陳俊宏，馮文哲

作者單位：1陜西中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，陜西 咸陽 712000；2陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院肛腸科，陜西 咸陽 712000

肛瘺是指直腸或肛管與周圍皮膚相連通形成的瘺管，是肛門直腸間隙感染性疾病的慢性期。手術(shù)作為其治療的首選方案，以瘺管切除術(shù)或切開掛線最為常見，將慢性閉合性傷口轉(zhuǎn)化為急性開放性傷口，進(jìn)而允許愈合級(jí)聯(lián)重新開始，最后進(jìn)展至完成組織修復(fù)。然而，由于肛門部位容易受到細(xì)菌的感染，特別是糞便中的大腸桿菌，如何有效地抑制傷口的炎癥反應(yīng)、促進(jìn)傷口的愈合，就成了術(shù)后護(hù)理的重要問題［1］。因此，探尋肛瘺術(shù)后創(chuàng)面炎癥機(jī)制、促進(jìn)創(chuàng)面組織的修復(fù)和愈合至關(guān)重要。

外泌體是一種在各種體液中廣泛分布［2-3］的細(xì)胞間信息傳輸載體，以胞吐的方式分泌，具有膜性囊泡結(jié)構(gòu)，可以包裹DNA、RNA、特定蛋白、脂肪等生物活性物質(zhì)［4-5］。作為一種具備巨大潛在前景的物質(zhì)，它已經(jīng)為眾多疾病的診斷、治療和預(yù)后提供了新思路。外泌體通過釋放其中生物活性物質(zhì)，在免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)和腫瘤微環(huán)境的建立等方面發(fā)揮重要作用［6-7］。并且以其為載體的MicroRNA（miRNA）已被各種報(bào)道證明，作為一系列生理、病理過程中的參與者，其在眾多生物學(xué)活動(dòng)中起著重要的調(diào)控作用。故本研究以外泌體源性miRNA 作為研究重點(diǎn)，通過探討肛瘺術(shù)后創(chuàng)面的愈合過程和回顧外泌體、miRNA 的生物學(xué)機(jī)制，為抑制肛瘺術(shù)后創(chuàng)面炎癥和促進(jìn)創(chuàng)面愈合提供新的研究思路。

1 肛瘺創(chuàng)面愈合機(jī)制

眾所周知，創(chuàng)面愈合是一個(gè)復(fù)雜的動(dòng)態(tài)生理過程，主要分為3個(gè)階段：炎癥期、增殖期和重塑期［8-9］，包括局部炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖及肉芽組織形成和組織重建。這個(gè)過程經(jīng)歷結(jié)構(gòu)蛋白與生長(zhǎng)因子、蛋白激酶的交互作用，以及修復(fù)后細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等。肛瘺術(shù)后創(chuàng)面組織的愈合同樣如此，即細(xì)胞增殖、膠原基質(zhì)分泌、纖維形成和肉芽組織再生等環(huán)節(jié)。據(jù)報(bào)道，在肛瘺術(shù)后創(chuàng)面愈合中起到關(guān)鍵作用的主要是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）介導(dǎo)的膠原纖維合成和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）介導(dǎo)的新生血管生成［10］。并且有研究報(bào)道，內(nèi)源性TGF-β1、VEGF 在肛瘺術(shù)后創(chuàng)面肉芽組織中存在表達(dá)，可以提示二者在肛瘺術(shù)后創(chuàng)面愈合過程中發(fā)揮重要作用［11］。其中，VEGF 是一種促血管化因子，它能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、分化和遷移，從而加速血管形成和保持血管的正常狀態(tài)［12］。而在慢性、難愈合傷口的修復(fù)過程中，新生血管是非常重要的，過低的血管化會(huì)嚴(yán)重影響肉芽組織新生和上皮再生［13-15］。另外，TGF-β1 是公認(rèn)的對(duì)成纖維細(xì)胞具有強(qiáng)效誘導(dǎo)作用的因子，能促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖，刺激分泌膠原纖維，誘導(dǎo)合成細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，為肉芽組織的形成創(chuàng)造良好的條件［16］。

