楊 娟，豆佳紅，孫悅龍，王小瑩，周煒煒，張國濱，劉紅欣，楊培龍，李秀梅,

（1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部飼料生物技術(shù)重點實驗室，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，北京 100081；2.青海樂殊園農(nóng)業(yè)科技有限公司，青海西寧 810000）

費菜是景天科景天屬多年生草本[1]，拉丁名為Phedimus aizoon（Linnaeus）” t Hart.，全草或根為藥材的主要來源[2-3]。在中國四川、湖北、江蘇、寧夏、內(nèi)蒙古等多省地均有栽種，目前國內(nèi)總產(chǎn)量已達到500萬噸以上[4]。費菜作為一種食療保健作用的蔬菜，不僅具有食用及飲用價值，與其他中草藥配伍開發(fā)藥用保健產(chǎn)品，而且已被用于雞、魚和奶牛的養(yǎng)殖中。據(jù)現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，費菜中含有黃酮類、生物堿、酚酸類及揮發(fā)性成分等物質(zhì)[3,5-6]，具有保肝、止血、擴張血管和興奮心臟、調(diào)脂、抑菌、抗氧化和增強免疫力等功效[5,7-9]，且有報道表明，景天科景天屬植物的黃酮類和酚酸類成分具有抗炎作用[10-11]。

黃安玉[11]在篩選養(yǎng)心草抗炎活性單體時，通過建立細菌脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS）誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細胞建立炎癥模型，檢測養(yǎng)心草水提乙酸乙酯部位分離的單體對巨噬細胞分泌的炎性細胞因子時發(fā)現(xiàn)，RAW264.7細胞經(jīng)過LPS誘導(dǎo)后促進細胞因子一氧化氮（Nitric Oxide，NO）、腫瘤壞死因子-α（Tumor Necrosis Factor α，TNF-α）、白細胞介素-1β（Interleukin-1β，IL-1β）、白細胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）的產(chǎn)生，而在養(yǎng)心草中發(fā)現(xiàn)的化合物單體中的原兒茶酸、香草酸、咖啡酸、槲皮素和木犀草素具有抑制這些炎性細胞因子產(chǎn)生的作用，沒食子酸、槲皮素咖啡酸等對巨噬細胞有免疫調(diào)節(jié)作用，表明養(yǎng)心草可能通過減低炎癥介質(zhì)的分泌而發(fā)揮抗炎作用。而林珠燦等[12]在探討景天三七不同部位的提取物在炎癥細胞模型的抗炎活性時也發(fā)現(xiàn)，景天三七醋酸乙酯部位提取物富有酚酸類和黃酮類，能夠顯著抑制LSP誘導(dǎo)的炎性細胞中NO、TNF-α、IL-6的釋放。另有研究[13]發(fā)現(xiàn)，橫根費菜乙酸乙酯萃取部位對急性致炎劑二甲苯引起的小鼠耳廓腫脹有最優(yōu)抑制作用，因其總黃酮含量最高，止癢抗炎效果亦最優(yōu)。而且對相關(guān)炎癥介質(zhì)檢測顯示，橫根費菜水部位對TNF-β、IL-6和NO表達水平具有最明顯的抑制效果。然而近年來，利用大數(shù)據(jù)進行系統(tǒng)而深度挖掘和探討費菜抗炎作用機制的研究甚少。

本文基于中草藥“多成分-多靶點-多途徑”的作用特點，結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)整體性與系統(tǒng)性的特征，通過網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫分析基因、蛋白、疾病以及藥物之間的關(guān)聯(lián)，從數(shù)據(jù)網(wǎng)絡(luò)角度系統(tǒng)性揭示藥物成分、疾病和生物系統(tǒng)之間的復(fù)雜關(guān)系[14-15]。采用分子對接技術(shù)將網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)得到的藥效成分與靶蛋白進行結(jié)合探索，根據(jù)分析結(jié)果，對有效活性成分的抗炎作用進行實驗驗證，初步探討費菜的抗炎作用及其分子機制。

