王慧茹 劉會蘭

血小板在正常的凝血和止血過程中發(fā)揮重要作用。血小板輸注對于維持低血小板計數(shù)患者體內(nèi)平衡至關重要，血小板輸注無效（platelet transfusion refractoriness，PTR）是多次輸注患者常見的并發(fā)癥，具體表現(xiàn)為輸注血小板后血小板計數(shù)未如預期增長。如果患者在多次輸血后血小板計數(shù)無任何增長，則會出現(xiàn)危及生命的出血風險、住院時間延長和生存期降低等不良結(jié)局，以及醫(yī)療費用的增加［1-2］。PTR 患者因反復輸血也增加輸血安全問題，如非溶血性發(fā)熱反應、過敏反應、輸血相關的急性肺損傷、輸血相關的循環(huán)超負荷、細菌膿毒癥和溶血性反應等。因此，PTR 是需要反復輸注血小板患者面臨的一個重要臨床問題［3-4］。

目前認為，PTR 的發(fā)生取決于患者個體因素、疾病類型以及輸注血制品的白細胞去除等相關因素，其發(fā)生率文獻報道不一，通常被低估。早期文獻報道PTR 發(fā)生率為10%～27%，但在骨髓衰竭性疾病中發(fā)生率為30%～70%，在造血干細胞移植患者特別是臍血移植患者中發(fā)生更普遍。免疫及非免疫因素均可介導PTR，隨著血制品去白細胞的廣泛應用，免疫性PTR 發(fā)生率通常小于10%，在接受血小板輸血的患者中，免疫性PTR 發(fā)生率約4%～8%［5-8］，成為臨床血小板有效輸注的阻礙。

1 PTR的診斷

臨床認為，對血小板減少患者提供未經(jīng)選擇或隨機的血小板產(chǎn)品（單采或手工）用于最初的血小板輸血治療，重復輸注隨機供者血小板后未能獲得滿意的療效及血小板計數(shù)的增加，應懷疑PTR 可能，需要通過計算輸血后血小板計數(shù)的增長情況，但判斷PTR 的輸血后血小板增量的計算方法目前尚缺乏共識［9］。最常使用的計算公式和推薦指標包括：①輸血后增量（the post-transfusion increment，PI）；②血小板恢復百分比（the percentage platelet recovery，PPR）；③校正計數(shù)增量（the corrected count increment，CCI）。連續(xù)2 次輸注ABO 相合的新鮮（72 h內(nèi)）單采血小板結(jié)束后10～60 min 內(nèi)及16～24 h 采血進行血小板計數(shù)，評估2 次輸血后血小板增量PI 或CCI，均低于相應的值即可判定PTR。

PI 是最簡單的計算方法，即（輸注后-輸注前）的血小板計數(shù)，在臨床實踐中最常用。輸注后1 h 或24 h 的PI＞10 × 109/L則認為輸血有效；如未達到，則考慮輸注無效。PPR=PI × TBV ×PD-1×100，TBV 即全血容量［total blood volume （L）］，PD 即輸注血小板劑量（ platelet dose），通常每個單位單采血小板為4×1011/L；CCI=PI×BSA×PD-1，BSA 即體表面積。PPR 及CCI 因計算繁雜在臨床上應用較少，但為了糾正由于患者體質(zhì)量或輸注血小板的數(shù)量不同而引起的血小板數(shù)量變化，許多中心通過估計血站提供的標準血小板產(chǎn)品的血小板劑量（血站不常規(guī)提供每份單采血小板具體數(shù)據(jù)），來計算更準確的CCI 和PPR。輸血后1 h PPI ＜ 20%～30% 或CCI ＜5×109/L 或輸血后16～24 h PPI＜10%～20%或CCI＜4.5×109/L 即判定為PTR［9-10］。

2 非免疫因素PTR的診斷和處理

大多數(shù)慢性血小板減少血液病患者PTR 的原因復雜，免疫和非免疫因素可能同時存在，其中非免疫因素是導致PTR 的最常見原因，占80%左右。非免疫性PTR 最常見的原因有發(fā)熱或感染，或敗血癥、出血、彌漫性血管內(nèi)凝血、藥物（肝素、兩性霉素B、萬古霉素、兔抗人體胸腺球蛋白、干擾素等）、脾腫大、移植物抗宿主病以及血小板質(zhì)量差或儲存時間長等因素導致的血小板過渡消耗［11］。研究表明，血小板輸注后18～24 h 缺乏應答表明血小板存在潛在的外周消耗或脾臟扣留，而免疫因素可快速致血小板破壞，通常為輸血后1 h CCI＜7.5×109/L 和PI ＜ 5×109/L［12］，但根據(jù)輸血后不同時間（輸血后1 h 或24 h）的血小板計數(shù)來確定PTR 的發(fā)生原因尚未達成共識［13］。