除此之外，術(shù)后的炎癥反應(yīng)也是創(chuàng)面愈合的重要影響因素，例如白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-4，一種由Th2 淋巴細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，誘導(dǎo)機(jī)體釋放大量的炎癥介質(zhì)，進(jìn)而引起局部免疫反應(yīng)的增加［17］。IL-17作為炎癥反應(yīng)的重要指標(biāo)，可誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)因子的聚集，最終加劇炎癥反應(yīng)。腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α），是啟動(dòng)機(jī)體炎癥反應(yīng)的因子，同樣可通過誘導(dǎo)炎癥介質(zhì)聚集，從而誘發(fā)炎癥反應(yīng)。不僅如此，在謝昌營(yíng)等［18］研究中發(fā)現(xiàn)，肛瘺模型大鼠創(chuàng)面的肉芽組織中VEGF、低氧誘導(dǎo)因子-1（hypoxia-Inducible Factors-1，HIF-1）、胎盤生長(zhǎng)因子（placental growth factor，PLGF）、促血管生成素-Ⅰ（angiopoietin-Ⅰ，Ang-Ⅰ）、促血管生成素-Ⅱ（ang-Ⅱ）等血管生長(zhǎng)相關(guān)因子表達(dá)降低，而IL-1β、IL-2、前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）等炎癥相關(guān)因子表達(dá)升高。近年來，血管生成、炎癥反應(yīng)等與創(chuàng)面愈合密切相關(guān)因素的研究方向正不斷向細(xì)胞、分子層面深入，這不妨給予一些啟示：從細(xì)胞間通信、分子機(jī)制來解決肛瘺病人術(shù)后創(chuàng)面愈合的難題。

2 外泌體簡(jiǎn)介

2.1 外泌體的來源外泌體，一種納米級(jí)的囊泡，首次被發(fā)現(xiàn)于成熟哺乳動(dòng)物的網(wǎng)織紅細(xì)胞中，并于1981年由Trams命名［19］。其生物合成涵括了細(xì)胞膜內(nèi)吞形成內(nèi)體、多囊泡體的合成及釋放等過程，牽涉諸多信號(hào)分子的調(diào)控，具體分子機(jī)制尚不完全清楚；但已有研究［20］報(bào)道稱，在外泌體的分泌過程中，Rab 蛋白家族成員起著重要的調(diào)控作用，并且不同類型細(xì)胞激活外泌體合成、分泌的方式存在不同。目前可知的是，外泌體主要由哺乳動(dòng)物分泌，且能穩(wěn)定存在于血液、尿液、腦脊液等多種體液中，這一優(yōu)點(diǎn)為它的提取提供了有利條件。

2.2 外泌體的結(jié)構(gòu)外泌體是一種磷脂雙分子層的膜性囊泡，內(nèi)含DNA、RNA、蛋白質(zhì)等生物活性物質(zhì)，其中miRNA 的研究目前已成為熱點(diǎn)。而外泌體穩(wěn)定的脂質(zhì)結(jié)構(gòu)，不僅能保護(hù)其內(nèi)物質(zhì)不受外界環(huán)境的侵?jǐn)_，并且可以通過特定蛋白的調(diào)控，作為miRNA等分子的載體，參與細(xì)胞間的通信活動(dòng)。

