肖曄，盧芯儀，任天宇，鄒雄，劉忠群，高瑞麗，謝曦，王蓉，宋彥廷，胡文婷*

（1.海南大學(xué)熱帶生物資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，生命科學(xué)與藥學(xué)院，海南 ?？?570228；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，上海 200090）

長(zhǎng)莖葡萄蕨藻（Caulerpa lentillifera）屬綠藻門(mén)（Chlorophyta），蕨藻科蕨藻屬，主要生長(zhǎng)在中國(guó)、日本、菲律賓、越南等國(guó)家的亞熱帶和熱帶海域[1]。長(zhǎng)莖葡萄蕨藻是高價(jià)值的海水養(yǎng)殖藻類(lèi)新品種，是一種天然可食用的綠色海藻。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，長(zhǎng)莖葡萄蕨藻富含海藻多糖、不飽和脂肪酸、礦物質(zhì)和維生素等成分[2]，并且有增強(qiáng)免疫、降血壓、降膽固醇、抗氧化、抗炎、抑菌等多種潛在活性作用[3]，具有較好的營(yíng)養(yǎng)和藥用開(kāi)發(fā)價(jià)值。

胰脂肪酶是催化脂肪水解為甘油、脂肪酸等的關(guān)鍵酶，通過(guò)抑制其活性可延緩飲食中脂肪的水解，降低脂肪酸等的吸收，從而達(dá)到治療或預(yù)防肥胖的目的[4]。α-葡萄糖苷酶是碳水化合物在人體消化吸收的一種關(guān)鍵酶，其通過(guò)斷裂α-1，4糖苷鍵剪切下葡萄糖來(lái)參與糖代謝，當(dāng)其活性受到抑制時(shí)可延遲與減少人體對(duì)葡萄糖吸收，達(dá)到降低餐后血糖的效果[5]。目前常用的胰脂肪酶和α-葡萄糖苷酶抑制劑，如奧司利他、阿卡波糖等，長(zhǎng)期使用往往引起胃脹氣、腹瀉等副作用[6-7]。為了更好地預(yù)防和控制血脂和血糖異常的發(fā)生，尋找毒副作用低且效果良好的天然胰脂肪酶及α-葡萄糖苷酶等關(guān)鍵代謝酶的抑制劑已成為研究熱點(diǎn)。長(zhǎng)莖葡萄蕨藻富含多種小分子活性成分，如蕨藻紅素、黃酮、萜類(lèi)、多酚等[8-10]，這些成分使長(zhǎng)莖葡萄蕨藻具備發(fā)揮多種生物活性的基礎(chǔ)。

目前關(guān)于長(zhǎng)莖葡萄蕨藻對(duì)胰脂肪酶及α-葡萄糖苷酶抑制活性的研究鮮有報(bào)道。本研究以長(zhǎng)莖葡萄蕨藻醇提物的不同溶劑萃取物為對(duì)象，測(cè)定其中的黃酮、多酚及萜類(lèi)含量，以對(duì)胰脂肪酶及α-葡萄糖苷酶的抑制能力為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)相關(guān)性分析探究長(zhǎng)莖葡萄蕨藻中可能存在活性的組分，并探討抑制能力最強(qiáng)萃取物的作用機(jī)制，以期為長(zhǎng)莖葡萄蕨藻在維持血糖穩(wěn)定方面的應(yīng)用及相關(guān)功能性食品的開(kāi)發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮長(zhǎng)莖葡萄蕨藻樣品：由海南文昌養(yǎng)殖場(chǎng)提供；α-葡萄糖苷酶（1 000 U/mL）、沒(méi)食子酸：北京索萊寶科技有限公司；胰脂肪酶（30 U/mg）、脫氧膽酸鹽：上海源葉生物科技有限公司；阿卡波糖（≥98%）、對(duì)硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（p-nitrophenyl α-D-glucopyranoside，PNPG）、對(duì)硝基苯酚（p-nitrophenol，PNP）、二甲基亞砜、無(wú)水碳酸鈉、阿拉伯樹(shù)膠、異丙醇、4-硝基苯棕櫚酸酯（p-nitrophenyl palmitate，PNPP）、香草醛、齊墩果酸、福林酚（均為分析純）：上海麥克林生化科技有限公司；奧利司他（分析純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；三羥甲基氨基甲烷（分析純）：廣州賽國(guó)生物科技有限公司；磷酸鹽緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS）：武漢賽維爾生物科技有限公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器