與危重癥相關的臨床因素（非免疫因素）導致的PTR 往往難以避免，是臨床醫(yī)師面臨的重大挑戰(zhàn)。一旦確診PTR，臨床醫(yī)師應首先評估和治療潛在的非免疫因素，通過詳細病史資料和體格檢查通常來區(qū)分PTR 的原因，對于非免疫性PTR，應仔細評估患者出血的性質(zhì)和積極治療原發(fā)病，盡可能通過局部措施來處理局部出血，應用氨基己酸或氨甲環(huán)酸等抗纖溶藥物止血等。重復輸注血小板（單采或手工血小板）是一種不斷補充消耗的血小板而防治出血的方法，目前尚沒有證實某種特殊血小板產(chǎn)品可以減緩血小板在體內(nèi)的消耗而實現(xiàn)血小板輸血的最佳療效。

3 免疫相關PTR原因及處理

PTR 相關的免疫因素包括由于輸血、妊娠或移植暴露于人類白細胞抗原（human leukocyte antigen， HLA）和/或人類血小板抗原（human platelet antigen， HPA）引起的同種異體免疫。其他免疫因素包括ABO 血型不合、血小板自身抗體（如與血小板糖蛋白自身抗體相關的PTR）和藥物-血小板糖蛋白復合物抗體的產(chǎn)生。HLA 系統(tǒng)由高度多態(tài)性的細胞表面蛋白組成，這些蛋白在免疫反應中負責區(qū)分自我與非我，在免疫因素介導的PTR中，由HLA 抗體中介的PTR 占80%。輸血是HLA 抗體產(chǎn)生的重要原因。外周血液中淋巴細胞表面HLA 分子表達最高，每個淋巴細胞表面攜帶多達25 萬個HLA I 類分子，每個血小板表面攜帶5～12 萬個HLA I 類分子，而紅細胞表面極少表達HLA 分子，因此輸注血制品中白細胞殘留是輸血相關HLA 致敏的主要原因。多次輸血患者HLA 致敏的風險為23%。在抗HLA I 類分子抗體中，抗HLA-A 和抗HLA-B 是導致PTR 的主要抗體，而抗HLA-C 抗體較少導致PTR［14］。多次輸血的患者可能會在開始隨機輸血后6～8 周內(nèi)檢測到HLA 抗體，這些抗體只有在遇到帶有相關抗原的血小板輸血時才具有臨床意義。妊娠是HLA致敏的另一個主要原因，有研究［15］表明，1 次妊娠產(chǎn)生同種異體免疫的風險為11%，≥4 次妊娠的風險為32%。妊娠后產(chǎn)生的抗體，經(jīng)過多年或幾十年，抗體滴度可能會低于檢測閾值。實體器官移植和造血干細胞移植后也可能產(chǎn)生HLA 抗體從而導致PTR。除了接觸同種異體HLA 抗原的必要條件外，受者的免疫狀態(tài)則是決定是否發(fā)生同種異體免疫和產(chǎn)生HLA 抗體持續(xù)時間的關鍵。HLA 抗體檢測方法包括經(jīng)典的補體依賴的細胞毒試驗（complement-dependent cytotoxicity assays，CDC）、血小板粘附免疫熒光試驗（platelet adhesion immunofluorescence test，PAIFT）、單克隆抗體特異性固定血小板抗原試驗（monoclonal antibody-specific immobilisation of platelet antigens， MAIPA）以及Luminex 為平臺的微珠分析技術等，其中CDC 最經(jīng)典，但不夠敏感，而Luminex 微珠分析技術最敏感，但引起PTR 的HLA 抗體平均熒光強度（mean fluorescence intensity，MFI）界值尚不清楚。

已知HPA 有35 種，與HLA 系統(tǒng)相比，HPA 系統(tǒng)具有較少的抗原變異性，單獨由HPA 抗體引起的PTR 很少見。在2%～8%的多次輸血的血小板減少患者中存在HPA 抗原的同種異體免疫，且HPA 抗體通常與HLA 抗體伴隨存在［16］，這也反應了免疫性PTR 的復雜性。

3.1 免疫性PTR 的血小板輸注策略 輸注HLA 和/或HPA 匹配的血小板是免疫性PTR 患者血小板輸注治療的基礎，但HLA匹配血小板輸注依賴于獻血者HLA 配型資料和血小板資源是否充足［17］。對于免疫介導的PTR 患者預防性PLT 輸注的閾值目前也沒有明確的標準，多數(shù)情況下仍提倡在血小板計數(shù)低于10 × 109/L 時需要預防性輸注血小板，具體輸注策略可從以下方面考慮。