1 材料與方法

1.1 資料數(shù)據(jù)庫

本文主要依據(jù)網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫平臺及在線作圖網(wǎng)站進行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究，所用數(shù)據(jù)庫、在線作圖網(wǎng)站及其網(wǎng)址見表1。

表1 文章所用數(shù)據(jù)庫、在線作圖網(wǎng)站及網(wǎng)址Table 1 Websites of the databases and drawing websites used for the article

1.2 材料與儀器

小鼠巨噬細胞系RAW246.7 American Type Culture Collection （ATCC）；β-谷甾醇（純度≥98%）北京索萊寶科技有限公司；沒食子酸（純度99%）上海麥克林生化科技有限公司；脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS）來源于大腸桿菌 美國Sigma公司；DMEM培養(yǎng)、胎牛血清和青霉素-鏈霉素 Gibco公司；一氧化氮檢測試劑盒、小鼠IL-10 ELISA檢測試劑盒 碧云天生物技術(shù)有限公司；色譜級甲醇、色譜級乙腈 北京邁瑞達科技有限公司；乙酸乙酯（分析純）、磷酸 福晨化學(xué)試劑有限公司；娃哈哈純凈水 杭州娃哈哈百立食品有限公司；費菜 青海樂殊園農(nóng)業(yè)科技有限公司。

全波長酶標儀 MultiskanTMSkyhigh Thermo fisher Scientific公司；CO2細胞培養(yǎng)箱 新加坡藝思科技有限公司；低溫高速離心機 Tokyo公司；高效液相色譜儀 日本島津；超聲波清洗機 山東新華醫(yī)療器械股份有限公司；RE-3000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 費菜藥效成分與靶點的獲取 在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP，Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform）中以“景天三七”中文名進行搜索，根據(jù)口服生物利用度（oral bioavailability, OB）≥30%篩選費菜潛在的藥效成分，并進行去重合并。根據(jù)藥效成分的“Mod ID”在TCMSP數(shù)據(jù)庫藥效成分的“Related Targets”收集靶點；根據(jù)藥效成分的“Molecule Name”在HERB數(shù)據(jù)庫的“Ingredient”收集靶點；通過PubChem數(shù)據(jù)庫下載藥效成分2D 結(jié)構(gòu)的SDF格式，用于SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫進行靶點預(yù)測。匯集所有藥效成分相關(guān)靶點后，經(jīng)Uniprot數(shù)據(jù)庫標準化后，去重匯總。

1.3.2 篩選炎癥靶點 通過GeneCards數(shù)據(jù)庫、OMIM數(shù)據(jù)庫以“inflammation”名稱進行檢索，去重匯總后，得到與炎癥相關(guān)基因。將藥物靶點與疾病靶點經(jīng)Venny 2.1.0在線作圖后，數(shù)據(jù)取交集即費菜潛在的抗炎靶點基因。

1.3.3 構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖 將費菜潛在的抗炎靶點基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫，設(shè)置“Minimum required interaction score”為“high confidence （0.700）”，獲得靶點蛋白-蛋白相互作用（Protein-Protein Interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)分析。將.tsv格式的數(shù)據(jù)結(jié)果上傳至Cytoscape 3.8.0軟件，構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖，同時利用Degree值篩選網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵基因。

1.3.4 構(gòu)建“藥物-藥效成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)分析 將1.3.2得到的交集靶蛋白與費菜相對應(yīng)的藥效成分上傳至Cytoscape 3.8.0軟件，構(gòu)建“費菜-藥效成分-靶點”的網(wǎng)絡(luò)圖。