VGT-1730QTD7超聲波清洗機(jī)：廣東固特超聲股份有限公司；5430R離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf公司；ME140E電子分析天平：瑞士METTLER TOLEDO公司；181003E酶標(biāo)儀：美國(guó)BioTek公司；F-4700熒光分光光度計(jì)：日本HITACHI公司；HH-2恒溫水浴鍋：江蘇科析儀器有限公司；DHG-9140A臺(tái)式恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；PHS-3CepH計(jì)：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；SIM-F140AY65-PCe制冰機(jī)：普和希健康醫(yī)療器械有限公司；UV/V1系列紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海翱藝有限公司。

1.3 方法

1.3.1 長(zhǎng)莖葡萄蕨藻醇提物的不同溶劑萃取物的制備

新鮮長(zhǎng)莖葡萄蕨藻洗凈、曬干，加入液氮研磨成粉末。以10倍體積的95%乙醇為溶劑，15℃超聲浸提40 min，超聲波功率為100 W，反復(fù)浸提3次。濾液合并后45℃減壓旋蒸至浸膏狀，加入少量去離子水重懸，依次用3倍量的石油醚、乙酸乙酯、水飽和正丁醇充分萃取，濃縮并干燥各萃取液得到長(zhǎng)莖葡萄蕨藻醇提物的石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物及萃取后剩余的水萃取物。以上樣品儲(chǔ)存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 多酚含量測(cè)定

以沒(méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，福林酚法測(cè)定樣品中多酚含量[11]。

1.3.3 萜類(lèi)含量測(cè)定

以齊墩果酸為標(biāo)準(zhǔn)品，香草醛-冰醋酸-濃硫酸法測(cè)定萜類(lèi)含量[12]。

1.3.4 黃酮含量測(cè)定

以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，亞硝酸鈉-硝酸鋁法測(cè)定黃酮含量[13]。

1.3.5 胰脂肪酶活性抑制活性試驗(yàn)

參考文獻(xiàn)[14]的方法，對(duì)胰脂肪酶的抑制活性進(jìn)行測(cè)定。取長(zhǎng)莖葡萄蕨藻醇提物的不同溶劑萃取物，以二甲基亞砜復(fù)溶為100mg/mL母液，用三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽溶液Tris-HCl（50 mmol/L，pH8.0，0.1%阿拉伯樹(shù)膠粉，0.2%脫氧膽酸鈉）稀釋至不同濃度作為測(cè)試樣液。采用比色法測(cè)定胰脂肪酶抑制活性，依次加Tris-HCl（pH8.0）75 μL、樣品溶液30 μL、36 U/mL胰脂肪酶75 μL于1.5 mL離心管中，于臺(tái)式恒溫鼓風(fēng)干燥箱中37℃氣浴反應(yīng) 10 min，再加入 0.2 mg/L PNPP 150 μL，氣浴37℃反應(yīng)15 min。待反應(yīng)結(jié)束后4 500 r/min離心5 min，取上清200 μL于405 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD），以?shī)W利司他做陽(yáng)性對(duì)照，平行測(cè)定3次。按照下列公式計(jì)算抑制率。