3.1.1 HLA-A、HLA-B 抗原匹配 從HLA-A 和HLA-B 抗原與患者相匹配的獻血者獲得單采血小板支持，可減少將來發(fā)生異體免疫的風險。這需要事先有患者HLA 基因配型數(shù)據(jù)或短時間內(nèi)能獲得HLA 配型結(jié)果，同時需要擁有大量獻血者的HLA配型資料和有充足庫存的血液中心（＞1 萬供者數(shù)據(jù)庫存）。對于不常見或罕見的HLA-A 和HLA-B 抗原的患者，很難獲得HLA 抗原匹配的血小板。要獲得HLA 抗原完全匹配的血小板不僅昂貴而且費時費力，很難滿足實際應用的需要［10］。目前國際上篩選HLA 完全匹配的血小板輸注只有少量臨床研究，尚沒有大規(guī)模開展。

3.1.2 HLA 抗體特異性回避血小板輸注 通過選擇患者HLA抗體靶向抗原陰性的血小板（即特異性抗體回避）輸注。提供兼容的血小板僅基于患者的HLA 抗體，而不需要與患者的HLA抗原相匹配。使用抗體特異性預測選擇缺乏相應抗原的供體時，介導PTR 的HLA 抗體MFI 閾值尚沒有達成共識，有研究發(fā)現(xiàn)致病性HLA 抗體MFI 界值（Luminex 方法）為3 000［18］。該方法的輸注效果與HLA 抗原匹配的方法相當，增加了可兼容的供者數(shù)量。然而這需要有患者定期檢測的HLA 抗體數(shù)據(jù)，以及一個龐大的HLA 型供體庫（＞1 萬供體），但是無法確保實現(xiàn)對廣泛免疫或罕見單倍型患者的完全匹配，方法既耗時又昂貴，且由于HLA 抗原不匹配具有進一步加重同種異體免疫的潛在風險。目前，國內(nèi)多家大型血液中心已經(jīng)建立了HLA 型供體庫，在鑒定PTR 患者HLA 抗體的基礎上可進行供體篩選。

3.1.3 HLA表位匹配+抗體回避 抗體回避策略是識別那些必須被排除在外的獻血者，但并非所有其他抗體未靶向的HLA 抗原對患者都可兼容。HLA 表位匹配（HLA epitope-matched，HEM）是確定可接受的HLA 抗原不匹配。HLA 抗原表位是利用等位基因水平分型，采用計算機計算在抗原表位水平上確定供體-受體相容性，利用HLA Matchmaker 軟件（http：//www.hlamatchmaker. Net）進行評估致敏患者的血清抗體反應性分析和搜尋可接受表位錯配的潛在供體，可降低成本和資源需求［19］。近期一項非劣效性、交叉、隨機試驗［20］支持了HEM 血小板輸注在HLA 抗體介導的PTR 患者中的作用，HEM 和標準的抗原匹配血小板輸血后1 小時PI 無明顯差異，血小板計數(shù)、輸血需要量和出血事件的次要結(jié)果也沒有差異，這表明HEM 的血小板可用于HLA 同種異體免疫的PTR 患者，比抗原匹配相比能更有效地利用血小板資源。

3.1.4 血小板交叉配型 交叉配型是獲得兼容血小板最快、最簡單的方法，在血小板和患者血清之間進行交叉配血，測試患者血清對一組血小板的反應以確定相容性，缺乏反應性的供者血小板被認為是“交叉配型兼容”，相關的血小板濃縮物是輸血的首選，多用于HLA 抗體百分比較低的患者。交叉配型的優(yōu)勢為獲得相容的血小板時間短，與HLA 和HPA 抗體相容，短期支持成本低（不需要HLA 分型或抗體鑒定）。主要缺點是難以為高度同種異體免疫的患者找到兼容的血小板；潛在的HLA 抗原不匹配可能在后期有發(fā)生同種異體免疫的風險，影響以后提供HLA 匹配的血小板。目前全國多家大型血液中心已經(jīng)為PTR的患者進行血小板交叉配型并獲得了較好地臨床反饋［21］。

3.1.5 HPA 匹配 當大多數(shù)交叉配型不匹配或HLA 匹配輸血失敗時，需要進行HPA 抗體檢測，盡管HPA 抗體引起的PTR 發(fā)生率很小。如果存在針對HPA 的抗體，需要招募已知血小板抗原表型的獻血者。患者的親屬可能與患者有相同的表型，應進行檢測。

