiáng)度。H0為熒光強(qiáng)度與蛋白質(zhì)濃度的比值。

1.2.4 巰基含量的測(cè)定 按照Ellman[13]的方法稍作改動(dòng)。將0.04 mL Ellman試劑、5 mL Tris-甘氨酸緩沖液和1 mL樣品溶液混合均勻，40 ℃下保溫25 min，在412 nm下測(cè)量溶液的吸光值。以含有Ellman的Tris-甘氨酸緩沖液作為空白對(duì)照。每克蛋白含有的游離巰基的量（μmol）通過(guò)下列公式計(jì)算：

式中：73.53=106/1.36×104，1.36×104為摩爾消光系數(shù)；CSPI為樣品中蛋白質(zhì)的濃度（mg/mL）。

1.2.5 溶解性的測(cè)定 參考Stübler等[14]的方法，將蛋白質(zhì)濃度為2 mg/mL的SPI和SPI-C溶解于pH 6.25的磷酸鹽緩沖液中，然后于5000×g、4 °C下離心15 min，蛋白質(zhì)溶解度的計(jì)算方法為：

1.2.6 乳化性及乳化穩(wěn)定性的測(cè)定 參考祝鋼等[15]的方法。將樣品蛋白質(zhì)濃度配制成10 mg/mL，然后取9 mL的樣品溶液加入3 mL大豆油（即二者的比例為3:1），高速勻漿器10000 r/min攪打1 min后待測(cè)備用。從制備好的乳狀液底部取100 μL，再加入濃度為0.1%的SDS溶液10 mL，二者混勻后在500 nm處測(cè)吸光值，用SDS溶液做空白。10 min后再次取溶液進(jìn)行測(cè)定。乳化性及乳化穩(wěn)定性分別按下式計(jì)算：

1.2.7 凝膠性的測(cè)定 參考蔡劭愷[16]的方法稍作修改。將各組樣品溶液配為蛋白濃度為12%的溶液，20 ℃下磁力攪拌器混勻攪拌30 min，之后于90 ℃水浴加熱30 min，冷卻后放置于4 ℃冰箱中貯藏12 h。樣品在室溫下放置30 min后再質(zhì)構(gòu)儀測(cè)定所需參數(shù)。選用P/0.5的探頭，以穿刺模式進(jìn)行測(cè)定，測(cè)前速度：60 mm/min，測(cè)試速度：200 mm/min，測(cè)后速度：600 mm/min，記錄測(cè)試峰的頂點(diǎn)，即為測(cè)定凝膠的硬度（N）。

1.2.8 參與形成凝膠作用力的測(cè)定 凝膠的分子間作用力測(cè)定方法參考Sun等[17]的方法并做適當(dāng)改動(dòng)。凝膠溶解度被用來(lái)檢測(cè)穩(wěn)定蛋白凝膠結(jié)構(gòu)的分子間作用力。按照1.2.5的方法制備不含任何變性劑的蛋白凝膠。根據(jù)檢測(cè)需要，配制以下三種凝膠溶解液：含0.7 mol/L的NaCl；6 mol/L鹽酸胍（GuHCl）；10 mol/L二硫蘇糖醇（DTT）分別溶解在含50 mmol/L PBS中（pH6.25）。分別將1 g凝膠溶解在上述三種凝膠溶解液中，在80 ℃下水浴加熱3 h，冷卻后離心15 min（4 ℃、10000×g），取上清液測(cè)蛋白質(zhì)含量，計(jì)算出凝膠溶解度。

1.2.9 流變特性分析 參考賈娜等[18]方法稍有改動(dòng)。將SPI以及SPI-C溶液均勻涂抹在測(cè)試平臺(tái)上，除去氣泡。將測(cè)試頻率調(diào)整為0.2 Hz，應(yīng)變力設(shè)置為2%，初始和終止溫度分別設(shè)為30、90 ℃，升溫速率設(shè)為4 ℃/min。測(cè)定指標(biāo)為流變的彈性模量G” 。

1.2.10 原子力顯微鏡（AFM）分析 參考李穎暢等[19]的方法略做修改，將SPI和SPI-C溶液稀釋至濃度為 20 μg/mL，然后吸取 4 μL溶液，涂在載玻片上。放置于載物臺(tái)進(jìn)行觀察，采用輕敲模式。