2.3 外泌體的生物學(xué)特性眾多研究表明，不同來源外泌體攜帶的分子同樣具備組織特異性，且病變細(xì)胞能比正常細(xì)胞分泌更多的外泌體［21］。它的生物學(xué)機(jī)制主要有以下三種方式：（1）黏附于細(xì)胞膜上，以配體-受體的途徑激活下游信號(hào)通路［22］；（2）將內(nèi)容物（蛋白、mRNA 及miRNA 等）以不同方式向靶細(xì)胞內(nèi)吞噬中，從而讓靶細(xì)胞功能和表型變化；（3）將內(nèi)容物轉(zhuǎn)運(yùn)到目標(biāo)細(xì)胞的細(xì)胞膜上，并于細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮作用［23］。此外，外泌體能夠誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，例如腫瘤細(xì)胞來源的外泌體，能與Toll 樣受體（toll like receptors，TLRs）結(jié)合，啟動(dòng)核因子-κB（nuclear factor κB，NF-κB）信號(hào)通路，進(jìn)而促進(jìn)TNF-α、IL-6、粒細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte colony stimulating factor，G-CSF）、CC 趨化因子配體2［Chemokine （C-C motif） ligand 2，CCL2］等炎性因子的分泌［24］。而且Vrijsen 等［25］研究證明，外泌體與組織修復(fù)密切相關(guān)，干細(xì)胞來源外泌體可通過其內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metollo proteinases，MMP）誘導(dǎo)因子的高表達(dá)，激活細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶/蛋白激酶B（extracellular signal-regulated kinase/Protein kinase B，ERK/AKT）信號(hào)通路，最終介導(dǎo)血管網(wǎng)的形成和內(nèi)皮細(xì)胞的遷移。

3 miRNA的效應(yīng)機(jī)制

3.1 miRNA 的簡(jiǎn)介miRNA 是一種18-25bp 長(zhǎng)度的非編碼RNA，主要通過與靶mRNA 3'端非編碼區(qū)（3'Untranslated Regions，3'UTR）的互補(bǔ)核苷酸序列結(jié)合，抑制靶mRNA 的翻譯或降解，從而調(diào)控受體細(xì)胞的多種生物學(xué)過程［26］。近期研究［27-29］顯示，miRNA 無論是在炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖、組織重建過程中都有著關(guān)鍵作用。

3.2 miRNA 負(fù)性調(diào)控炎癥反應(yīng)炎癥是機(jī)體在受到病原體感染或組織損害時(shí)激活的保護(hù)性反應(yīng)，通常伴隨著炎性因子的產(chǎn)生以及相關(guān)信號(hào)通路的活化。其中，CCL2是一種調(diào)節(jié)單核細(xì)胞浸潤(rùn)和遷移的炎癥細(xì)胞因子，與促炎因子IL-1β 和TNF-α 的表達(dá)呈正相關(guān)［30］，而在一項(xiàng)有關(guān)增生型糖尿病視網(wǎng)膜病變（proliferative diabetic retinopathy，PDR）的研究中發(fā)現(xiàn)，血清外泌體miR-106能通過降低CCL2表達(dá)從而抑制炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)［31］。不僅如此，與細(xì)胞增殖、炎癥反應(yīng)密切相關(guān)的NF-κB 信號(hào)通路，會(huì)誘導(dǎo)一系列細(xì)胞因子的表達(dá)，進(jìn)而刺激炎癥反應(yīng)［32-33］；而作為其上游重要調(diào)節(jié)因子的TLR4，能將細(xì)胞外刺激（脂多糖、病毒、炎性細(xì)胞）傳遞到胞內(nèi)，且通過下游的調(diào)控，阻斷NF-κB 信號(hào)通路的激活，達(dá)成與之相反的結(jié)果，最終抑制炎癥反應(yīng)。據(jù)報(bào)道，miR-182-5p 和miR-106a 均能下調(diào)TLR4 表達(dá)，并通過阻斷NF-κB 信號(hào)通路的活化，使TNF-α、IL-6、IL-1b等促炎因子的釋放減少，起到抑制炎癥反應(yīng)的效果［34-35］。盡管如此，但這一過程不是單向的，有研究表明miRNA 與炎癥反應(yīng)之間存在負(fù)性調(diào)控，例如由于NF-κB 的激活，miR-9 的表達(dá)被上調(diào)，同時(shí)NFκB 即Nfkb1/p50 亞基又是miR-9 的靶標(biāo)，因此miR-9能與NF-κB 的mRNA 結(jié)合并抑制其翻譯，導(dǎo)致NFκB表達(dá)減弱［36］，類似的負(fù)性調(diào)控讓炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)變得更為精巧。

