葛曉陽，梅璐，鄭權

(鄭州大學第五附屬醫(yī)院 消化內科，河南 鄭州 450000)

結腸癌是世界最常見的癌癥之一，2020年世界結直腸癌新發(fā)193萬，在全球常見新發(fā)癌癥中結直腸癌位居第三；因結直腸癌死亡人數(shù)達到93萬，在全球常見癌癥死亡原因中位居第二；中國新發(fā)結直腸癌55萬，為國內新增癌癥發(fā)病率第二位，新增結直腸癌死亡人數(shù)28萬，為國內常見癌癥死亡人數(shù)第五位，中國新發(fā)結直腸癌占世界新發(fā)人數(shù)的28.4%[1]。目前結腸癌最有效的治療手段仍是手術治療，盡管在放療、輔助化療、靶向治療方面取得了一定成效，但患者的生存結局仍然較差[2]，未能早期診斷以及預測預后是其死亡率高的主要原因[3]。相對于臨床檢查，生物標志物的檢測更快速有效，因此，探索結腸癌的潛在生物標志物是非常必要的，有利于預測患者預后，指導治療以延長患者總生存期。壞死性凋亡是一種新型程序性細胞死亡模式，表現(xiàn)為壞死和凋亡之間的中間特征，與壞死類似，表現(xiàn)為細胞腫脹和破裂，與凋亡類似，RIP1激酶和RIP3激酶是該通路的關鍵上游因子，通過多種磷酸化發(fā)揮復雜的調控作用，激活下游MLKL異位到質膜，增強膜的滲透性，從而導致細胞膜的破壞[4-6]。作為一種可調控的細胞死亡模式，壞死性凋亡相關通路的干預可能是抗癌藥物研究的新方向。另有研究表明，MLKL磷酸化水平升高與結腸癌患者預后不良正相關[7]，進一步探索壞死性凋亡相關的生物標志物對于預測結腸癌患者的疾病進展以及生存預后具有重要的意義。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，LncRNA)是指長度大于200個堿基對的非蛋白編碼轉錄體，它們雖然不編碼蛋白質，但可以通過調控染色質修飾、RNA剪切、細胞周期等多種途徑影響腫瘤的進展[8]。有研究表明LncRNA在結腸癌預后的評估中發(fā)揮重要作用[9-10]，而關于壞死性凋亡相關LncRNA對結腸癌預后影響的研究較少。本研究基于TCGA數(shù)據(jù)庫構建并驗證壞死性凋亡相關9-LncRNA預后模型，以期對結腸癌預后有更準確的評估，為結腸癌靶向分子的研究提供新思路。

1 資料與方法

1.1 壞死性凋亡相關LncRNA的篩選自美國癌癥基因組圖譜(the Cancer Genome Atlas，TCGA)數(shù)據(jù)庫中獲取結腸癌患者轉錄組數(shù)據(jù)及臨床數(shù)據(jù)，包括473例癌組織轉錄組測序數(shù)據(jù)和相對應的452例患者的臨床資料(年齡、性別、生存時間、生存狀態(tài)、腫瘤分期)。從京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)數(shù)據(jù)庫獲取159個壞死性凋亡相關基因。使用Perl語言將轉錄組數(shù)據(jù)整理成行名為基因名、列名為樣品名的表達矩陣，并區(qū)分為mRNA和LncRNA兩個表達矩陣，引用R軟件limma包，將上述159個壞死性凋亡相關基因和mRNA表達矩陣取交集，得到壞死性凋亡相關基因表達矩陣；對上述LncRNA和壞死性凋亡相關基因表達矩陣進行共表達分析(相關系數(shù)r>0.300且P<0.001)得到壞死性凋亡相關LncRNA表達矩陣。

1.2 壞死性凋亡相關LncRNA預后模型的構建將上述矩陣和臨床數(shù)據(jù)合并，引用R軟件survival包，采用Kaplan-Meier生存分析、單因素Cox回歸分析，篩選得到結腸癌預后相關壞死性凋亡LncRNA，采用多因素Cox回歸分析進一步篩選并構建風險評分模型，根據(jù)最小赤池信息量(Akaike information criterion，AIC)得到最優(yōu)模型。并引用R軟件ggplot2包和ggalluvial包繪制?；鶊D將結果可視化。

1.3 預后模型的評估得到LncRNA預后模型后，基于多因素Cox回歸系數(shù)計算風險評分，根據(jù)風險評分中位值將患者分為高、低風險組并進行Kaplan-Meier生存分析，引用R軟件survival包繪制結腸癌患者高、低風險組生存曲線。引用R軟件survival ROC包，繪制1、3、5 a受試者工作特征曲線(receiver operator characteristic，ROC)，評估該風險模型的靈敏度和特異性。為進一步評估該模型是否是獨立預后因素，引用R軟件survival包將其聯(lián)合臨床性狀進行單因素和多因素Cox回歸分析。