1.2.11 體外消化模擬實(shí)驗(yàn)

1.2.11.1 模擬消化液的配制 參照Menezes等[20]的方法稍作修改，建立胃-小腸兩步連續(xù)消化模型。

胃液：2 g/L 氯化鈉、7 mL/L 濃鹽酸和9600 U/L胃蛋白酶混合，并調(diào)節(jié)溶液pH為1.2；

腸液：分別取膽鹽3.75 g用去離子水定容至50 mL；胰蛋白酶514.29 U/mL、胰酶68.57 U/mL。

電解質(zhì)溶液：分別取1.101 g 二水氯化鈣、6.561 g氯化鈉，用去離子水定容至30 mL。

1.2.11.2 體外連續(xù)消化 將冷凍干燥的天然SPI、噴霧干燥的天然SPI和各濃度下兒茶素-SPI復(fù)合物（兒茶素添加量分別為0.25%、0.5%、0.75%、1%、1.25%、1.5%、1.75%）樣品分別與模擬胃液、腸液于37 ℃水浴保溫10 min后，取等體積相應(yīng)的樣品溶液與模擬胃液置于離心管內(nèi)，用1.0 mol/L NaOH將混合物pH調(diào)至2.0，置于37 ℃以100 r/min水浴振蕩，分別取反應(yīng)時(shí)間為0、30、60、90和120 min的消化產(chǎn)物置于試管中，立即于100 ℃煮沸滅菌，冷卻備用。后將離心管溶液pH調(diào)至6.8，取胃消化后的溶液30 mL，分別加入1.5 mL電解質(zhì)溶液、2.5 mL膽鹽溶液和3.5 mL酶溶液（胰蛋白酶和胰酶分別為514.29、68.57 U/mL），并用1.0 mol/L NaOH將溶液pH調(diào)至7.0，將離心管置于37 ℃水浴搖床中，分別取反應(yīng)時(shí)間為150、180、210和240 min的消化產(chǎn)物于試管中，冷卻備用。

體外消化率的計(jì)算公式如下：

式中： C0為消化前的總蛋白含量，mg/mL； C1為消化后的蛋白含量，mg/mL。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行樣品，結(jié)果采用平均數(shù)±SD表示。數(shù)據(jù)分析采用Statistix 8.1分析差異顯著性。采用Sigmaplot 12.5軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 兒茶素添加量對(duì)兒茶素/大豆分離蛋白結(jié)合情況的影響

兒茶素荷載率以及裝載含量見圖1和圖2。由圖1可知，隨著兒茶素添加量的增加，SPI-C對(duì)兒茶素的載荷率呈先上升后趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)，說(shuō)明隨著兒茶素濃度的增加，二者相互作用程度逐步增強(qiáng)，表明SPI-C復(fù)合物的結(jié)合程度增加。推測(cè)的原因可能是SPI的空間結(jié)構(gòu)在噴霧干燥的過(guò)程中展開，導(dǎo)致兒茶素與暴露出來(lái)的疏水基團(tuán)結(jié)合，從而降低了SPI表面疏水性，提高了二者的結(jié)合程度[21]。Chen等[22]的研究也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)論。且由圖2兒茶素裝載含量的變化趨勢(shì)可知，兒茶素添加量為0.25%～1.75%時(shí)，其添加量與兒茶素裝載含量呈正相關(guān)。

圖1 不同兒茶素添加量與SPI相互作用對(duì)兒茶素荷載率的影響Fig.1 Effects of the interaction between different amounts of catechins and SPI on the entrapment rate of catechins

圖2 不同兒茶素添加量對(duì)SPI裝載兒茶素含量的影響Fig.2 Effects of different catechin levels on the catechin content of SPI loading