而且，某些miRNA 調(diào)控炎癥反應(yīng)的過程，與DNA 甲基化關(guān)聯(lián)密切。部分炎性因子如IL、TNF-α等均可擾亂DNA 甲基化轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltr ansferase，DNMT）的表達(dá)，導(dǎo)致異常甲基化，最終影響炎性因子自身的表達(dá)，達(dá)到調(diào)控炎癥的目的。而DNMT1表達(dá)的下調(diào)能引起miR-193a-5p基因激活子區(qū)低甲基化，使hsa-miR-193a-5p 表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而抑制炎癥［37］。另外，miRNA也能負(fù)性調(diào)節(jié)DNA甲基化的程度，例如miR-21 以RAS 鳥苷核苷酸釋放蛋白1（ras guanyl nucleotide releasing protein 1，RAS GRP1）的途徑為靶點(diǎn)，間接抑制DNMT1 的表達(dá)，使T 細(xì)胞的DNA低甲基化［38］。

3.3 外泌體源性miRNA的應(yīng)用miRNA的非侵入性和穩(wěn)定性正成為臨床疾病診斷和治療的新途徑。一項(xiàng)有關(guān)糖尿病足感染的研究［39］中，病人血清中存在部分miRNA 表達(dá)水平的差異，例如miR-155 呈較高表達(dá)，但相對(duì)的miR-21、miR-132 的表達(dá)水平偏低。這一結(jié)果說明，在糖尿病足感染慢性炎癥的過程中，miR-155 可能發(fā)揮促炎作用，而miR-21、miR-132 卻是起到抑制炎癥的作用。不但如此，通過比較結(jié)果的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，miR-155、miR-21 和miR-132與血小板衍生生長(zhǎng)因子BB（platelet derived growth factor BB，PDGF-BB）、堿性成纖維生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）等創(chuàng)面修復(fù)因子存在一定相關(guān)性，提示上述miRNA 在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)因子中起著重要作用，從而促進(jìn)皮膚的創(chuàng)面愈合。

此外，有研究報(bào)道，miRNA-126 對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞中血管細(xì)胞黏附因子1（vascular cell adhesion molecule 1，VCAM-1）的表達(dá)存在抑制作用，因此可通過降低miRNA-126 的表達(dá)來增強(qiáng)白細(xì)胞黏附，最終達(dá)到緩解牙周炎癥的目的；并且學(xué)者通過敲除斑馬魚miRNA-126 基因的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-126 還能調(diào)控SPRED-1 等牙周炎的相關(guān)靶基因進(jìn)而影響局部血管的生成［40］。

4 外泌體源性miRNA與肛瘺術(shù)后創(chuàng)面愈合

4.1 肛瘺愈合的關(guān)聯(lián)因素肛瘺的創(chuàng)面愈合可能與組織學(xué)、微生物學(xué)和分子因素等交互作用相關(guān)，然而尚不清楚哪一種因素與創(chuàng)面愈合存在更密切的聯(lián)系。早在20 世紀(jì)，Lunniss 等［41］分析了18 例瘺管切除標(biāo)本中的內(nèi)括約肌成分瘺管內(nèi)襯，發(fā)現(xiàn)7 例標(biāo)本為移行區(qū)上皮，5 例為復(fù)層鱗狀上皮，1 例為混合鱗狀和柱狀上皮，其余5 例無上皮。盡管作者沒有將上皮形成程度與臨床結(jié)果相關(guān)聯(lián)，但他們假設(shè)上皮形成可能與創(chuàng)面的愈合相關(guān)。而在Mitalas等［42］的研究中，對(duì)接受直腸推進(jìn)皮瓣（rectal advance flap，RAF）修復(fù)的44 例遠(yuǎn)端瘺管標(biāo)本進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)11 例上皮形成，并認(rèn)為內(nèi)襯上皮的存在不影響RAF 修復(fù)的結(jié)果。由此可見，創(chuàng)面組織的纖維化程度與愈合是否存在聯(lián)系還需進(jìn)一步證據(jù)闡明。