1.4 列線圖的構建列線圖可利用多種指標綜合評估患者病情進展和預后，引用R軟件“rms包”“survival包”將預后風險評分模型和年齡、性別、TMN分期納入Cox回歸模型，繪制臨床列線圖，預測1、3、5 a生存率，以拓展該預后模型的臨床用途，計算一致性指數(shù)(consistency index，C指數(shù))并繪制校準圖檢驗列線圖的準確性。

1.5 統(tǒng)計學分析采用R 4.1.2和perl 5.32.1.1進行數(shù)據(jù)處理和圖形制作。采用Kaplan-Meier方法進行生存分析，log-rank檢驗計算P值。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 結腸癌壞死性凋亡相關LncRNA的獲取從TCGA數(shù)據(jù)庫得到結腸癌患者組織樣本的轉錄組數(shù)據(jù)，識別出了14 142個LncRNA，從KEGG數(shù)據(jù)庫獲取159個壞死性凋亡相關基因，根據(jù)共表達的方法(相關系數(shù)r>0.300，P<0.001)篩選得到1 197個壞死性凋亡基因相關LncRNA表達矩陣。

2.2 構建結腸癌壞死性凋亡相關LncRNA的預后模型將上述表達矩陣和生存數(shù)據(jù)合并后，刪去癌旁樣本及數(shù)據(jù)不全樣本，共得到372例結腸癌患者資料。采用Kaplan-Meier分析、單因素Cox回歸分析(P<0.05)篩選出37個壞死性凋亡預后相關LncRNA，納入多因素Cox回歸模型，根據(jù)最小AIC得到最佳模型由9個LncRNA 組成，包括AC010973.2、LINC01011、AC027307.2、CD27-AS1、LINC02474、AC044802.2、LBX2-AS1、TNFRSF10A-AS1、B4GALT1-AS1。根據(jù)多因素Cox回歸系數(shù)計算風險評分。對9種壞死性凋亡相關LncRNA在結腸癌中的功能進行可視化處理，繪制?；鶊D，清晰顯示了46個mRNA和9個LncRNA及其與預后的關系。見圖1。

圖1 mRNA-lncRNA預后關系的?；鶊D

2.3 評估壞死性凋亡相關LncRNA預后模型

2.3.1基于預后模型的生存分析 基于壞死性凋亡相關LncRNA風險評分的中位值將患者分為高、低風險組，各186例。對高低風險組進行Kaplan-Meier生存分析顯示，結腸癌高風險組的生存率低于低風險組(P<0.001)。風險曲線將結腸癌患者根據(jù)風險評分從低到高進行排序，散點圖顯示高風險組生存率低于低風險組，熱圖顯示高、低風險結腸癌患者9種預后相關的LncRNA水平差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2、3。

圖2 基于9-LncRNA預后模型的KM生存曲線

A為風險評分分布圖；B為生存狀態(tài)分布散點圖；C為9-LncRNA表達熱圖。

2.3.2ROC曲線的繪制 利用ROC曲線評價預后模型的靈敏性和特異性，代表1、3、5 a生存率預測效果的ROC曲線下面積(area under the curve，AUC)分別為0.728、0.777、0.754，提示該模型對結腸癌高低風險組的分類效果及預后預測效能較好。見圖4。

圖4 9-LncRNA預后模型的1、3、5 a ROC曲線

2.3.3獨立預后分析 單因素Cox回歸和多因素Cox回歸分析顯示，年齡、T分期和預后模型是獨立預后因素(P<0.05)。即排除臨床混雜因素的影響，風險評分模型仍然是結腸癌預后不良的危險因素。見圖5。

2.4 列線圖的構建將性別、年齡、預后風險評分和T、M、N分期納入Cox回歸模型，利用R軟件構建列線圖預測1、3、5 a生存率，C指數(shù)>0.7時視為預測效能尚可，計算C指數(shù)為0.816，95%可信區(qū)間為0.77～0.87。繪制校準圖，可見校準曲線和標準曲線貼合，說明該列線圖對結腸癌的預后預測和實際預后相符合。見圖6。