2.2 兒茶素添加量對(duì)大豆分離蛋白表面疏水性（H0）的影響

兒茶素對(duì)大豆分離蛋白表面疏水性的影響如圖3所示。表面疏水性（H0）是蛋白質(zhì)的重要特性之一，在維持蛋白質(zhì)穩(wěn)定性和生物活性方面起著重要作用[23]。H0是衡量SPI分子表面疏水基團(tuán)數(shù)目的重要指標(biāo)，也是影響分子間相互作用的主要因素之一。由圖3可知，隨著兒茶素添加量的增加，溶液中表面疏水性的逐漸降低后趨于穩(wěn)定，這與荷載率的趨勢(shì)相反。蛋白質(zhì)的表面疏水性下降原因是兒茶素中所含的羥基屬于親水基團(tuán)，羥基的存在能夠使蛋白質(zhì)的表面疏水性降低[24]。另一方面，在噴霧干燥過(guò)程中兒茶素可與蛋白質(zhì)暴露的疏水氨基酸殘基結(jié)合[25]，從而減少ANS的結(jié)合位點(diǎn)，降低了表面疏水性。Li等[26]發(fā)現(xiàn)原花青素的添加會(huì)導(dǎo)致乳鐵蛋白的疏水性降低，起泡性增強(qiáng)。

圖3 兒茶素添加量對(duì)表面疏水性的影響Fig.3 Effects of catechin addition on surface hydrophobicity

蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)熱誘導(dǎo)后，暴露出埋在蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水基團(tuán)[27]，促進(jìn)了酚苯環(huán)與蛋白質(zhì)芳香側(cè)鏈的疏水結(jié)合[24]，使得表面疏水性降低。此外，研究也表明熱處理會(huì)使蛋白質(zhì)展開或者部分展開、聚集、分子柔韌性和疏水-親水平衡發(fā)生變化，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的功能特性[24]。

2.3 兒茶素添加量對(duì)大豆分離蛋白游離巰基含量的影響

兒茶素添加量對(duì)游離巰基含量的影響如圖4所示。巰基基團(tuán)是指蛋白質(zhì)表面可與Ellman試劑反應(yīng)的巰基。通常，有關(guān)巰基的化學(xué)反應(yīng)涉及多種食品質(zhì)量指標(biāo)。由圖4可以發(fā)現(xiàn)隨著兒茶素添加量的增加，SPI-C復(fù)合體系中巰基的含量逐漸下降，這是因?yàn)閮翰杷氐牧u基能夠與SPI中的巰基結(jié)合。并且隨著兒茶素添加量的進(jìn)一步增加，可與SPI巰基結(jié)合的羥基基團(tuán)逐漸增多，進(jìn)而蛋白質(zhì)的巰基含量逐漸減少[28]。曹艷蕓[29]的研究也得到類似結(jié)論，乳清蛋白的巰基含量在添加兒茶素后降低。此外，熱處理會(huì)加強(qiáng)巰基-二硫鍵之間的交換反應(yīng)[4]，而兒茶素的存在，導(dǎo)致分子內(nèi)的二硫鍵含量增多，蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)分子間的二硫鍵減少[21]，從而推測(cè)兒茶素能夠干預(yù)蛋白質(zhì)的熱聚集。