細(xì)菌在慢性創(chuàng)面中并不常見，也尚不清楚它對(duì)傷口愈合的影響。在Seow-Choen 等［43］的實(shí)驗(yàn)中，從18 例肛瘺病人（不包括炎癥性腸病和急性化膿病人）的刮宮樣本采集肉芽組織，發(fā)現(xiàn)最常見的類型為腸源性細(xì)菌：大腸桿菌（22%）、脆弱芽孢桿菌（20%）和腸球菌（16%）?；谏鲜鼋Y(jié)果，他們推測(cè)，肛瘺的慢性炎癥不是由過多的微生物導(dǎo)致的。另一項(xiàng)研究［44］對(duì)克羅恩和特發(fā)性瘺管進(jìn)行了活檢，在32 份標(biāo)本中，僅發(fā)現(xiàn)一份含有與管壁關(guān)聯(lián)的細(xì)菌，由此作者得出結(jié)論，瘺管并不含有高水平的黏膜相關(guān)細(xì)菌。盡管如此，有研究證明，細(xì)菌中成分可能在慢性炎癥中扮演重要角色。一項(xiàng)試點(diǎn)研究［45］中，10 個(gè)肛瘺里檢測(cè)出9 個(gè)含有肽聚糖（細(xì)菌細(xì)胞壁成分），作者認(rèn)為肽聚糖可能對(duì)炎癥有影響，但由于樣本量小，并不能確定臨床結(jié)果與肽聚糖表達(dá)之間的關(guān)系。

近年來，肛瘺創(chuàng)面炎癥和愈合更趨向于用炎癥機(jī)制來解釋。在Ratto等［46］的研究中，對(duì)瘺管組織間的細(xì)胞因子和微生物肽進(jìn)行了比較，與正常肛周皮膚和黏膜相比，發(fā)現(xiàn)瘺管組織無論近端或遠(yuǎn)端均強(qiáng)烈表達(dá)IL-1β 和IL-8，并且還顯示pERK 和NF-κB 兩種信號(hào)通路的高表達(dá)，而上述細(xì)胞因子和信號(hào)通路都與炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)相關(guān)。不但如此，Van onkelen等［47］在27 例接受保留括約肌修復(fù)術(shù)的病人中，分析了瘺管遠(yuǎn)端部分8種細(xì)胞因子的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)4種促炎細(xì)胞因子在標(biāo)本中表達(dá)：IL-1β（93%）、IL-8（70%）、IL-12p40（33%）和TNF-α（30%）。但是，他們無法將細(xì)胞因子表達(dá)的差異與手術(shù)結(jié)果聯(lián)系起來。

4.2 干細(xì)胞衍生外泌體治療復(fù)雜性肛瘺干細(xì)胞由于具備免疫調(diào)節(jié)、組織修復(fù)等優(yōu)點(diǎn)，正逐漸成為部分疾病治療的潛在方案。然而，干細(xì)胞治療仍面臨許多問題，如移植細(xì)胞的低存活率、異質(zhì)性等。在創(chuàng)傷修復(fù)中，干細(xì)胞的功能與其旁分泌能力密切相關(guān)，而其旁分泌的方式主要以外泌體釋放的途徑來實(shí)現(xiàn)。最近有研究稱，間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）衍生的外泌體具有穩(wěn)定性、低免疫原性等優(yōu)點(diǎn)，而且和MSCs 有著相似的作用，同樣具備修復(fù)組織、抑制炎癥反應(yīng)和調(diào)節(jié)免疫等功能［48］。目前，有文獻(xiàn)報(bào)道應(yīng)用脂肪干細(xì)胞（adipose stem cells，ASCs）治療肛腺感染性肛瘺、克羅恩肛瘺和直腸陰道瘺等復(fù)雜性肛瘺均取得了良好的臨床療效［49］。ASCs可通過誘導(dǎo)促炎因子減少，并且使抗炎因子增加，緩解創(chuàng)面局部的炎癥反應(yīng)；同時(shí)還能以自分泌和旁分泌的途徑分泌相關(guān)細(xì)胞因子，激活成纖維細(xì)胞，促進(jìn)血管新生，肉芽組織形成，最終加速創(chuàng)面邊緣上皮化［50］。研究表明，在這一系列創(chuàng)面愈合相關(guān)的過程中，ASCs來源的外泌體發(fā)揮了重要作用［51-55］。