抑制率/%=[1-（OD3-OD4）/（OD1-OD2）]×100

式中：OD1為空白對(duì)照組吸光度；OD2為空白對(duì)照組背景吸光度；OD3為樣液組吸光度；OD4為樣液組背景吸光度。

1.3.6 α-葡萄糖苷酶抑制活性測(cè)試

參考文獻(xiàn)[15]的方法進(jìn)行，對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性進(jìn)行測(cè)定。取長(zhǎng)莖葡萄蕨藻醇提物的不同溶劑萃取物，以二甲基亞砜（99.5%）復(fù)溶為100 mg/mL母液，用PBS（0.5 mol/L、pH6.8）稀釋至不同濃度作為測(cè)試樣液。采用微孔板法測(cè)定α-葡萄糖苷酶抑制活性，在96孔板上依次滴加磷酸緩沖液（pH6.8）40 μL、20 μL 樣品溶液、1.2 U/mL α-葡萄糖苷酶 20 μL，37 ℃反應(yīng) 10 min，加入 0.375 mmol/L PNPG 20 μL，振蕩搖勻，37 ℃反應(yīng)15 min。加入 80 μL 0.2 mol/L 的 Na2CO3溶液，于 405 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD），以阿卡波糖做陽(yáng)性對(duì)照，平行測(cè)定3次，抑制率的計(jì)算公式同1.3.5中的公式。

1.3.7 抑制動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)

對(duì)胰脂肪酶的抑制動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)反應(yīng)體系同1.3.5。參考文獻(xiàn)[16]的方法進(jìn)行。測(cè)定不同質(zhì)量濃度（0、0.625 mg/mL） 的樣品在不同 PNPP 濃度（0.05、0.075、0.1、0.15、0.2 mg/mL）反應(yīng)體系中的反應(yīng)速率。對(duì) α-葡萄糖苷酶的抑制動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)反應(yīng)體系同1.3.6，測(cè)定不同質(zhì)量濃度（0、0.08 mg/mL）的樣品在不同PNPG濃度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL）反應(yīng)體系中的反應(yīng)速率。分別以反應(yīng)初速率的倒數(shù)（1/V0）為Y軸，濃度的倒數(shù)（1/[S]）為X軸繪制Lineweave-Burk雙倒數(shù)圖，經(jīng)圖形特征判斷其是競(jìng)爭(zhēng)性抑制、非競(jìng)爭(zhēng)性抑制或反競(jìng)爭(zhēng)性抑制類(lèi)型。抑制動(dòng)力學(xué)按下列公式計(jì)算Lineweaver-Burk曲線方程。

式中：V為酶促反應(yīng)初速度，mmol/（L·min）；Km為米氏常數(shù)，mmol/L；Vmax為最大酶促反應(yīng)速率，mmol/（L·min）；[S]為底物濃度，mmol/L。

1.3.8 對(duì)酶相互作用的熒光分析

對(duì)胰脂肪酶相互作用的熒光分析參考文獻(xiàn)[17]的方法進(jìn)行，取 0.2 mL 不同濃度樣品（0、0.312、0.625、1.25、2.5、3.5、5 mg/mL）和 0.5 mL 濃度為 36 U/mL 的胰脂肪酶溶液，用Tris-HCl（pH8.0）緩沖液補(bǔ)足至1 mL，混合均勻，分別在273、298、310 K3個(gè)溫度下靜置15min，于熒光分光光度計(jì)中檢測(cè)，設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)為290 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5 nm，掃描得到310 nm～450 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的熒光光譜。

對(duì)α-葡萄糖苷酶相互作用的熒光分析參考文獻(xiàn)[18]的方法進(jìn)行，取0.5 mL不同濃度樣品（0、0.007 5、0.03、0.06、0.3 mg/mL）和 0.5 mL 濃度 1.2 U/mL 的 α-葡萄糖苷酶溶液，混合均勻，在273、298、310 K 3個(gè)溫度下靜置15 min后放置于熒光池中，設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為2.5 nm，掃描得到300 nm～450 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的熒光光譜。

熒光猝滅過(guò)程采用下列Stern-Volmer方程[18]進(jìn)行判斷。

式中：F0為初始體系熒光強(qiáng)度；F為加入猝滅劑后的體系熒光強(qiáng)度；Kq為熒光猝滅速率，L/（mol·s）；τ0為無(wú)猝滅劑時(shí)物質(zhì)的熒光平均壽命，約為10-8s；Ksv為熒光猝滅常數(shù)，mL/mg；[Q]為猝滅劑濃度，mg/mL。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法