1.3.5 功能富集和KEGG信號通路分析 將1.3.2項下的交集靶蛋白導(dǎo)入David數(shù)據(jù)庫里面“Shortcut to DAVID Tools”選項下的“Gene Functional Classification Tool”中，以“Homo sapiens”為物種選擇，進行GO功能富集和KEGG通路分析。獲得的數(shù)據(jù)利用微生信在線作圖軟件繪制GO氣泡圖和KEGG信號通路氣泡圖。并利用Cytoscape 3.8.0軟件構(gòu)建“藥效成分-核心靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.3.6 分子對接 根據(jù)Degree值大小，選擇PPI中前三的關(guān)鍵靶點與關(guān)鍵藥效成分進行分子對接。通過TCMSP數(shù)據(jù)庫及PubChem數(shù)據(jù)庫檢索下載得到藥效成分的3D結(jié)構(gòu)信息，并通過Uniprot數(shù)據(jù)庫和PDB數(shù)據(jù)庫得到靶蛋白的.pdb格式結(jié)構(gòu)，使用Openbable2.4.1、PyMOL2.2.0軟件對藥效分子和靶蛋白進行加氫、去水及去電荷等前處理，進而通過Autodock4.2.6軟件將處理后的藥效分子與靶蛋白進行分子對接，最后利用PyMOL2.2.0軟件進行可視化處理。

1.3.7 費菜中藥效成分的鑒定

1.3.7.1 費菜藥效成分的提取 準確稱取粉碎過篩后的費菜樣品2 g于錐形瓶中，加入60 mL蒸餾水，浸泡1 h后，超聲30 min，取上清后殘渣加蒸餾水40 mL，繼續(xù)超聲30 min，取上清?；旌蟽纱紊锨逄崛∫海魸饪s，0.22 μm微孔濾膜過濾，4 ℃冰箱保存，用于沒食子酸的檢測。

稱取粉碎過篩后的費菜樣品200 g，加10倍水浸泡過夜后煎煮1 h，8層紗布過濾后取濾液；濾渣再次加入8倍水后煎煮1 h，8層紗布過濾后取濾液。合并兩次濾液，濃縮至一定體積，加入乙酸乙酯進行萃?。?0 mL×5），濃縮回收，0.22 μm微孔濾膜過濾，4 ℃冰箱內(nèi)保存，用于β-谷甾醇的檢測。

1.3.7.2 費菜藥效成分檢測的色譜條件 選用Agilent ZORBAX SB-C18（4.6×250 mm, 5 μm），流動相為甲醇-0.2%磷酸水溶液（90:10），柱溫30 ℃，檢測波長280 nm，流速0.8 mL/min，進樣量10 μL，檢測分析1.3.7.1中制備的沒食子酸。

選用Agilent ZORBAX SB-C18（4.6×250 mm,5 μm），流動相為乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），洗脫程序：0～5 min，90%～80%（A），5～30 min，80%～70%（A），30～35 min，70%～90%（A），柱溫35 ℃；檢測波長203 nm，流速1.0 mL/min，進樣量10 μL，檢測分析1.3.7.1中萃取的β-谷甾醇。

1.3.8β-谷甾醇、沒食子酸溶液配制 稱取4 mg的β-谷甾醇，在2 mL離心管中溶解于2 mL無水乙醇，過0.22 μm針頭式無菌過濾器，配制β-谷甾醇初始濃度為2 mg/mL。稱取4 mg的沒食子酸，在2 mL離心管中溶解于1 mL無水乙醇，過0.22 μm針頭式無菌過濾器，配制沒食子酸初始濃度為4 mg/mL。

1.3.9 藥效成分抗炎作用實驗驗證

1.3.9.1 細胞培養(yǎng) RAW264.7細胞于完全DMEM培養(yǎng)基（DMEM培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1%青霉素-鏈霉素）中，置于CO2細胞培養(yǎng)箱中，37 ℃培養(yǎng)[16]。

1.3.9.2 實驗處理及分組 接種5×105細胞/孔，細胞被培養(yǎng)在6孔板中12 h，棄掉原培養(yǎng)基，PBS沖洗3遍，加入含有終濃度為2、4、8 μg/mL的β-谷甾醇或10、20、40 μg/L沒食子酸的DMEM完全培養(yǎng)基，處理2 h后，加入終濃度為1 μg/mL LPS共培養(yǎng)24 h，收集細胞上清和蛋白用于后續(xù)檢測[17-18]。分組為空白對照CON組（不作處理）、LPS處理組（1 μg/mL LPS）、藥物處理組（2、4、8 μg/mLβ-谷甾醇+LPS或10、20、40 μg/L沒食子酸+LPS）。