4.3 miRNA 促進(jìn)肛瘺創(chuàng)面愈合miRNA 作為一種調(diào)節(jié)各類生理病理過程的小分子RNA，已被大量研究證實(shí)在皮膚創(chuàng)面愈合中起到了顯著作用，而尋找疾病特征性miRNA 及其作用靶點(diǎn)或者相關(guān)通路是揭示其生物學(xué)功能的關(guān)鍵步驟。蔡濤等［56］選擇6例高位復(fù)雜性肛瘺病人并行手術(shù)治療，將切除的瘺管組織標(biāo)本和瘺管遠(yuǎn)端正常組織標(biāo)本作配對(duì)對(duì)比，采用高通量測(cè)序技術(shù)篩選出瘺管組織中差異表達(dá)miRNA。其中，與遠(yuǎn)端正常組織的miRNA 表達(dá)水平相比，瘺管組織中hsa-miR-2355-3p 的表達(dá)水平是正常組織的7.07 倍，hsa-miR-3910 的表達(dá)水平是正常組織的3.01 倍；然而hsa-miR-1277-3p 在瘺管壁組織中的表達(dá)水平卻只有正常組織的8%，hsa-miR-616-5p 的表達(dá)水平僅占正常組織的10%。同時(shí)，研究者通過TargetScan、miRanda 兩個(gè)數(shù)據(jù)庫對(duì)所有差異表達(dá)miRNA 進(jìn)行了靶基因預(yù)測(cè)以及后續(xù)交叉靶基因的GO和KEGG富集分析，發(fā)掘出大批與創(chuàng)面愈合密切關(guān)聯(lián)的信號(hào)通路，例如Ras、MAPK、PI3K-Akt、cAMP 等，以上通路的抑制可能是肛瘺術(shù)后創(chuàng)面難愈的原因。即便如此，目前有關(guān)肛瘺差異表達(dá)miRNA 的研究報(bào)道仍相當(dāng)有限，以特征性miRNA 的靶標(biāo)為切入點(diǎn)，調(diào)控信號(hào)通路和生物學(xué)過程依然有待后續(xù)實(shí)驗(yàn)證明。

4.4 肛瘺創(chuàng)面滲液來源外泌體miRNA的提取、鑒定

4.4.1創(chuàng)面滲液外泌體的提取與鑒定 選擇符合低位單純性肛瘺診斷標(biāo)準(zhǔn)病人60例，行低位單純性肛瘺切除術(shù)后，隨機(jī)均分為藥膏組、康復(fù)新液組和凡士林組三組，分別采用藥膏紗條、康復(fù)新液紗條和凡士林紗條術(shù)后創(chuàng)面換藥，每日早晚各1 次。于術(shù)后第3、5、7、9 天，換藥時(shí)收集創(chuàng)面外周敷料置入30 mL 的0.9%氯化鈉溶液中，靜置5 min，取浸出液過濾。在4 ℃下5 000g離心5 min，去除底層固體雜質(zhì)，留取上清，用DMEM 以1∶10 體積比例稀釋，0.22μm 孔徑濾膜過濾除菌，置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩ｏ@微鏡下觀察炎癥細(xì)胞分布并計(jì)數(shù)；ELISA 法檢測(cè)創(chuàng)面滲液中炎性因子IL-4、IL-10、TGF-β、IL-1β、IL-6、TNF-α 的表達(dá)水平。采用QIAGEN 公司的exoEasy Maxi Kit 外泌體提取試劑盒提取滲液中的外泌體，透射電子顯微鏡觀察外泌體的純度和形態(tài)，納米顆粒跟蹤分析法檢測(cè)外泌體的粒徑和濃度，蛋白質(zhì)印跡法鑒定外泌體相關(guān)蛋白標(biāo)志物CD9 和CD63 的表達(dá)。