通過(guò)SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，組間差異按方差分析進(jìn)行檢驗(yàn)，最小顯著性差異法作兩兩比較，p＜0.05表示差異顯著。Graphpad prism 8作圖，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 長(zhǎng)莖葡萄蕨藻醇提物的不同溶劑萃取物中多酚、萜類(lèi)、黃酮含量分析

長(zhǎng)莖葡萄蕨藻經(jīng)石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水處理得到4種不同極性萃取物，由于溶劑的極性不同，不同萃取物的成分存在較大差異，長(zhǎng)莖葡萄蕨藻醇提物的不同溶劑萃取物中多酚、萜類(lèi)、黃酮含量見(jiàn)表1。

表1 長(zhǎng)莖葡萄蕨藻醇提物的不同溶劑萃取物中多酚、萜類(lèi)、黃酮含量Table 1 Content of polyphenols，terpenoids and flavonoids in Caulerpa lentillifera alcohol extracts by different solvents mg/g

由表1可知，4個(gè)樣品中，乙酸乙酯萃取物的多酚含量（23.79 mg/g）和萜類(lèi)含量（214.29 mg/g）最高，黃酮含量較高。石油醚萃取物中黃酮含量最高（3.27 mg/g），多酚含量（13.41 mg/g）和萜類(lèi)（182.41 mg/g）含量?jī)H次于乙酸乙酯萃取物。正丁醇和水層萃取物中多酚、萜類(lèi)和黃酮含量明顯較低。乙酸乙酯從長(zhǎng)莖葡萄蕨藻醇提取物中富集的多酚類(lèi)和萜類(lèi)成分含量最高，石油醚對(duì)其中的黃酮類(lèi)物質(zhì)富集效果最佳。通過(guò)分步萃取，長(zhǎng)莖葡萄蕨藻醇提物中多酚、萜類(lèi)和黃酮成分得到初步的分離純化。

2.2 長(zhǎng)莖葡萄蕨藻醇提物的不同溶劑萃取物對(duì)胰脂肪酶、α-葡萄糖苷酶的抑制作用

長(zhǎng)莖葡萄蕨藻醇提物的不同溶劑萃取物對(duì)胰脂肪酶的抑制作用見(jiàn)圖1。

圖1 長(zhǎng)莖葡萄蕨藻醇提物的不同溶劑萃取物對(duì)胰脂肪酶的抑制作用Fig.1 Inhibitory effect of Caulerpa lentillifera alcohol extracts by different solvents on pancreatic lipase

由圖1可知，長(zhǎng)莖葡萄蕨藻醇提物的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇及水萃取物對(duì)胰脂肪酶均有一定的抑制作用。石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取物隨質(zhì)量濃度增加抑制效果逐漸增強(qiáng)，而當(dāng)質(zhì)量濃度高于一定值后逐漸達(dá)到平臺(tái)期，繼續(xù)增大質(zhì)量濃度抑制率增加不明顯。水萃取物隨質(zhì)量濃度增加，對(duì)胰脂肪酶的抑制作用表現(xiàn)出先升后降的趨勢(shì)。安歡等[19]對(duì)苦瓜提取物的研究顯示當(dāng)苦瓜提取物質(zhì)量濃度大于30 mg/mL時(shí)，對(duì)胰脂肪酶的抑制能力也表現(xiàn)出明顯的下降。推測(cè)造成這種結(jié)果的原因可能是由于水萃取物中同時(shí)還存在對(duì)兩種消化酶活力具有促進(jìn)作用的物質(zhì)，多種成分共同影響了與酶之間的相互作用結(jié)果。

長(zhǎng)莖葡萄蕨藻醇提物的不同溶劑萃取物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用見(jiàn)圖2。

圖2 長(zhǎng)莖葡萄蕨藻醇提物的不同溶劑萃取物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用Fig.2 Inhibitory effect of Caulerpa lentillifera alcohol extracts by different solvents on α-glucosidase