圖4 兒茶素添加量對(duì)巰基含量的影響Fig.4 Effects of catechin addition on sulfhydryl content

2.4 兒茶素添加量對(duì)大豆分離蛋白溶解性的影響

兒茶素添加量對(duì)溶解性的影響如圖5所示。蛋白質(zhì)的溶解度決定了其在食品工業(yè)中的應(yīng)用，蛋白質(zhì)的高蛋白溶解度有利于改善其加工性能并擴(kuò)大其應(yīng)用范圍[30]。王孟云等[31]研究發(fā)現(xiàn)SPI未經(jīng)噴霧干燥前溶解性約為88.74%，然而如圖5兒茶素對(duì)大豆分離蛋白溶解性的影響所示，本研究經(jīng)過(guò)噴霧干燥后的SPI溶解性降低至69.90%，說(shuō)明噴霧干燥處理會(huì)大大降低SPI的溶解性。但是通過(guò)添加兒茶素可以適當(dāng)提高SPI的溶解性（圖5），在兒茶素添加量為1%時(shí)，SPI的溶解性達(dá)到最大為95.2%，較未添加兒茶素時(shí)提高36.4%。兒茶素的疏水區(qū)能夠通過(guò)疏水相互作用與SPI疏水氨基酸結(jié)合，降低SPI的表面疏水性，從而提高SPI的溶解度[32]。另一方面SPI表面附著兒茶素的羥基和羧基，進(jìn)一步增加了SPI表面的親水性，使溶解度提高[32]。然而當(dāng)兒茶素的添加量繼續(xù)增加時(shí)，導(dǎo)致體系中兒茶素濃度過(guò)大，兒茶素末端占據(jù)蛋白質(zhì)的多數(shù)結(jié)合位點(diǎn)，此時(shí)兒茶素分子很難找到合適位點(diǎn)與蛋白質(zhì)結(jié)合，引起蛋白質(zhì)分子之間交聯(lián)，從而導(dǎo)致溶解度下降[33]。由此可知，適當(dāng)?shù)膬翰杷靥砑恿磕軌蚴勾蠖狗蛛x蛋白的溶解性提高。研究發(fā)現(xiàn)熱處理會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的變性聚集，從而導(dǎo)致溶解性下降[31]。但在加入兒茶素后，噴霧干燥處理的SPI的溶解性增加，結(jié)合巰基與表面疏水性的結(jié)果推測(cè)是因?yàn)榧尤雰翰杷啬軌蚺cSPI暴露的疏水氨基酸殘基結(jié)合，并干預(yù)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)分子間的二硫鍵的形成，抑制蛋白質(zhì)的變性聚集，從而使噴霧干燥后SPI的溶解性提高。

圖5 兒茶素添加量對(duì)大豆分離蛋白溶解性的影響Fig.5 Effects of catechin addition on solubility of soybean protein

2.5 兒茶素添加量對(duì)大豆分離蛋白乳化及乳化穩(wěn)定性的影響

兒茶素添加量對(duì)乳化及乳化穩(wěn)定性的影響如圖6所示。乳化性反映了蛋白質(zhì)在油水界面形成和穩(wěn)定乳液的能力，乳化穩(wěn)定性能夠反應(yīng)乳液抵抗分離和保持分散的強(qiáng)度[34]。從圖6乳化性的變化可以看出，隨著兒茶素添加量的增加，復(fù)合體系的乳化性及乳化穩(wěn)定性呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，在兒茶素添加量為1%時(shí)，乳化性達(dá)到最大值為90.03 m2/g，比對(duì)照組的乳化活性提高了13.7%，乳化穩(wěn)定性為36.3%，比對(duì)照組乳化穩(wěn)定性提高了14.3%，說(shuō)明兒茶素的加入干預(yù)了SPI的熱聚集，提高了其乳化性能。乳化特性取決于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)-脂質(zhì)相互作用，兒茶素能夠改變蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)的相互作用，降低自由能，從而降低油水界面的界面張力[35]。加入兒茶素后乳化性能的改善可能是噴霧干燥導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象發(fā)生變化，使最初位于蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水團(tuán)簇的暴露[36]，增強(qiáng)了與兒茶素的疏水相互作用，從而使改性后蛋白的柔韌性和溶解度的增加，進(jìn)而增加了蛋白對(duì)油水表面的吸附能力[37]。當(dāng)兒茶素添加量超過(guò)1%時(shí)，兒茶素與大豆分離蛋白的交聯(lián)程度增大，但兒茶素活性基團(tuán)如巰基含量下降，導(dǎo)致不足以形成大的交聯(lián)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致大豆分離蛋白的乳化性能下降。Yan 等[35]研究發(fā)現(xiàn)表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯能夠提高大豆分離蛋白的乳化性能，與本文的研究結(jié)果類似。

圖6 兒茶素添加量對(duì)兒茶素/大豆分離蛋白符合體系乳化性及乳化穩(wěn)定性的影響Fig.6 Effects of catechin addition on emulsifying property and emulsifying stability of catechin/soy protein coincidence system

