李江偉，尹翠翠，李振乾，秦慧，黃培，雷旭

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 a.病理科;b.呼吸內(nèi)科，河南 鄭州 450052)

肉芽腫性炎是臨床病理檢查中常見的病理改變，雖然多種致病因素都可導(dǎo)致肉芽腫性炎的形成，但以結(jié)核分枝桿菌感染更為多見。據(jù)世界衛(wèi)生組織發(fā)布的最新版全球結(jié)核病報告顯示，我國2020年新發(fā)結(jié)核病患者約82.4萬人，估算發(fā)病率約為59/10萬人，在30個結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家中我國預(yù)計病例數(shù)排第2位，僅次于印度[1]，結(jié)核病已經(jīng)成為我國的重大公共衛(wèi)生問題之一。

臨床上結(jié)核病的檢查方法有多種，而任何一種方法都不完善，均不能單獨地明確診斷結(jié)核病。組織病檢直接取材于結(jié)核病灶，相較于其他檢材，更有一定的針對性，對病檢組織進(jìn)行常規(guī)的結(jié)核分枝桿菌的檢測，有助于臨床醫(yī)生及時判斷病情和治療。本研究對373例肉芽腫性炎石蠟包埋組織進(jìn)行常規(guī)的抗酸染色和結(jié)核分枝桿菌DNA(MycobacteriumtuberculosisDNA，TB-DNA)檢測，比較兩者在組織中的檢出效能的差異，并分析它們與其他實驗室檢測指標(biāo)的關(guān)聯(lián)，以期對結(jié)核病的早期診斷和治療有所幫助。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源2022年1—5月鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院送檢的各種類型組織標(biāo)本373例，病理均初診為“肉芽腫性炎，結(jié)核不除外”，或“需要特殊染色和TB-DNA協(xié)診”。入圍病例中，男202例，女171例，年齡2～85歲，平均(49.39±17.02)歲，中位年齡53歲。送檢標(biāo)本中肺組織標(biāo)本(包含肺活檢和肺部分切除)174例，胸腔積液沉渣細(xì)胞塊35例，淋巴結(jié)組織標(biāo)本35例，胃腸和腎組織各12例，頸部腫物組織12例，胸膜組織(包括胸膜活檢和切除)11例，輸尿管活檢組織標(biāo)本6例，縱隔組織4例，其他組織標(biāo)本包括支氣管、肝、皮膚、宮內(nèi)膜、腦、聲帶、關(guān)節(jié)滑膜組織等共72例。

1.2 試劑與儀器抗酸染色試劑盒為Baso公司產(chǎn)品；DNA提取試劑盒為Omega公司產(chǎn)品，TB-DNA熒光定量試劑盒為凱基公司產(chǎn)品，使用ABI 7500型PCR儀進(jìn)行定量擴(kuò)增。

1.3 DNA的提取組織蠟塊5 μm切片，將切片卷起裝入1.5 mL EP管中，每切取1個蠟塊，即用體積分?jǐn)?shù)為75%的酒精清潔消毒刀位周圍，防止組織之間污染。短暫離心，將組織切片離心于管底。用二甲苯脫蠟2次，使用無水乙醇漂洗2次，然后在EP管中放置晾干。之后按照Omega DNA提取試劑盒說明書的過程操作，最后洗脫DNA，保留DNA洗脫液的離心管。使用Nanodrop測量DNA濃度和A260/A280。

1.4 PCR擴(kuò)增從試劑盒中取出TB PCR反應(yīng)液、Taq酶和UNG酶，融化后離心10 s，按照試劑盒說明書的方法，計算各試劑的使用量，配制40 μL反應(yīng)體系，包括37.8 μL TB PCR反應(yīng)液，0.2 μL Taq酶，0.06 μL UNG酶，2 μL DNA樣本(包括待測樣本、強(qiáng)陽性對照和陰性對照)，使用ABI 7500熒光定量PCR儀擴(kuò)增，循環(huán)條件設(shè)置如下：37 ℃，5 min；94 ℃，1 min；40個循環(huán)；95 ℃，5 s；60 ℃，30 s。結(jié)果判定：強(qiáng)陽性對照樣本、陽性樣本檢測時有明顯的S形曲線，陰性對照和陰性樣本則沒有；檢測樣本的CT值為40，0和無數(shù)值時，檢測結(jié)果為陰性；檢測樣本CT值≤37時，檢測結(jié)果為陽性；檢測樣本CT值>37的樣本需要復(fù)檢，復(fù)檢結(jié)果CT值<40者，檢測結(jié)果仍為陽性，否則為陰性。