1.3.9.3 NO、IL-10含量檢測 用碧云天NO檢測試劑盒測定細胞上清中NO含量。碧云天Mouse IL-10 ELISA Kit試劑盒檢測細胞上清中IL-10含量變化。

1.4 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用Excel及GraphPad prism 9軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±SD）表示。組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），以P＜0.05為差異統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 費菜藥效成分與靶點

經(jīng)TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索獲得19種費菜化學(xué)成分，根據(jù)口服利用度（Oral bioavailability, OB）≥30%篩選得到的費菜藥效成分僅為6個，去除無靶點化合物后，得到5個主要的費菜藥效成分，具體信息見表2。以“Homo sapiens”為物種篩選條件，去重匯總后獲得的費菜藥效成分潛在相關(guān)靶點130個。

表2 費菜中主要藥效成分Table 2 Main pharmacodynamic components in Sedum aizoon L．

2.2 炎癥靶點

以“inflammation”在GeneCards數(shù)據(jù)庫、OMIM數(shù)據(jù)庫中檢索炎癥相關(guān)靶點，去重匯總后，得到421個靶點基因。將2.1獲得的130個費菜藥效成分靶點基因與炎癥靶點基因通過Venny 2.1.0映射后，得到藥物與疾病共同靶點22個（見圖1），即費菜藥效成分發(fā)揮抗炎作用的與潛在靶點ADRB2、CASP3、CASP8、JUN、MAPK1、MAPK14、NOS2、NR3C1、PIK3CG、PON1、PPARG、PRSS1、PTGS1、PTGS2、TGFB1、EGFR、FASLG、GPR35、NFE2L2、SERPINE1、TP53、TTR相關(guān)。

圖1 費菜藥效成分靶點與炎癥相關(guān)靶點的韋恩圖Fig.1 Venn diagram of targets of pharmacodynamic components and targets related to inflammation

2.3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

將上述22個共同靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫進行蛋白互作，以“高置信度（0.700）”為條件篩選的數(shù)據(jù)結(jié)果上傳至Cytoscape 3.8.0軟件進行分析，去除游離靶點，得到蛋白互作圖，如圖2，共獲得20個節(jié)點，91條邊。靶點連接的線越多，表明該靶點Degree值越高，是關(guān)鍵靶點。按照Degree值≥10篩選條件，獲得費菜抗炎的關(guān)鍵靶點有：PPARG、EGFR、p53、PTGS2、CASP3、JUN、MAPK14、MAPK1、TGFB1，表明這些靶點與費菜抗炎作用有著更為直接的關(guān)系。

圖2 費菜抗炎靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI）Fig.2 Protein-protein interaction of anti-inflammatory targets of Phedimus aizoon (Linnaeus)” t Hart. (PPI)

PPARG作為配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，屬于過氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR）家族，參與多種腫瘤細胞的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移、耐藥過程[19]。PPARG表達的激活可能通過調(diào)節(jié)肺鱗狀細胞癌（LSCC）上游調(diào)節(jié)因子和下游標記基因來抑制LSCC的發(fā)展和進展[20]。表皮生長因子受體（EGFR）整合了多條信號通路的輸入來控制細胞生長、增殖和分化，可以與高爾基體相關(guān)高爾基體膜蛋白1（GOLM1）發(fā)生物理相互作用，EGFR是GOLM1介導(dǎo)的AKT/S6K下游激活和細胞遷移的增強所必需的，且表皮生長因子（EGF）與EGFR結(jié)合后，發(fā)揮EGF促進粘膜上皮細胞合成的作用，有助于胃腸道粘膜上皮細胞的再生與修復(fù)[21-22]。TP53是細胞周期相關(guān)的基因，主要通過合成細胞周期相關(guān)蛋白，在細胞增殖和凋亡的調(diào)控方面發(fā)揮重要作用，50%的腫瘤中存在TP53突變，突變型TP53破壞正常細胞結(jié)構(gòu)，促進腫瘤細胞的代謝[23]。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）能夠被多種炎癥因子激活，增加組織細胞炎癥發(fā)生幾率，還可以通過不同的底物磷酸化，在基因水平和蛋白質(zhì)水平對轉(zhuǎn)錄因子AP-l（JUN）活性進行調(diào)控，在炎癥發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用[24-25]。