2.6 兒茶素添加量對(duì)大豆分離蛋白凝膠性的影響

兒茶素添加量對(duì)凝膠性的影響如圖7所示。凝膠性反映了SPI可形成立體空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的能力，是評(píng)價(jià)SPI功能性質(zhì)的重要指標(biāo)之一，對(duì)其在食品中的應(yīng)用起著至關(guān)重要的作用。由圖7可知，與對(duì)照組相比，兒茶素的添加均顯著增大了SPI凝膠性，說(shuō)明兒茶素能夠改善SPI噴霧干燥后的凝膠強(qiáng)度。當(dāng)兒茶素添加量為0.25%時(shí)，SPI凝膠性顯示最大值，與對(duì)照組相比提高了43.6%，而后再繼續(xù)增大兒茶素添加量，SPI凝膠性反而下降，這可能是由于起初隨著兒茶素的加入，為溶液提供了可與蛋白質(zhì)氨基酸殘基結(jié)合的活性羥基，促進(jìn)溶液中蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成[38]。隨著兒茶素添加量的增加，過(guò)量的兒茶素將SPI中活性基團(tuán)掩埋，導(dǎo)致凝膠硬度下降[39]。Jongberg等[40]研究表明高濃度的綠茶提取物可與蛋白質(zhì)的巰基反應(yīng)生成巰基-醌加合物，從而阻止蛋白質(zhì)生成穩(wěn)定的二硫鍵，導(dǎo)致蛋白質(zhì)凝膠性降低。其他研究也發(fā)現(xiàn)中等或高濃度的酚類物質(zhì)會(huì)損害凝膠性質(zhì)[41]。此外，Bourvellec等[42]研究發(fā)現(xiàn)熱處理導(dǎo)致SPI變性和構(gòu)象發(fā)生變化，會(huì)暴露更多與多酚的結(jié)合位點(diǎn)。因此，添加兒茶素能夠促進(jìn)噴霧干燥后SPIC間的相互作用，增強(qiáng)凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，阻止了蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間的相互作用，從而抑制了噴霧干燥過(guò)程中SPI的聚集[43]。

圖7 兒茶素添加量對(duì)復(fù)合體系凝膠性的影響Fig.7 Effect of catechin addition on gel properties of composite system

2.7 兒茶素添加量對(duì)大豆分離蛋白凝膠化學(xué)作用力的影響

凝膠形成過(guò)程中，氫鍵、疏水作用、二硫鍵以及靜電作用是形成蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)的主要作用力，其構(gòu)成決定了蛋白凝膠的特性[44]。這些化學(xué)鍵可被特定的化學(xué)試劑破壞，通過(guò)在不同化學(xué)試劑中混合蛋白凝膠溶解度的不同，表征混合蛋白凝膠中化學(xué)鍵的變化。由于DTT能夠斷裂分子間或者分子內(nèi)的二硫鍵，當(dāng)?shù)鞍啄z在DTT中溶解的越多，在凝膠成膠起作用的分子間或者分子內(nèi)的二硫鍵也就越多；疏水相互作用和氫鍵能夠被GuHCl所破壞打斷，因此蛋白凝膠在GuHCl溶解的越多，在凝膠成膠起作用的疏水相互作用和氫鍵也就越強(qiáng)；NaCl可以用來(lái)測(cè)定在凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)形成的過(guò)程中的靜電相互作用和其他一些較弱的分子作用力。由圖8可知，溶出蛋白質(zhì)的含量隨兒茶素添加量的增加呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)，并且各個(gè)處理組均在0.25%時(shí)凝膠的溶解性達(dá)到最大值，表明此時(shí)參與凝膠形成的作用力最大，這一結(jié)果與凝膠硬度的結(jié)果一致，在此添加量下凝膠硬度最大。兒茶素的添加增強(qiáng)了凝膠的氫鍵、二硫鍵以及疏水相互作用，并且凝膠在DTT中的溶解度最高，說(shuō)明二硫鍵是維持SPI-C復(fù)合物的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的主要作用力。

圖8 不同兒茶素添加量的蛋白凝膠作用力的測(cè)定Fig.8 Determination of protein gel force of different catechins