由圖2可知，隨著質(zhì)量濃度的增大，長(zhǎng)莖葡萄蕨藻醇提物的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取物對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制程度均整體提高，且當(dāng)各萃取物質(zhì)量濃度超過(guò)一定值后，隨著濃度的增大，抑制率的提高逐漸趨于平緩。

使用最小二乘法擬合曲線計(jì)算各萃取物對(duì)胰脂肪酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用的IC50值，具體見(jiàn)表2。

表2 不同樣品對(duì)胰脂肪酶與α-葡萄糖苷酶的抑制作用比較Table 2 Inhibitory effects of different samples on pancreatic lipase and α-glucosidase

由表2可知，乙酸乙酯萃取物對(duì)胰脂肪酶抑制作用最強(qiáng)，其IC50為1.662 mg/mL，高于奧利司他（IC50=0.014 mg/mL），對(duì)α-葡萄糖苷酶也表現(xiàn)出最強(qiáng)的抑制作用，其IC50為0.017 mg/mL，高于陽(yáng)性對(duì)照品阿卡波糖（IC50=0.001 mg/mL）。不同萃取物對(duì)胰脂肪酶與α-葡萄糖苷酶抑制率具有顯著性差異，當(dāng)樣品質(zhì)量濃度為5 mg/mL時(shí)，對(duì)胰脂肪酶抑制率大小依次為乙酸乙酯萃取物＞石油醚萃取物＞水萃取物＞正丁醇萃取物。當(dāng)樣品質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL時(shí)，各萃取物對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率大小依次為乙酸乙酯萃取物＞正丁醇萃取物＞石油醚萃取物＞水萃取物。

從天然食品來(lái)源中獲得的消化酶抑制劑大多具有較溫和的作用效果。陳永麗等[20]對(duì)桑葉多糖的胰脂肪酶抑制作用研究表明其IC50為10.32 mg/mL，活性遠(yuǎn)低于相同條件下的陽(yáng)性對(duì)照奧司利他（IC50為0.47 mg/mL）。滕俊英等[21]對(duì)苦蕎麥提取物的α-葡萄糖苷酶的抑制作用研究結(jié)果顯示其IC50為241.79 mg/L，活性低于同條件下的陽(yáng)性對(duì)照阿卡波糖。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，由于奧利司他對(duì)胰脂肪酶抑制能力強(qiáng)，會(huì)干擾正常脂肪代謝，長(zhǎng)期服用往往出現(xiàn)胰腺炎、胃腸脹氣等副作用。阿卡波糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的強(qiáng)烈抑制作用會(huì)導(dǎo)致未消化的碳水化合物異常發(fā)酵，引起腹痛、腹瀉等胃腸道功能紊亂[6-7]。長(zhǎng)莖葡萄蕨藻醇提物的萃取物由天然可食藻類(lèi)經(jīng)初步分離獲得，具有相對(duì)溫和有效的抑制活性，可能對(duì)胃腸道的刺激較小，在開(kāi)發(fā)天然降脂降糖功能性食品方面是一種優(yōu)質(zhì)的候選原料。

2.3 不同溶劑萃取物中多酚、萜類(lèi)、黃酮含量與胰脂肪酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性的相關(guān)性分析

長(zhǎng)莖葡萄蕨藻醇提物的不同溶劑萃取物中多酚、萜類(lèi)、黃酮含量與胰脂肪酶、α-葡萄糖苷酶抑制活性的相關(guān)性見(jiàn)表3。

表3 不同溶劑萃取物多酚、萜類(lèi)、黃酮含量與胰脂肪酶、α-葡萄糖苷酶抑制活性的相關(guān)性Table 3 Pearson's correlation of content of polyphenols，flavonoids，and terpenoids of Caulerpa lentillifera extracts by different solvents with inhibitory activities against pancreatic lipase and α-glucosidase