2.4 “藥物-藥效成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)分析

將費菜及其藥效成分甲基異石榴皮堿、對羥基苯乙醇、β-谷甾醇和沒食子酸的ID號與相對應(yīng)的炎癥靶點蛋白導(dǎo)入Cytoscape3.8.0軟件，構(gòu)建“藥物-藥效成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖。去除游離靶點后，結(jié)果如圖3所示，共獲得25個節(jié)點，50條邊，證明費菜通過4個藥效成分調(diào)控多個靶點發(fā)揮抗炎作用。另外，Degree值越高，藥效成分越能代表藥材的藥效。β-谷甾醇（Degree=15）和沒食子酸（Degree=13）與費菜（Degree=22）的Degree值最接近，說明β-谷甾醇和沒食子酸最能代表費菜的抗炎作用，因此，確定β-谷甾醇和沒食子酸為費菜抗炎的藥效成分。

圖3 費菜“藥物-藥效成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 Network of ” drug-components-targets” of Sedum aizoon L．

據(jù)報道沒食子酸具有強大的抗炎作用，可以抑制炎癥誘導(dǎo)的促炎細胞因子和趨化因子以及細胞外基質(zhì)降解和基質(zhì)重塑酶的表達，還能顯著抑制炎癥誘導(dǎo)的肌層激活[26-27]。β-谷甾醇可以通過調(diào)節(jié)PPARy/NF-κB信號通路對心肌缺血/再灌注損傷具有保護作用[28]，在研究辣木中分離的β-谷甾醇（BSS）的抗炎活性時發(fā)現(xiàn)，在7.5到30 μmol/L的劑量范圍內(nèi)，抑制PGN、TNF-α或LPS誘導(dǎo)的角質(zhì)形成細胞和巨噬細胞中炎癥因子的分泌[29]。大鼠的動脈瘤模型中，經(jīng)β-谷甾醇給藥降低了趨化因子和炎性細胞因子的表達，顯著減小動脈瘤[30]。綜上所述，本文將選擇β-谷甾醇和沒食子酸2個主要有效抗炎成分進行下一步研究。

2.5 GO功能富集和KEGG信號通路分析

利用David數(shù)據(jù)庫將獲得的22個費菜抗炎的潛在靶點，以P＜0.05、FDR＜0.05為篩選條件，進行GO功能富集和KEGG分析，結(jié)果如圖4～圖5所示。生物過程主要包括RNA聚合酶II啟動子的轉(zhuǎn)錄正調(diào)控、神經(jīng)元凋亡過程的正調(diào)控和脂多糖反應(yīng)等。分子成分主要為細胞核、蛋白復(fù)合物和細胞質(zhì)等。主要涉及的分子功能是酶結(jié)合、蛋白磷酸酶結(jié)合和死亡受體結(jié)合等。KEGG信號通路分析發(fā)現(xiàn)，費菜藥效成分發(fā)揮抗炎作用通路主要涉及美洲錐蟲病、癌癥通路、乙型肝炎、TNF信號通路、結(jié)腸直腸癌、MAPK信號通路、神經(jīng)營養(yǎng)因子信號通路等信號通路。炎癥與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[31]，炎癥反應(yīng)不僅誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生，并且促進腫瘤的發(fā)展及轉(zhuǎn)移，而且腫瘤微環(huán)境中存在的大量炎癥細胞和炎癥因子會誘導(dǎo)多種細胞因子以及趨化因子的表達，促使細胞增殖并誘導(dǎo)血管生成，從而促進腫瘤的發(fā)展及轉(zhuǎn)移。在經(jīng)典炎癥信號通路中，PPARG、TNF、MAPK、p53等靶蛋白起著至關(guān)重要的作用，可以中和抑制炎癥并減輕炎癥病理[25,32]，促進細胞分化、細胞生長和凋亡，激活氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)等[33]。β-谷甾醇和沒食子酸抗炎靶點富集分析涉及大量炎癥通路，表明費菜藥效成分可以通過作用于信號通路中靶蛋白，降低細胞因子及趨化因子的產(chǎn)生與釋放，抑制炎癥反應(yīng)過程中重要蛋白產(chǎn)生過程，逆轉(zhuǎn)炎癥反應(yīng)，從而發(fā)揮抗炎作用[34-35]。

