錢(qián) 進(jìn),鄭艷莉

(1.南通大學(xué)附屬如皋人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，江蘇南通 226500;2.南通大學(xué)第二附屬醫(yī)院/南通市第一人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，江蘇南通 226000)

子宮腺肌病(adenomyosis，ADS)是指子宮內(nèi)膜腺體和間質(zhì)侵入子宮肌層[1-2]，且周?chē)〖?xì)胞伴有代償性增生和肥大的特征，是一種具有惡性腫瘤特點(diǎn)的良性婦科疾病，也是現(xiàn)代婦科常見(jiàn)疾病之一，發(fā)病率高達(dá)21.5%。想要闡明ADS的發(fā)病機(jī)制，需要明確子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞是如何向肌層發(fā)生遷移和侵襲的，這也是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)和難點(diǎn)，現(xiàn)有大量研究發(fā)現(xiàn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)與上皮細(xì)胞如何向間質(zhì)細(xì)胞發(fā)生功能轉(zhuǎn)變[3]，繼而獲得遷移侵襲能力息息相關(guān)。

EMT是一個(gè)復(fù)雜的多步驟過(guò)程[4]，是多種細(xì)胞外信號(hào)與細(xì)胞內(nèi)的EMT下游信號(hào)通路及參與該過(guò)程的轉(zhuǎn)錄因子共同組成的復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，包括多條信號(hào)通路。在不同的細(xì)胞內(nèi)，這些信號(hào)通路的重要性各有不同。其中JAK/STAT3/TWIST信號(hào)通路是近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)的一條由細(xì)胞因子激活的信號(hào)傳導(dǎo)通路，主要參與細(xì)胞的増殖、凋亡及免疫調(diào)節(jié)。JAK/STAT3/TWIST信號(hào)通路的激活，在慢性炎癥和免疫抑制過(guò)程中起關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，在多種細(xì)胞系中可以通過(guò)激活JAK/STAT3/TWIST信號(hào)通路，提高間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志性蛋白N-cadherin和Vimentin表達(dá)，而E-cadherin表達(dá)下調(diào)，從而促進(jìn)了EMT的形成，可以說(shuō)JAK/STAT3/TWIST信號(hào)通路是EMT形成過(guò)程中被激活的關(guān)鍵信號(hào)傳導(dǎo)通路[5-6]。本研究探討JAK2/STAT3/TWIST信號(hào)通路在ADS EMT中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2020年3月至2021年3月南通大學(xué)附屬如皋人民醫(yī)院就診的35～55歲患者。因ADS行全子宮切除術(shù)且術(shù)后病理證實(shí)為ADS病例50例為試驗(yàn)組，所有患者均留取在位內(nèi)膜及異位內(nèi)膜組織，一部分組織福爾馬林固定待后續(xù)病理和免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)，另一部分組織-80 ℃凍存待后續(xù)分子實(shí)驗(yàn)。因子宮肌瘤行全子宮切除術(shù)且術(shù)后病理證實(shí)無(wú)子宮內(nèi)膜病變病例50例為對(duì)照組，取正常子宮內(nèi)膜組織。排除標(biāo)準(zhǔn)：有生殖器官惡性腫瘤疾病；近半年服用激素類(lèi)藥物；產(chǎn)后哺乳期；合并各種內(nèi)外科嚴(yán)重疾病。本研究經(jīng)南通大學(xué)附屬如皋人民醫(yī)院批準(zhǔn)(LW2110)，患者知情同意。

1.2 主要試劑

一抗E-cadherin 抗體(英國(guó)Abcam公司，ab40772)、N-cadherin 抗體(美國(guó)Proteintech公司，66219-1-lg)、JAK2 抗體 (美國(guó)Proteintech公司，17670-1-AP)、STAT3抗體(美國(guó)Proteintech公司，60199-1-lg)、TWIST2抗體(美國(guó)Proteintech公司，66544-1-lg)，二抗Rabbit anti-β-actin抗體(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，AF0003)，DAB顯色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司，AR1022)，聚合HRP標(biāo)記抗小鼠IgG(武漢博士德生物工程有限公司，SV0001)，聚合HRP標(biāo)記抗兔IgG(武漢博士德生物工程有限公司，SV0002)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(南京諾唯贊生物科技股份有限公司，R223-01)，SYBR-Green Master PCR Mix(南京諾唯贊生物科技股份有限公司，Q711-02/03)