3.1.6 其他有待證實的策略 ①血小板持續(xù)滴注。當免疫性PTR 患者沒有HLA/ HPA 兼容的血小板供體或持續(xù)出血的情況下，低劑量持續(xù)輸注ABO 同型單采血小板可能是有效治療和預防患者出血的手段［22-23］。②家庭成員血小板。因親緣關系，家庭成員有可能提供匹配良好的血小板單位。如果患者接受親屬供體的造血干細胞移植，受者針對供者次要HLA 抗原可能會產(chǎn)生抗體，有造成植入失敗的風險，因此進行親屬移植的候選者應盡量避免使用親屬血小板。③選擇HLA-I 類抗原低表達血小板。研究［24］表明，9%～34% 的供體血小板上HLA-B8、HLAB12 和HLA-B35 等抗原表達低或檢測不到，而HLA-Ⅰ類抗體介導的血小板破壞與HLA 抗原的表達密切相關，由于目前中心血站尚不能提供供體血小板HLA 抗原表達的數(shù)據(jù)，因此臨床尚不適用。④血小板吸附抗體策略。血小板高表達HLA 抗原，可先使用供體血小板來吸附患者血清或血漿中的HLA 抗體，如患者體內(nèi)存在很強的HLA-A2 抗體，反復輸注HLA-A2 抗原陽性血小板來耗盡抗體后，再輸入一個HLA-A2 陽性血小板單位，可提高血小板輸注效果。⑤補體抑制劑治療。補體激活可導致與HLA 抗體結(jié)合的血小板加速破壞，能夠固定補體的HLA 抗體（IgG1 和IgG3）更可能導致PTR。有研究顯示10 名PTR 患者接受了單次補體抑制劑eculizumab 治療，其中4 名（40%）患者克服了PTR，這提示補體抑制可能克服廣泛的HLA 同種免疫導致的PTR，進一步應用還需大規(guī)模的臨床試驗支持［25］。

由于血液病或移植患者發(fā)生PTR 的原因復雜，通常免疫與非免疫因素共存，因此，即使采用HLA 匹配的血小板輸注可能仍然無效。無論采用何種血小板制劑輸注，判斷輸注療效的指標均是輸血后血小板計數(shù)的增加（輸血后1 h 和24 h 的血小板計數(shù)）。通過監(jiān)測對HLA 抗原匹配血小板輸血后的血小板增量，可以第一時間提示已知的HLA 同種異體免疫的患者是否取得進展，如果有改善，應繼續(xù)使用HLA 抗原匹配血小板輸注；如果對HLA 抗原匹配的血小板輸注反應不佳，應再尋求原因，持續(xù)更新策略，以便后續(xù)輸血成功。

3.2 免疫相關PTR 的預防及展望 目前研究表明，使用白細胞減少的血液制品可減少輸血相關PTR 的發(fā)生。血制品輸注刺激機體免疫反應的機制仍不完全清楚，但與輸注的供體血制品的成分和受者的免疫狀態(tài)有關。血小板和白細胞輸注都可能導致HLA 同種異體免疫，去白細胞的血液成分輸注已被證明可以降低HLA 同種異體免疫反應的頻率和PTR。因此，最佳的預防策略是針對這兩種細胞。TRAP 研究表明，血制品去白細胞可導致HLA 同種異體免疫發(fā)生率下降（由45%降至17%～18%）和同種免疫性PTR 下降（由13% 降至3%～4%）［12］。在加拿大，普遍實施血制品去白細胞措施后，同種異體免疫率從19% 下降到7%，同種免疫性PTR 從14% 下降到4%［26］。然而，去白細胞并沒有完全消除這一問題，使殘余白細胞失活可能是消除或進一步減少同種異體免疫的解決方案［25］。病原體減少后的同種異體免疫減少尚未得到證實，病原體減少的血小板儲存導致高磷脂酰絲氨酸暴露，反而增加PTR 可能［27］。使用免疫抑制來改善PTR 患者的預后并非完全有效，有報告稱靜脈注射丙種球蛋白、利妥昔單抗、血漿置換和皮質(zhì)類固醇治療的成功率各有不同［28］。

綜上所述，PTR 是臨床亟待解決的問題，特別是在血小板資源緊缺的情況下，篩選HLA 和或HPA 匹配的血小板輸注更是難上加難。免疫性PTR 患者血小板輸注可以下方面作為切入點：①開發(fā)和建立基于DNA 檢測且同時提供RBC、HPA 和HLA等通用獻血者基因分型平臺及供者庫［29］。②采用人類iPSCs 產(chǎn)生的巨核細胞進行HLA I 類基因敲除，生成具有止血功能的HLA 通用型血小板，再在生物反應器中實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)［30］，未來可能會在輸血醫(yī)學領域開辟新的天地。