圖4 費菜抗炎靶點GO功能富集分析圖Fig.4 Enrichment map of GO function of anti-inflammatory targets of Sedum aizoon L．

圖5 費菜抗炎靶點基因KEGG信號通路分析圖Fig.5 Enrichment map of the anti-inflammatory genes KEGG pathway analysis of Sedum aizoon L．

2.6 分子對接

分子對接結(jié)果小于0時，配體小分子與受體蛋白可以自由結(jié)合，結(jié)合能越小，配體小分子與受體蛋白之間的親和力越大，兩者發(fā)生相互作用的可能性越高，進而發(fā)揮作用越大[36-38]。本研究利用分子對接技術(shù)，將β-谷甾醇和沒食子酸與PPI預(yù)測結(jié)果中度值前三的靶蛋白PPARG、EGFR、TP53進行對接，結(jié)果表明（表3），β-谷甾醇和沒食子酸與蛋白分子之間的結(jié)合能均小于0，β-谷甾醇和沒食子酸與靶蛋白PPARG、EGFR、TP53均能較好地結(jié)合。另外，從分子對接示意圖結(jié)（圖6）可以看出β-谷甾醇與靶蛋白的結(jié)合能更低，表明β-谷甾醇與靶蛋白的結(jié)合更穩(wěn)定。不同靶蛋白與小分子之間的相互結(jié)合位點不同，β-谷甾醇與PPARG通過Glu207、Gln415位點形成氫鍵相互作用，而β-谷甾醇與EGFR則是通過Ser43位點形成氫鍵相互作用。不同小分子與相同靶蛋白之間的相互結(jié)合位點亦不同，同一個TP53靶蛋白，β-谷甾醇通過Glu66位點形成氫鍵，而沒食子酸不僅與Glu66位點，還與Glu59、Gln45位點形成氫鍵。結(jié)合位點多不代表結(jié)合能更低，β-谷甾醇僅通過Glu66結(jié)合位點即能發(fā)揮更穩(wěn)定的結(jié)合作用，這表明它與配體分子有強烈的靜電力作用，是關(guān)鍵位點。

表3 核心靶點與藥效成分分子對接結(jié)果Table 3 Molecular docking results of targets andpharmacodynamic components

圖6 分子對接示意圖Fig.6 Diagrams of molecular docking

2.7 費菜中藥效成分的鑒定

為確定沒食子酸和β-谷甾醇是費菜中藥效成分，本研究從費菜中提取沒食子酸和β-谷甾醇[39-40]，利用高效液相色譜法檢測費菜提取物中沒食子酸和β-谷甾醇，并與沒食子酸和β-谷甾醇標準品進行比對，結(jié)果見圖7～圖8，保留時間在2.832的色譜峰可與沒食子酸標品對比上，保留時間在8.165 min的色譜峰可與β-谷甾醇標品比對上，表明費菜中存在沒食子酸和β-谷甾醇。在費菜抗炎作用的其他研究[11,13,41]中同樣證明了沒食子酸和β-谷甾醇的存在。

圖7 沒食子酸標品與費菜提取物（沒食子酸）數(shù)據(jù)比對圖Fig.7 Data comparison between standard gallic acid and extract of Phedimus aizoon (Linnaeus)” t Hart. (gallic acid)

圖8 β-谷甾醇標品與費菜乙酸乙酯萃取物（β-谷甾醇）數(shù)據(jù)比對圖Fig.8 Data comparison between β-sitosterol standard and ethylacetate extract of Phedimus aizoon (Linnaeus)” t Hart.(β-sitosterol)