如表3所示，萃取物中多酚、萜類(lèi)含量與胰脂肪酶酶抑制率差異顯著（p＜0.05），萃取物中多酚含量與α-葡萄糖苷酶抑制率差異顯著（p＜0.05），因此，推測(cè)長(zhǎng)莖葡萄蕨藻中對(duì)胰脂肪酶活性起抑制作用的主要活性成分可能為多酚與萜類(lèi)物質(zhì)；對(duì)α-葡萄糖苷酶活性起抑制作用的主要活性成分可能為多酚類(lèi)物質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，天然來(lái)源的小分子化合物具有多重降脂降糖藥理作用，其中對(duì)糖脂代謝中某些關(guān)鍵酶活性的調(diào)節(jié)是重要的途徑之一[22-23]。三萜酸類(lèi)成分熊果酸和齊墩果酸是許多蔬菜水果和中藥中的活性成分[24]，對(duì)血脂和血糖的調(diào)節(jié)作用明顯，已經(jīng)證明它們具有很高的胰脂肪酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性。周一鳴等[25]的研究表明苦蕎中的黃酮類(lèi)物質(zhì)蘆丁和槲皮素對(duì)α-葡萄糖苷酶及α-淀粉酶活性具有抑制作用，存在治療糖尿病的潛力。柳余莉等[26]的研究發(fā)現(xiàn)楊梅中的多酚類(lèi)物質(zhì)能顯著抑制α-葡萄糖苷酶活性。研究表明由天然產(chǎn)物分離得到的多酚、黃酮、萜類(lèi)物質(zhì)與降脂降糖活性明顯相關(guān)[27-28]，這些小分子物質(zhì)是挖掘生物活性的重要對(duì)象。

2.4 長(zhǎng)莖葡萄蕨藻醇提物的乙酸乙酯萃取物對(duì)胰脂肪酶、α-葡萄糖苷酶抑制動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)

根據(jù)抑制劑結(jié)合酶的特點(diǎn)，通過(guò)Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖及其相關(guān)參數(shù)，可判斷抑制劑對(duì)酶的抑制類(lèi)型。酶的可逆抑制類(lèi)型一般分為4種，分別為競(jìng)爭(zhēng)性抑制（Vmax不變，Km增大）、非競(jìng)爭(zhēng)性抑制（Vmax減小，Km不變）、反競(jìng)爭(zhēng)性抑制（Vmax減小，Km減?。┖突旌闲鸵种疲╒max減小，Km增大或減?。?。

因長(zhǎng)莖葡萄蕨藻醇提物的乙酸乙酯萃取物對(duì)胰脂肪酶與α-葡萄糖苷酶的抑制作用最強(qiáng)，并且其中與酶抑制作用相關(guān)性最強(qiáng)的多酚和萜類(lèi)物質(zhì)含量最高，因此以其為對(duì)象進(jìn)行酶抑制動(dòng)力學(xué)研究。長(zhǎng)莖葡萄蕨藻醇提物的乙酸乙酯萃取物對(duì)胰脂肪酶抑制作用見(jiàn)圖3，對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用見(jiàn)圖4，其具體動(dòng)力學(xué)參數(shù)見(jiàn)表4。

表4 胰脂肪酶與α-葡萄糖苷酶的抑制動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 4 Inhibitory kinetic parameters of pancreatic lipase and α-glucosidase

圖3 長(zhǎng)莖葡萄蕨藻醇提物的乙酸乙酯萃取物對(duì)胰脂肪酶抑制作用的Lineweaver-Burk曲線Fig.3 Lineweaver-Burk curves of inhibitory effect of Caulerpa lentillifera alcohol extract by ethyl acetate on pancreatic lipase

圖4 長(zhǎng)莖葡萄蕨藻醇提物的乙酸乙酯萃取物對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用的Lineweaver-Burk曲線Fig.4 Lineweaver-Burk curves of inhibitory effect of Caulerpa lentillifera alcohol extract by ethyl acetate on α-glucosidase