與對(duì)照組相比，添加兒茶素后溶液中溶解的二硫鍵含量顯著增加（P＜0.05）。二硫鍵含量的增加可能是由于兒茶素含有的活性基團(tuán)在熱處理下很容易被氧化成醌[38]，進(jìn)而這些活性基團(tuán)通過(guò)氧化蛋白質(zhì)表面的巰基來(lái)促進(jìn)蛋白質(zhì)之間通過(guò)二硫鍵之間的連接[45]。凝膠在GuHCl中的溶解度隨兒茶素添加量的增加先上升后下降，這是因?yàn)榈蜐舛鹊膬翰杷赜兄谀z網(wǎng)絡(luò)中氫鍵的形成，過(guò)量的兒茶素會(huì)改變熱誘導(dǎo)過(guò)程中SPI的聚集行為[38]，阻礙SPI與水的結(jié)合，導(dǎo)致氫鍵和疏水相互作用降低[46]。凝膠在NaCl中的溶解度較低，且隨著兒茶素的添加含量變化不大，說(shuō)明靜電相互作用對(duì)凝膠形成的影響較小。

2.8 兒茶素添加量對(duì)大豆分離蛋白流變特性的影響

大豆分離蛋白在加熱過(guò)程中分子的形態(tài)和性質(zhì)的變化，能夠用動(dòng)態(tài)流變特性來(lái)表征。儲(chǔ)能模量（G” ）代表了測(cè)試樣品在一定的測(cè)試參數(shù)如應(yīng)變、應(yīng)力下儲(chǔ)存能量的能力，G” 的大小表征了凝膠網(wǎng)絡(luò)的致密程度[47]。在加熱過(guò)程中，兒茶素添加量對(duì)大豆分離蛋白儲(chǔ)能模量的影響如圖9所示。

圖9 不同兒茶素添加量的大豆分離蛋白儲(chǔ)能模量隨溫度變化曲線Fig.9 Curve of storage modulus of soybean protein with different catechin addition with temperature

SPI及SPI-C在30～60 ℃范圍內(nèi)隨著溫度的升高儲(chǔ)能模量下降較快，這是因?yàn)闇囟鹊纳咂茐牧说鞍踪|(zhì)分子內(nèi)的氫鍵，進(jìn)而導(dǎo)致G′下降[48]。隨著溫度的繼續(xù)升高，加劇了蛋白質(zhì)的亞基解離，以及分子間的運(yùn)動(dòng)，增加了分子碰撞機(jī)會(huì)，從而產(chǎn)生交聯(lián)形成凝膠[48]。添加C組的G′值高于對(duì)照組，說(shuō)明添加C可以增強(qiáng)SPI的粘彈性，由表面疏水性的測(cè)定結(jié)果可知，C的添加導(dǎo)致蛋白質(zhì)間的疏水相互作用降低了，這樣能夠使靜電和疏水相互作用達(dá)到平衡，進(jìn)而增強(qiáng)了C與SPI的交聯(lián)作用[49]，從而能夠改善蛋白質(zhì)的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[50]。Pantelis等[51]研究了茶多酚提取物對(duì)胃腸黏蛋白酶作用，發(fā)現(xiàn)與本文類似的結(jié)果，即多酚的添加能夠引起蛋白交聯(lián)。隨著C添加量的增加，G” 呈先升高后降低趨勢(shì)，并當(dāng)C添加量為0.25%時(shí)，儲(chǔ)能模量達(dá)到最大值。這表明對(duì)于大豆分離蛋白凝膠，C添加量存在最適濃度。

2.9 兒茶素添加量對(duì)大豆分離蛋白的凝膠微觀結(jié)構(gòu)

AFM可以用來(lái)表示蛋白質(zhì)樣品的表觀形貌特征[52]。圖10顯示了SPI及SPI-C復(fù)合物凝膠的表面微觀形態(tài)。由圖10A可以看出，未添加兒茶素時(shí)，SPI具有無(wú)序的聚集且分布不均勻；當(dāng)添加了兒茶素后，凝膠的微觀結(jié)構(gòu)由不規(guī)則不均勻向規(guī)則均勻致密轉(zhuǎn)化。這是因?yàn)閮翰杷氐募尤肽軌蚴箻悠分g交聯(lián)的程度減弱，兒茶素和SPI間的維持力（包括氫鍵、二硫鍵等）被打斷，蛋白質(zhì)分子間作用力破壞，分子解聚，大顆粒蛋白減少，均勻度增加[53]。兒茶素添加量為0.25%和0.5%時(shí)，復(fù)合物分子逐漸形成較小、較為分散的聚集體（圖10B、圖10C）；隨著兒茶素添加量的進(jìn)一步增大，復(fù)合物間的聚集程度有所增加，逐漸產(chǎn)生較大的團(tuán)狀聚集體。