1.3 方法

1.3.1石蠟切片

新鮮組織福爾馬林固定48 h。乙醇梯度脫水，二甲苯透明后浸蠟。制作組織石蠟塊，石蠟切片厚度4 μm，65 ℃烤片1 h。

1.3.2HE染色觀察病理變化

二甲苯3次各10 min，乙醇梯度脫蠟各5 min，蒸餾水5 min。蘇木素染色2 min，1%鹽酸乙醇分色1 s，水洗藍(lán)化20 min。50%乙醇5 min，70%乙醇5 min，80%乙醇5 min，伊紅染色2 s。乙醇梯度脫水，二甲苯透明，封片。

1.3.3免疫組織化學(xué)染色觀察E-cadherin、N-cadherin、JAK2、STAT3、TWIST的定位

切片脫蠟至水。H2O2孵育10 min，PBS洗5 min×3次。枸櫞酸鹽抗原熱修復(fù)，PBS洗5 min。5% BSA 37 ℃孵育30 min。滴加一抗(E-cadherin、N-cadherin抗體1∶250稀釋?zhuān)琂AK2抗體1∶50稀釋?zhuān)琒TAT3抗體1∶50稀釋?zhuān)琓WIST抗體1∶250稀釋)。4 ℃孵育過(guò)夜。PBS洗5 min×3次，二抗37 ℃孵育30 min。PBS洗5 min×3次，DAB顯色，蒸餾水終止顯色。蘇木素復(fù)染2 min。梯度脫水和透明，封片，隔天拍照。先低倍鏡觀察，選擇目標(biāo)區(qū)域高倍鏡下，隨機(jī)觀察5個(gè)視野，陽(yáng)性表達(dá)呈棕黃色。

1.3.4Western blot檢測(cè)E-cadherin、N-cadherin、JAK2、STAT3、TWIST蛋白表達(dá)

常規(guī)方法提取蛋白。配制分離膠及濃縮膠。蛋白上樣量為200 μg。電泳先80 V再120 V。300 mA 90 min轉(zhuǎn)膜。室溫封閉2 h。一抗(E-cadherin、N-cadherin抗體1∶2 000稀釋?zhuān)琂AK2抗體1∶500稀釋?zhuān)琒TAT3抗體1∶1 000稀釋?zhuān)琓WIST抗體1∶2 000稀釋)4 ℃過(guò)夜，PBST洗10 min×3次。二抗(1∶2 000稀釋)室溫90 min，PBST洗20 min×3次。ECL顯色。

1.3.5qRT-PCR檢測(cè)JAK2、STAT3、TWIST mRNA表達(dá)

Trizol法提取總RNA。根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和QRT-PCR。JAK2：上游引物5′-TCG CTG CCG AGG GAT GTG AG-3′，下游引物5′-TCT TGT TCC TGT TGC CTG CTT CTG-3′；STAT3：上游引物 5′-GAG GCA GGA GAA TCG CTT GAA CC-3′ 下游引物5′-TCT CAG ACT GTC GCC CAG GAT G-3′；TWIST：上游引物5′-CCA TCC TCA CAC CTC TGC ATT CTG-3′，下游引物5′-GGC TGA TTG GCA CGA CCT CTT G-3′；GAPDH：上游引物5′-ACC CAG AAG ACT GTG GAT GG-3′，下游引物5′-AGG GGT CTA CAT GGC AAC TG-3′。反應(yīng)體系：2×SYBR mix 10 μL，正向引物1 μL，反向引物1 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 7 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min 預(yù)變性；95 ℃ 15 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，共45個(gè)循環(huán)；溶解曲線分析：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。使用2-ΔΔCT法進(jìn)行相對(duì)定量分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 HE染色觀察ADS病理結(jié)構(gòu)

正常內(nèi)膜組織無(wú)明顯異常；在位內(nèi)膜組織內(nèi)膜腺體和間質(zhì)與肌層分界清晰，內(nèi)膜未入侵肌層；異位內(nèi)膜組織細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)均著色較淺，子宮內(nèi)膜腺上皮與間質(zhì)細(xì)胞侵入子宮肌層且形成增生見(jiàn)圖1。

圖1 HE染色觀察ADS病理結(jié)構(gòu)

2.2 免疫組織化學(xué)染色觀察EMT相關(guān)標(biāo)志物E-cadherin、N-cadherin的定位

E-cadherin、N-cadherin均特異性表達(dá)于子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的細(xì)胞膜上,見(jiàn)圖2。在位內(nèi)膜和異位內(nèi)膜中E-cadherin表達(dá)較正常內(nèi)膜明顯降低，且異位內(nèi)膜表達(dá)弱于在位內(nèi)膜，E-cadherin在異位內(nèi)膜中染色呈淡黃色，為弱陽(yáng)性表達(dá)。在位內(nèi)膜和異位內(nèi)膜中N-cadherin表達(dá)較正常內(nèi)膜明顯升高，且異位內(nèi)膜表達(dá)強(qiáng)于在位內(nèi)膜，N-cadherin在異位內(nèi)膜中染色呈棕黃色，為強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。