由圖3可知，兩條斜率不同的直線相交于X軸。在反應(yīng)體系中添加長(zhǎng)莖葡萄蕨藻醇提物的乙酸乙酯萃取物后最大反應(yīng)速率Vmax由58.207 mmol/（L·min）減小至47.687 mmol/（L·min），而米氏常數(shù)Km基本保持不變（表4）。長(zhǎng)莖葡萄蕨藻醇提物的乙酸乙酯萃取物對(duì)胰脂肪酶抑制類(lèi)型符合非競(jìng)爭(zhēng)性抑制特征，表明其不與底物競(jìng)爭(zhēng)酶活性中心，而是與酶的其他基團(tuán)進(jìn)行結(jié)合，既可以與胰脂肪酶形成復(fù)合物，又可以與胰脂肪酶-底物形成復(fù)合物，進(jìn)而影響底物的分解。此抑制類(lèi)型的抑制程度取決于乙酸乙酯萃取物的質(zhì)量濃度，底物的濃度不會(huì)影響對(duì)胰脂肪酶的抑制程度。

由圖4可知，采用Lineweaver－Burk雙倒數(shù)作圖，得到兩條斜率基本相同的直線。在反應(yīng)體系中添加長(zhǎng)莖葡萄蕨藻醇提物的乙酸乙酯萃取物后最大反應(yīng)速率Vmax由17.578mmol/（L·min）減小至2.572mmol/（L·min），米氏常數(shù)Km由1.818 mmol/L減小至0.284 mmol/L（表4）。長(zhǎng)莖葡萄蕨藻醇提物的乙酸乙酯萃取物對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制類(lèi)型符合反競(jìng)爭(zhēng)性抑制特征，說(shuō)明其不與酶單獨(dú)結(jié)合，而是在酶與底物結(jié)合后，與胰脂肪酶-底物形成復(fù)合物，進(jìn)而影響底物的分解。此抑制類(lèi)型的抑制程度同時(shí)取決于乙酸乙酯萃取物的質(zhì)量濃度與底物的濃度。當(dāng)前報(bào)道的天然產(chǎn)物來(lái)源的具有酶抑制活性的物質(zhì)種類(lèi)繁多，涉及醌類(lèi)、萜類(lèi)、皂苷類(lèi)、黃酮類(lèi)、酚類(lèi)、脂肪酸類(lèi)等多種結(jié)構(gòu)的化合物[29]。抑制劑結(jié)構(gòu)的不同可能是造成不同抑制類(lèi)型的原因。

2.5 長(zhǎng)莖葡萄蕨藻醇提物乙酸乙酯萃取物與胰脂肪酶、α-葡萄糖苷酶相互作用的熒光分析

長(zhǎng)莖葡萄蕨藻醇提物的乙酸乙酯萃取物對(duì)胰脂肪酶相互作用的熒光分析見(jiàn)圖5，對(duì)α-葡萄糖苷酶的相互作用的熒光分析見(jiàn)圖6，其具體動(dòng)力學(xué)參數(shù)見(jiàn)表5。

表5 胰脂肪酶與α-葡萄糖苷酶的Stern-Volmer方程及參數(shù)Table 5 Stern-Volmer equations and parameters of pancreatic lipase and α-glucosidase

圖5 不同溫度下長(zhǎng)莖葡萄蕨藻醇提物的乙酸乙酯萃取物對(duì)胰脂肪酶熒光光譜Fig.5 Fluorescence spectra of Caulerpa lentillifera alcohol extract by ethyl acetate against pancreatic lipase at different temperatures

圖6 不同溫度下長(zhǎng)莖葡萄蕨藻醇提物的乙酸乙酯萃取物對(duì)α-葡萄糖苷酶熒光光譜Fig.6 Fluorescence spectra of Caulerpa lentillifera alcohol extract by ethyl acetate against α-glucosidase at different temperatures

蛋白質(zhì)中的芳香族氨基酸，如色氨酸、酪氨酸等，在特定激發(fā)波長(zhǎng)下可以發(fā)出不同的熒光。若受到其他條件的干擾，相應(yīng)的熒光發(fā)射峰會(huì)出現(xiàn)藍(lán)移和紅移的現(xiàn)象，據(jù)此可以判斷物質(zhì)與酶之間是否存在相互作用。