圖10 SPI及SPI-C 的原子力顯微鏡圖像Fig.10 AFM images of SPI and SPI-C

利用Nanoscope analysis軟件對(duì)SPI及SPI-C聚集過(guò)程進(jìn)行分析，樣品號(hào)A～H的平均表面粗糙度（Ra）分別為5.153、1.090、1.1345、1.158、2.723、3.392、3.706、4.387 nm，Ra作為統(tǒng)計(jì)學(xué)的基本參數(shù)，能夠反應(yīng)樣品表面粗糙程度的大小，即聚集程度的大小，Ra先減少后增加說(shuō)明SPI隨著兒茶素添加量的增加，其微觀聚集程度呈先減小后增大的趨勢(shì)。根據(jù)2.7凝膠化學(xué)作用力的結(jié)果，得出二硫鍵是參與凝膠形成的主要作用力，由此推測(cè)添加兒茶素能夠斷開參與蛋白質(zhì)凝膠的二硫鍵，使蛋白質(zhì)分子適度解聚，形成均一度較好的小顆粒蛋白，進(jìn)而提高蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)。

2.10 兒茶素添加量對(duì)蛋白質(zhì)體外消化率的影響

不同兒茶素添加量對(duì)蛋白質(zhì)體外消化的影響如圖11所示。由圖11可知，噴霧干燥的SPI及SPIC復(fù)合物的消化率均高于冷凍干燥，這是因?yàn)镾PI及SPI-C在噴霧干燥中發(fā)生了部分變性，進(jìn)而更容易被人體吸收[54]。然而兩種干燥方式蛋白質(zhì)的胃消化率均低于40%，說(shuō)明只有少部分蛋白質(zhì)在胃消化階段進(jìn)行消化，腸消化中蛋白質(zhì)的消化率升高，表明蛋白質(zhì)的消化主要發(fā)生在小腸消化階段，這與郭陽(yáng)[55]的研究一致。SPI的消化率顯著（P＜0.05）高于SPIC復(fù)合物。這可能是由于在SPI與兒茶素在堿性條件下共價(jià)反應(yīng)后，SPI的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，使其不易于被胃蛋白酶和胰蛋白酶等消化酶水解。

圖11 不同兒茶素添加量對(duì)蛋白質(zhì)體外消化率的影響Fig.11 Effects of different catechins on protein digestibility in vitro

3 結(jié)論

本試驗(yàn)探究了不同兒茶素添加量對(duì)噴霧干燥的兒茶素-大豆分離蛋白復(fù)合物結(jié)構(gòu)、功能和消化特性的影響。二者結(jié)合能力的測(cè)定結(jié)果表明，載荷率和荷載量隨著兒茶素添加量的增加而增加；表面疏水性和巰基含量隨著兒茶素添加量的增加逐漸降低。功能特性的測(cè)定結(jié)果表明，在兒茶素添加量為1%時(shí)，溶解性、乳化及乳化穩(wěn)定性達(dá)到最大值；在兒茶素添加量為0.25%時(shí)，凝膠硬度最大；并且參與形成凝膠的作用力結(jié)果表明SPI-C的凝膠網(wǎng)絡(luò)形成主要是二硫鍵的作用；原子力顯微鏡結(jié)果表明兒茶素的加入能夠抑制SPI的聚集程度。此外，體外消化結(jié)果說(shuō)明蛋白質(zhì)的消化主要發(fā)生在小腸階段，且兒茶素的添加會(huì)降低噴霧干燥SPI的消化率。以上試驗(yàn)結(jié)果為研究噴霧干燥制備的大豆分離蛋白與兒茶素之間的相互作用提供了參考，并為植物蛋白和兒茶素復(fù)合物在食品工業(yè)中的應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。然而目前有關(guān)于多酚-蛋白質(zhì)消化特性的測(cè)定大多數(shù)是在體外進(jìn)行測(cè)定，機(jī)體內(nèi)部腸道菌群的變化還不清楚，在未來(lái)可加強(qiáng)多酚-蛋白質(zhì)復(fù)合物體內(nèi)方面的研究，以開發(fā)新型功能性食品。