1.5 抗酸染色按照Baso抗酸染色試劑盒說明書的要求，所有待測石蠟包埋組織蠟塊3 μm切片，70 ℃烤片，二甲苯和梯度酒精脫蠟至水，石炭酸復(fù)紅液染色30 min；酸性酒精分化液分化至無染料脫出；亞甲藍(lán)染色30 s；梯度酒精和二甲苯脫水透明，中性樹膠封片。

1.6 其他實驗室檢測結(jié)果回顧及判斷標(biāo)準(zhǔn)回顧查驗抗酸染色或TB-DNA陽性病例的病歷資料和其他相關(guān)的實驗室檢查結(jié)果，收集數(shù)據(jù)，分析組織抗酸染色或TB-DNA檢測與它們之間的關(guān)聯(lián)。本研究以臨床確診結(jié)核/肺外結(jié)核病為判斷標(biāo)準(zhǔn)，敏感度為真陽性標(biāo)本數(shù)/確診陽性總例數(shù)，特異度為真陰性標(biāo)本數(shù)/確診陰性總例數(shù)，一致符合率為(共同陽性+陰性符合數(shù))/總例數(shù)。CT影像和抗酸染色陽性的判斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)《痰涂片鏡檢查標(biāo)準(zhǔn)化操作及質(zhì)量保證手冊》和文獻(xiàn)報道執(zhí)行[2-4]，均經(jīng)2位有經(jīng)驗的醫(yī)生復(fù)驗確定。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析定性資料率的比較用R×C列聯(lián)表的χ2檢驗或配對資料的χ2檢驗等統(tǒng)計方法分析，當(dāng)樣本數(shù)n<40或理論頻數(shù)T<1或有1≤T<5的格子數(shù)大于格子總數(shù)的1/5時，則使用Fisher’s exact test法檢驗，所有數(shù)據(jù)均使用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件分析，P<0.05(雙側(cè))為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 抗酸染色和TB-DNA在各肉芽腫性炎組織中的陽性率肺活檢、胸腔積液沉渣細(xì)胞塊、淋巴結(jié)活檢、胃腸活檢、腎組織、頸部腫物、胸膜活檢、輸尿管活檢、縱隔活檢和其他組織等各類型組織抗酸染色、TB-DNA的陽性表現(xiàn)如圖1所示。在373例各類型組織標(biāo)本中，共檢測到抗酸染色陽性73例，總陽性率為19.57%(73/373)；TB-DNA陽性102例，總陽性率為27.35%(102/373)。見表1。各類型組織抗酸染色的陽性率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=9.139，P=0.425)，而各類型組織TB-DNA陽性率的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=31.239，P<0.001)。

A為組織樣本抗酸染色呈陽性(40×)，鏡下見紅色桿狀細(xì)菌；B為FQ-PCR檢測組織樣本TB-DNA呈陽性，見“S”型曲線，紅紫色曲線為陽性對照。

表1 373例各類組織標(biāo)本抗酸染色和TB-DNA檢測結(jié)果

2.2 抗酸染色和TB-DNA在肉芽腫性炎組織中檢測結(jié)核分枝桿菌的效能對比分析在檢測的373例組織標(biāo)本中，58例抗酸染色和TB-DNA均為陽性，抗酸染色陽性而TB-DNA陰性的有15例，抗酸染色陰性而TB-DNA陽性的有44例，兩者均為陰性的有256例，兩種檢測的一致符合率為84.18%(314/373)；抗酸染色的檢驗效能低于TB-DNA的檢驗效能，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。見表2。本研究中，檢測到117例組織抗酸染色和(或)TB-DNA呈陽性，查閱臨床病歷資料，其中106例確診為肺結(jié)核病或肺外結(jié)核病?？顾崛旧?06例確診病例組織中的陽性率為60.38%，即抗酸染色的敏感度和特異度分別為60.38%、96.63%；TB-DNA在這些組織中的陽性率為94.34%，即TB-DNA的敏感度和特異度分別為94.34%、99.25%，兩者比較，TB-DNA檢測有更高的敏感度(χ2=34.902，P<0.001)和特異度(χ2=4.548，P=0.033)。見表3。