圖2 E-cadherin、N-cadherin在正常內(nèi)膜、在位內(nèi)膜和異位內(nèi)膜中的表達(dá)分布

2.3 Western blot檢測(cè)EMT相關(guān)標(biāo)志物E-cadherin、N-cadherin蛋白表達(dá)

與正常內(nèi)膜比較，在位內(nèi)膜、異位內(nèi)膜中E-cadherin蛋白表達(dá)降低(P<0.01)，在異位內(nèi)膜中下降更明顯(P<0.01)；在位內(nèi)膜、異位內(nèi)膜中N-cadherin蛋白表達(dá)升高(P<0.01)，在異位內(nèi)膜中升高更明顯(P<0.01)，見(jiàn)圖3。

A： 蛋白印跡圖；B：E-cadherin蛋白表達(dá)；C：N-cadherin蛋白表達(dá)。

2.4 qRT-PCR 檢測(cè)JAK2、STAT3、TWIST mRNA表達(dá)

與正常內(nèi)膜比較，在位內(nèi)膜、異位內(nèi)膜中JAK2/STAT3/TWIST mRNA表達(dá)升高(P<0.01)，在異位內(nèi)膜中升高更明顯(P<0.01)，見(jiàn)圖4。

A：JAK2 mRNA表達(dá)；B：STAT3 mRNA表達(dá)；C：TWIST mRNA表達(dá)。

2.5 Western blot檢測(cè)JAK2、STAT3、TWIST的蛋白表達(dá)

與正常內(nèi)膜比較，在位內(nèi)膜、異位內(nèi)膜中JAK2、STAT3、TWIST蛋白表達(dá)升高(P<0.01)，在異位內(nèi)膜中升高更明顯(P<0.01)，見(jiàn)圖5。

A：蛋白印跡圖；B：JAK2蛋白表達(dá)；C：STAT3蛋白表達(dá)；D：TWIST蛋白表達(dá)。

2.6 免疫組織化學(xué)染色觀察JAK2、STAT3、TWIST定位

JAK2、STAT3、TWIST主要特異性表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，見(jiàn)圖6。在位內(nèi)膜和異位內(nèi)膜中JAK2、STAT3、TWIST表達(dá)較正常內(nèi)膜明顯升高，異位內(nèi)膜表達(dá)強(qiáng)于在位內(nèi)膜，JAK2、STAT3、TWIST在異位內(nèi)膜中染色呈棕黃色，為強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。

圖6 JAK2、STAT3、TWIST在正常內(nèi)膜、在位內(nèi)膜和異位內(nèi)膜中的表達(dá)分布

3 討 論

ADS是現(xiàn)代婦科常見(jiàn)的良性疾病，也是常見(jiàn)的不孕原因之一[7]。ADS雖然是良性疾病，但其生物學(xué)特性具有惡性腫瘤的特質(zhì)，即可以遷移和侵襲，且極易復(fù)發(fā)[8]。

正常子宮內(nèi)膜組織中的細(xì)胞主要是上皮細(xì)胞，其具有極性，特征是細(xì)胞與細(xì)胞之間存在相對(duì)緊密的連接，這對(duì)維持組織結(jié)構(gòu)完整性和協(xié)調(diào)細(xì)胞功能有重要意義。而間質(zhì)細(xì)胞是間質(zhì)及結(jié)締組織的主要組成成分，其結(jié)構(gòu)松散，相對(duì)沒(méi)有極性，移動(dòng)性較高。這兩類(lèi)細(xì)胞不僅形態(tài)上，蛋白表達(dá)和功能更是有所差異。ADS正是上皮細(xì)胞的減少，間質(zhì)細(xì)胞的異常增多。ADS子宮內(nèi)膜特性的改變與EMT過(guò)程密切相關(guān)[9-10]，包括細(xì)胞外基質(zhì)降解、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞黏附和血管生成等因素，提示EMT可能參與ADS的發(fā)生和發(fā)展。在形態(tài)學(xué)方面，正常子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞具有規(guī)則且較大的細(xì)胞核，并且細(xì)胞和細(xì)胞之間排列規(guī)整和連續(xù)，而ADS子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞間的排列中斷[11]。ADS上皮細(xì)胞由橢圓形轉(zhuǎn)變?yōu)殚L(zhǎng)梭形，呈成纖維細(xì)胞樣。子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞形態(tài)的改變使細(xì)胞間接觸不穩(wěn)定，形成更易遷移和侵入的間質(zhì)表型。在分子表達(dá)方面，CAI等[12]報(bào)道，在ADS異位病灶中，EMT標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)降低且Vimentin表達(dá)升高，而E-cadherin轉(zhuǎn)錄抑制因子Snail表達(dá)升高，促進(jìn)ADS的發(fā)生和發(fā)展。在生物學(xué)功能方面，ADS是子宮內(nèi)膜細(xì)胞侵襲性增強(qiáng)的結(jié)果，由于在子宮內(nèi)膜和子宮肌層之間沒(méi)有基底膜，組織應(yīng)激損傷或局部組織炎癥引發(fā)EMT過(guò)程[13]。隨著ADS持續(xù)的過(guò)度活動(dòng)和慢性損傷，內(nèi)膜細(xì)胞持續(xù)增殖和慢性炎癥進(jìn)一步延緩了愈合過(guò)程，并導(dǎo)致病灶數(shù)目增加[14]。