4.4.2miRNA 的提取與靶基因預(yù)測(cè) 分別提取各組外泌體總RNA，采用Exiqon miRCURY LNA Universal RT microRNA PCR 芯片（Exiqon 公司）檢測(cè)各組創(chuàng)面滲液中外泌體的差異表達(dá)miRNA，篩選相關(guān)核心miRNA。采用Targetscan、Pictar、MiRanda 數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)差異miRNAs 的靶基因，篩選并確定目標(biāo)miRNA-mRNA調(diào)控對(duì)以備功能驗(yàn)證。

4.5 創(chuàng)面滲液來源外泌體miRNA 加速肛瘺術(shù)后愈合近年來，外泌體源性miRNA 越來越頻繁用于抑制炎癥、促進(jìn)創(chuàng)面愈合，其主要來源依舊是通過干細(xì)胞分離。據(jù)報(bào)道［57］稱，與不愈合的慢性傷口相比，愈合慢性傷口滲液中含有更豐富的細(xì)胞外囊泡（extracellular vesicles，EV），并且在傷口愈合的炎性階段，產(chǎn)生的EV 比正常皮膚高出6倍?；谏鲜鼋Y(jié)果，作者從愈合和非愈合病例分別提取了創(chuàng)面滲液，用來處理極化至M1 的人外周血單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞（monocyte-derived macrophages，MDMs），發(fā)現(xiàn)來自愈合病例的傷口滲液引起了細(xì)胞聚集，這正是細(xì)胞轉(zhuǎn)化的特征。因此，他們認(rèn)為，EVs是創(chuàng)傷部位細(xì)胞間通信的主要促進(jìn)因素。不僅如此，中醫(yī)也有煨膿長(zhǎng)肉促進(jìn)創(chuàng)面愈合的特色療法，其認(rèn)為膿由氣血所生，是機(jī)體正氣載毒排出的過程，是有利于創(chuàng)面愈合的“膿”［58］。有研究表明，煨出之膿不但含有創(chuàng)面組織中的壞死成分，還包含大量有利于創(chuàng)面愈合的巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等［59］。因此基于以上結(jié)果，我們可以大膽假設(shè)：創(chuàng)面滲液來源的外泌體miRNA 能夠抑制肛瘺術(shù)后創(chuàng)面炎癥并加速愈合。

5 結(jié)論和展望

目前外泌體源性miRNA 與創(chuàng)面炎癥、愈合相關(guān)的研究正在快速發(fā)展。已有部分文獻(xiàn)表明，外泌體攜帶的miRNA 在抑制肛瘺術(shù)后創(chuàng)面炎癥、加速愈合上均擁有不錯(cuò)的前景和潛力。外泌體作為細(xì)胞間通信的小分子載體，攜帶各種生物信息物質(zhì)，尤其是miRNA 在調(diào)控炎癥反應(yīng)和促進(jìn)創(chuàng)面愈合中發(fā)揮了顯著作用，其非侵入性、穩(wěn)定性和靶向性等優(yōu)點(diǎn)讓它為眾多疾病提供了新的診斷和治療方式。

盡管如此，外泌體源性miRNA 治療肛瘺術(shù)后創(chuàng)面炎癥的研究仍需要深入。首先，外泌體雖然能從各種體液里提取，但其純化和檢測(cè)依舊面臨一定挑戰(zhàn)，并且由于不同細(xì)胞分泌的外泌體存在差異性，而目前仍然以干細(xì)胞來源外泌體miRNA 為主要研究對(duì)象，這很可能影響其未來應(yīng)用的廣泛性。因而，拓展更多途徑的外泌體來源miRNA 以及探索其對(duì)不同疾病的作用機(jī)制至關(guān)重要。可以預(yù)見的是，隨著外泌體miRNA 和分子靶向研究的不斷深入，創(chuàng)面滲液來源外泌體miRNA 將成為抑制肛瘺術(shù)后創(chuàng)面炎癥、促進(jìn)愈合的新型治療方案。