由圖5和圖6可知，在273、298 K和310 K 3種溫度下，當(dāng)激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm時(shí)，胰脂肪酶最大發(fā)射峰（λmax）在343.8 nm附近，α-葡萄糖苷酶最大發(fā)射峰（λmax）在337.2 nm附近。當(dāng)在反應(yīng)體系中加入不同濃度的長(zhǎng)莖葡萄蕨藻醇提物的乙酸乙酯萃取物時(shí)，胰脂肪酶及α-葡萄糖苷酶的熒光強(qiáng)度呈劑量依賴(lài)性降低，且最大發(fā)射峰發(fā)生移動(dòng)。胰脂肪酶最大發(fā)射峰從343.8 nm移動(dòng)到361.2 nm，發(fā)生輕微的紅移。α-葡萄糖苷酶最大發(fā)射峰從337.2 nm移動(dòng)到330.8 nm，發(fā)生輕微的藍(lán)移。這種現(xiàn)象表明長(zhǎng)莖葡萄蕨藻醇提物的乙酸乙酯萃取物與胰脂肪酶和α-葡萄糖苷酶之間均存在互作，改變酶的構(gòu)型使氨基酸殘基逐漸暴露于水相，所在環(huán)境極性發(fā)生變化，從而使酶的催化活性降低。

熒光猝滅機(jī)制主要包括兩種[30]，靜態(tài)猝滅與動(dòng)態(tài)猝滅。通過(guò)變溫試驗(yàn)，建立Stern-Volmer方程判斷長(zhǎng)莖葡萄蕨藻醇提物乙酸乙酯萃取物與α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶之間的猝滅機(jī)制，分別在273、298 K和310 K 3種不同溫度下研究了兩種酶的熒光變化。由表5可知，隨著溫度的升高，長(zhǎng)莖葡萄蕨藻醇提物乙酸乙酯萃取物對(duì)胰脂肪酶和α-葡萄糖苷酶的熒光猝滅常數(shù)Ksv值降低，對(duì)胰脂肪酶的Ksv由1.179 mL/mg降低至1.105 mL/mg，對(duì)α-葡萄糖苷酶的Ksv由3.693 mL/mg降低至2.377 mL/mg，說(shuō)明其與胰脂肪酶和α-葡萄糖苷酶是通過(guò)形成復(fù)合物的方式發(fā)生靜態(tài)猝滅。

3 結(jié)論

試驗(yàn)結(jié)果表明，長(zhǎng)莖葡萄蕨藻醇提物的不同萃取物對(duì)胰脂肪酶和α-葡萄糖苷酶均具有抑制作用，其中長(zhǎng)莖葡萄蕨藻醇提物乙酸乙酯萃取物的抑制作用最強(qiáng)，且抑制作用呈濃度依賴(lài)性。多酚和萜類(lèi)物質(zhì)在石油醚與乙酸乙酯萃取物中含量較多，黃酮類(lèi)物質(zhì)在石油醚萃取物中含量較多。對(duì)胰脂肪酶的抑制作用與多酚和萜類(lèi)含量顯著相關(guān)，對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用與多酚含量顯著相關(guān)。長(zhǎng)莖葡萄蕨藻醇提物乙酸乙酯萃取物對(duì)胰脂肪酶的抑制類(lèi)型為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制，對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制類(lèi)型為反競(jìng)爭(zhēng)性抑制，對(duì)胰脂肪酶與α-葡萄糖苷酶的猝滅方式均為靜態(tài)猝滅。胰脂肪酶與α-葡萄糖苷酶作為人體重要的消化酶，在生物體消化吸收脂肪與碳水化合物的過(guò)程中發(fā)揮重要功能，長(zhǎng)莖葡萄蕨藻可以抑制這兩種消化酶的活性，從而在維持血糖穩(wěn)定方面起到一定作用。長(zhǎng)莖葡萄蕨藻在開(kāi)發(fā)成輔助降脂降糖的功能性食品方面具有一定的潛力。