A為單因素Cox回歸；B為多因素Cox回歸。

A為列線圖；B、C、D為1、3、5 a校準圖

3 討論

壞死性凋亡是一種新型程序性細胞死亡模式，近年在細胞死亡機制和癌癥治療策略研究中備受關注。Zhao等[11]進行動物實驗證明了壞死性凋亡關鍵介質MLKL在結腸癌發(fā)生中的作用。Conev等[12]針對結腸癌患者5-氟尿嘧啶耐藥問題，進行了臨床回顧性研究，證明壞死性凋亡途徑所依賴的RIPK3與患者預后相關，高表達患者總生存期顯著延長，可能是一種有前景的預后標志物。Mishra等[13]研究表明人糖脂轉移蛋白上調誘導結腸癌細胞壞死性凋亡，但保留正常細胞。這些研究表明，壞死性凋亡在調節(jié)結腸癌細胞生長和增殖中發(fā)揮重要作用，藥物調節(jié)壞死性凋亡相關通路可能是治療結腸癌的新策略。此外，既往研究已建立了結腸癌鐵死亡相關、m6A相關LncRNA預后模型，顯示出良好的預測效能[14-15]。Wang等[16]研究入組了95例結直腸腺瘤患者、128例結直腸腺癌患者和88例健康個體，結果顯示LncRNA IFNG-AS1表達量在結腸腺癌中升高，它與腫瘤大小、TNM分期和患者的不良預后有關。隨著對LncRNA的深入研究，LncRNA在結腸癌中的預測效能將不斷提升。

鑒于壞死性凋亡和LncRNA都在結腸癌進展中發(fā)揮重要作用，本研究基于TCGA數(shù)據(jù)庫分析壞死性凋亡相關LncRNA在結腸癌患者預后預測中的作用，構建了結腸癌壞死性凋亡相關9-LncRNA模型，包括AC010973.2、LINC01011、AC027307.2、CD27-AS1、LINC02474、AC044802.2、LBX2-AS1、TNFRSF10A-AS1、B4GALT1-AS1，根據(jù)風險評分將患者分為高、低風險組，進行生存分析，發(fā)現(xiàn)高風險組總生存期低于低風險組。繪制ROC曲線，計算1、3、5 a生存率預測效果的AUC值均大于0.7，說明該模型對于結腸癌患者生存時間預測效果良好。進行單因素、多因素Cox回歸分析，結果表明，壞死性凋亡相關LncRNA預后模型是結腸癌患者的獨立預后因素。將預后評分模型結合臨床性狀構建臨床列線圖并繪制校準曲線，計算C指數(shù)為0.816，且可見校準曲線和標準曲線基本一致，進一步表明該風險評分模型可較準確預測結腸癌預后，有望結合臨床性狀預測結腸癌患者預后。9種LncRNA中，AC044802.2是新發(fā)現(xiàn)的，未見相關報道，余8種均被報道和結腸癌預后相關[17-23]。值得一提的是，本研究中mRNA-LncRNA共表達網(wǎng)絡中可見TNFRSF10A-AS1與多種壞死性凋亡mRNA相關。有研究表明其與細胞自噬相關，為結腸癌預后生存的保護因素[23]，與本研究相符，該LncRNA同時參與細胞自噬和壞死性凋亡，可能對結腸癌的發(fā)生發(fā)展有重要作用，然而其發(fā)揮調控作用的具體通路有待進一步研究。目前對于LncRNA在壞死性凋亡中的作用機制相關報道較少，有研究表明某些LncRNA通過與miRNA 相互作用，上調或下調靶基因表達來調節(jié)壞死性凋亡。例如：在肝癌細胞中Linc00176結合多種腫瘤抑制因子miRNA，如miR-9和miR-185，當Linc00176缺失使相關miRNA釋放，導致144個靶基因下調，抑制細胞增殖并誘導細胞壞死性凋亡[24]。此外，有一項研究表明，在葡萄糖饑餓條件下，p53直接上調人類腫瘤細胞中一種名為TRINGS的新型LncRNA，即葡萄糖饑餓條件下Tp53調節(jié)的壞死抑制劑，TRINGS與STRAP結合，抑制STRAP-GSK3β-NF-κB壞死信號，保護腫瘤細胞免于細胞死亡，這是一種不同于傳統(tǒng)壞死途徑(RIPK1-RIPK3-MLKL)的新型壞死性凋亡途徑[25]。

總之，本研究建立并評估了結腸癌壞死性凋亡相關9-LncRNA預后預測模型，構建了壞死性凋亡相關mRNA-LncRNA共表達網(wǎng)絡，并且進一步構建了臨床列線圖，期待優(yōu)化結腸癌患者生存風險評估，促進個性化治療，同時為結腸癌的治療靶點提供新策略。但本文仍有一定局限性，9種LncRNA在結腸癌細胞中調控壞死性凋亡的詳細機制仍需后續(xù)深入研究。靶向LncRNA往往比靶向單個基因對癌細胞產(chǎn)生更大的影響，是結腸癌十分有前景的研究方向。