2.8 費菜主要有效抗炎藥效成分抗炎效果驗證

本研究利用LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細胞模型，考察費菜的抗炎作用，結(jié)果如圖9～圖10所示，與LPS處理組相比，隨著β-谷甾醇和沒食子酸藥物濃度的升高，細胞上清液中的NO含量降低，抗炎因子IL-10含量升高，呈劑量依賴性關(guān)系，當β-谷甾醇濃度≥2 μg/mL和沒食子酸濃度≥20 μg/L時，兩種藥物能顯著降低NO含量（P＜0.01）。當β-谷甾醇濃度≥4 μg/mL和沒食子酸濃度≥10 μg/L時，兩種藥物能顯著提高IL-10含量（P＜0.01）。

圖9 不同劑量的β-谷甾醇和沒食子酸對上清中NO含量的影響Fig.9 Effects of different doses of β-sitosterol and 3,4,5-trihydroxy benzoic acid on NO contents in the supernatant

圖10 不同劑量的β-谷甾醇和沒食子酸對上清中IL-10含量的影響Fig.10 Effects of different doses of β-sitosterol and 3,4,5-trihydroxy benzoic acid on IL-10 contents in the supernatant

這可能與藥效成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)有關(guān)，即藥物與抗炎作用之間的構(gòu)效關(guān)系。沒食子酸（3,4,5 -三羥基苯甲酸）是一種天然存在的多酚化合物，其發(fā)揮抗炎作用的機理之一可能是由于其不飽和雙鍵的存在，對花生四烯酸（AA）的環(huán)氧酶（COX）和5-脫氧酶（5-LOX）起到抑制作用，且作為抗炎的活性基團更有利于化合物與蛋白的結(jié)合，抑制炎癥發(fā)生[42]；而β-谷甾醇以甾核為骨架，在它的C-5位有一個環(huán)內(nèi)雙鍵，雙鍵位置決定抗炎作用，具有環(huán)內(nèi)雙鍵的化合物抗炎作用強于具有環(huán)外雙鍵的化合物[43]，β-谷甾醇的環(huán)內(nèi)雙鍵決定了其具有抗炎效果。根據(jù)分子對接結(jié)果表明β-谷甾醇較之沒食子酸具有更低的結(jié)合能，可發(fā)揮更穩(wěn)定的結(jié)合力，這可能與羥基位點個數(shù)有關(guān)， 羥基的酰化修飾不能增加抗炎活性[43]，β-谷甾醇C-3位有一個羥基（-OH），而沒食子酸C-3、C-4、C-5位均含有羥基。

3 結(jié)論

綜上所述，本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測了費菜藥效成分及作用靶點，其中關(guān)鍵抗炎藥效成分為β-谷甾醇和沒食子酸，關(guān)鍵靶點為PPARG、EGFR、TP53，通過正調(diào)控RNA聚合酶II啟動子的轉(zhuǎn)錄，神經(jīng)元凋亡以及參與脂多糖反應(yīng)等多種生物過程，經(jīng)由腫瘤途徑、乙型肝炎和經(jīng)典炎癥信號通路等10條關(guān)鍵信號通路發(fā)揮抗炎作用。利用高效液相色譜法證明了費菜中含有藥效成分β-谷甾醇和沒食子酸。進一步通過細胞實驗驗證證明，費菜抗炎藥效成分可通過降低促炎因子NO的含量，提高抗炎因子IL-10的含量發(fā)揮抗炎作用，呈劑量依賴關(guān)系。沒食子酸發(fā)揮抗炎作用可能是由于其結(jié)構(gòu)中的不飽和雙鍵作為抗炎的活性基團可有效促進藥物與蛋白作用，降低炎癥反應(yīng)；β-谷甾醇發(fā)揮抗炎作用可能是由于其結(jié)構(gòu)中的環(huán)內(nèi)雙鍵使其具有強抗炎作用，且分子對接結(jié)果顯示兩者均能很好地與蛋白結(jié)合。本研究為進一步深入研究費菜抗炎作用及其作用機理提供理論依據(jù)。