表2 兩種檢測方法檢出結(jié)核分枝桿菌的對比分析

表3 兩種檢測方法敏感度和特異度

2.3 TB-DNA與CT影像和其他實驗室檢測項目比較分析在確診為肺結(jié)核病或肺外結(jié)核病的106例病例中，99例患者有其他相關(guān)的影像或?qū)嶒炇覚z查資料。在有CT影像檢查資料的97例中，82.47%(80/97)病例的肺部CT有陽性發(fā)現(xiàn)，TB-DNA的陽性檢出率高于CT影像的陽性檢出率，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=5.968，P=0.015)。31例病例同時進(jìn)行了痰或其他體液的涂片抗酸染色，但僅有6.45%(2/31)的病例涂片呈陽性，F(xiàn)Q-PCR在檢出結(jié)核分枝桿菌方面要優(yōu)于體液涂片的抗酸染色(χ2=43.658，P<0.001)。50例病例進(jìn)行了T-SPOT.TB檢驗，96.00%(48/50)的病例呈陽性，TB-DNA和TB-SPOT.TB在篩選結(jié)核病例時差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.999)；10例病例進(jìn)行了γ-干擾素釋放試驗(interferon-gamma release assay, IGRAs)，80.00%(8/10)的病例呈陽性；17例病例進(jìn)行了TB特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)實驗，82.35%(14/17)的病例呈陽性反應(yīng)，TB-DNA、IGRAs和TB特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)在陽性率方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.474、0.227)，即三者在檢出結(jié)核病例方面效果相當(dāng)，但要優(yōu)于體液涂片的抗酸染色，也要優(yōu)于CT影像檢查。

3 討論

肉芽腫性炎是臨床病檢中常見的病理改變，也是結(jié)核病主要的病理變化?，F(xiàn)階段，早期診斷和治療仍為阻斷結(jié)核病發(fā)展的有效措施，在病檢材料中檢出結(jié)核分枝桿菌是確診結(jié)核病的重要依據(jù)。目前，并沒有一種萬能的方法能單獨確診結(jié)核病，但結(jié)核病患者的病檢材料已不限于痰液，血液、體液和活檢組織等都可以用于檢測，相應(yīng)的實驗室檢查方法有體液涂片或組織的抗酸染色、FQ-PCR技術(shù)檢測TB-DNA，以及基于γ-干擾素釋放和細(xì)胞免疫反應(yīng)原理發(fā)展起來的T-SPOT.TB、IGRAs和TB特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)等相關(guān)技術(shù)，而結(jié)核分枝桿菌分離培養(yǎng)仍是確診結(jié)核病的金標(biāo)準(zhǔn)[4]。病原學(xué)和病理學(xué)檢查均是確診結(jié)核病的重要依據(jù)，活檢和手術(shù)切除標(biāo)本直接取材于病灶部位，在診斷結(jié)核病方面有較其他病檢材料獨特的優(yōu)勢。本研究選取了373例近半年來初診為肉芽腫性炎的病例為研究對象，意圖闡述在肉芽腫性炎組織中兩種結(jié)核分枝桿菌檢測方法的優(yōu)勢，以及它們與其他實驗室檢測指標(biāo)聯(lián)合應(yīng)用的價值。

在本研究中，抗酸染色在送檢的肺、胸腔積液沉渣細(xì)胞塊、淋巴結(jié)、胃腸活檢等組織中的陽性率大致相當(dāng)，盡管在病例少的組織中肉芽腫性炎中檢出率較低，但總體上差異無統(tǒng)計學(xué)意義；而TB-DNA的陽性率在以上組織中則變化明顯，主要表現(xiàn)在肺和腎組織中的陽性率較其余組織高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。筆者認(rèn)為這主要與肺組織標(biāo)本的送檢量比較大，肺外結(jié)核中腎結(jié)核的發(fā)病率高，而其他肺外結(jié)核的發(fā)病率、送檢量均較低有關(guān)。本研究結(jié)果與吳俊峰、郝穎華等[5-6]的報道結(jié)果接近，介于兩者之間。

抗酸染色法在檢測結(jié)核分枝桿菌方面有諸多優(yōu)點，比如簡便、快速、價廉等，缺點是對樣本質(zhì)量的依賴性大，不能區(qū)分結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌，重要的是檢出率比較低，對結(jié)核病診斷的幫助有限。FQ-PCR技術(shù)檢測TB-DNA不僅可以檢測到結(jié)核分枝桿菌核酸的存在，而且可以判斷結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌，已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于臨床檢測。本研究中，TB-DNA的陽性率高于抗酸染色的陽性率，具有更好的靈敏度和特異度，與之前在痰標(biāo)本中的報道結(jié)果[7]保持一致，而與孫林雍等[8]在骨組織中得到的TB-DNA陽性率略低于其抗酸染色陽性率的結(jié)果不同。這可能與樣本選取和骨組織的特殊處理方法(脫鈣)有關(guān)。TB-DNA和抗酸染色也有不一致的結(jié)果，原因是多方面的。少數(shù)情況下出現(xiàn)TB-DNA呈陰性而抗酸染色呈陽性，原因可能是抗酸染色不能分辨結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌，特異度稍低，也可能由于結(jié)核分枝桿菌在組織中量少和分布不均，F(xiàn)Q-PCR檢測時切片中已無結(jié)核分枝桿菌。一般情況下，TB-DNA呈陽性而抗酸染色呈陰性，這是由于PQ-RCR檢測TB-DNA有較高的靈敏度和特異度。本研究中使用的TB-DNA檢測試劑盒，組織中有1～10個結(jié)核分枝桿菌時就可以檢測出來，而體液或組織中需有更多的結(jié)核分枝桿菌存在時[9]，抗酸染色才能檢測出來。多數(shù)情況下，抗酸染色和TB-DNA的檢測符合率較好，在臨床病理檢測中，兩種方法常聯(lián)合檢測，互相印證。本研究中兩種方法檢測的一致符合率達(dá)到84.18%，證明兩者在組織層面對結(jié)核病的診斷有相輔相成的重要價值。FQ-PCR技術(shù)檢測組織中TB-DNA已有較高的檢出率，但也有部分標(biāo)本由于取材有限、組織中結(jié)核分枝桿菌較少、DNA提取或定量試劑盒的不同、使用抗結(jié)核藥物等因素，TB-DNA在肉芽腫性炎組織中檢測仍可能造成漏診，其中也有假陰性的問題。數(shù)字微滴PCR部分解決了這個問題[10]，據(jù)文獻(xiàn)報道，使用數(shù)字微滴PCR技術(shù)可以使TB-DNA的檢出率明顯提升，但該技術(shù)尚未應(yīng)用于臨床。

本研究還比較了病例檢測組織中TB-DNA與其影像、其他實驗室檢查資料之間的關(guān)系。本實驗數(shù)據(jù)顯示，TB-DNA在檢出結(jié)核陽性病例方面要優(yōu)于CT影像，但與T-SPOT.TB、IGRAs和結(jié)核分枝桿菌特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)等實驗室檢查相比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，與文獻(xiàn)報道的數(shù)據(jù)[11-12]略有不同，主要原因可能是樣本量的大小、標(biāo)本種類和檢測方法的差異。盡管TB-DNA是病原學(xué)檢測，后三者是基于機(jī)體細(xì)胞免疫反應(yīng)的不同免疫學(xué)檢測方法，但在臨床上分別為高度提示結(jié)核分枝桿菌感染的直接和間接證據(jù)，本研究為首次報道。

綜上所述，常規(guī)運用抗酸染色和PQ-PCR技術(shù)檢測TB-DNA在肉芽腫性炎組織中檢測結(jié)核分枝桿菌的存在，對結(jié)核相關(guān)疾病的早期診斷和治療有重要的價值，但由于存在的許多困難仍無法完全克服，開發(fā)和使用更先進(jìn)的技術(shù)，聯(lián)合使用影像、多種實驗室檢查項目等，必會使結(jié)核病的早期診斷和規(guī)范化治療成為現(xiàn)實。