本研究為了明確ADS中是否確實(shí)存在EMT現(xiàn)象，收集ADS患者在位和異位內(nèi)膜組織，且術(shù)后病理證實(shí)無(wú)其他病癥，并選取同期子宮肌瘤患者且病理證實(shí)無(wú)病變的子宮內(nèi)膜組織作為對(duì)照。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)E-cadherin和N-cadherin均特異性表達(dá)于細(xì)胞膜上。與正常內(nèi)膜比較，在位內(nèi)膜、異位內(nèi)膜中E-cadherin表達(dá)降低、N-cadherin表達(dá)升高，異位內(nèi)膜變化更明顯。這正是EMT發(fā)生的分子表達(dá)特征，說(shuō)明EMT可能參與了ADS的發(fā)病過(guò)程。

JAK/STAT信號(hào)通路最初是在研究干擾素對(duì)細(xì)胞的作用機(jī)制時(shí)被發(fā)現(xiàn)的[15]，JAK 屬于非受體酪氨酸激酶，STAT則是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子的統(tǒng)稱(chēng)。人體內(nèi)幾乎所有的細(xì)胞都有表達(dá) JAK[16]，在正常個(gè)體的胚胎發(fā)育進(jìn)程中必不可少，并在各類(lèi)細(xì)胞中廣泛表達(dá)，催化多種細(xì)胞因子誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)。細(xì)胞因子的水平、細(xì)胞膜上不同受體的表達(dá)差異，使得 JAK2/STAT3 活化后對(duì)免疫反應(yīng)和炎癥的雙向調(diào)節(jié)作用，既可增強(qiáng)免疫反應(yīng)又可抑制免疫反應(yīng)，維持正常的免疫穩(wěn)定狀態(tài)。STAT3的下游因子TWIST是堿性螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一[17]，其在胚胎發(fā)育過(guò)程中起著調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移的作用，它可以使上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為間充質(zhì)細(xì)胞，使細(xì)胞具有遷移轉(zhuǎn)移的能力[18]。大量研究表明，TWIST是誘導(dǎo)EMT發(fā)生的關(guān)鍵性調(diào)控因子和始動(dòng)因素[19]。TWIST作為EMT的主要轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)誘導(dǎo)EMT，使上皮細(xì)胞間連接橋梁E-cadherin的表達(dá)減少，從而增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞的侵襲性和轉(zhuǎn)移力，是EMT過(guò)程中的正性調(diào)節(jié)因子。TWIST還可以作為凋亡抑制蛋白參與EMT過(guò)程，促進(jìn)細(xì)胞遷移、侵襲、抗凋亡等，TWIST可通過(guò)抑制E-cadherin表達(dá)和誘導(dǎo)N-cadherin表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)EMT過(guò)程。還有研究發(fā)現(xiàn)，TWIST在子宮內(nèi)膜異位癥(EMs)的發(fā)病機(jī)制中也扮演了重要角色[20]，在EMs中TWIST的表達(dá)明顯上調(diào)，可能是通過(guò)誘導(dǎo)EMT引發(fā)的EMs。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)qRT-PCR、Western blot、免疫組織化學(xué)從基因表達(dá)、蛋白表達(dá)、定位檢測(cè)JAK2、STAT3、TWIST在正常內(nèi)膜、在位內(nèi)膜、異位內(nèi)膜中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)無(wú)論是基因表達(dá)還是蛋白表達(dá)，其表達(dá)趨勢(shì)一致，均特異性表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，且與正常內(nèi)膜比較，在位內(nèi)膜、異位內(nèi)膜中JAK2、STAT3、TWIST表達(dá)升高，異位內(nèi)膜變化更明顯?？梢?jiàn)JAK2/STAT3/TWIST信號(hào)通路的激活與ADS的發(fā)生密切相關(guān)，且可能促進(jìn)了ADS中EMT的發(fā)生。但JAK2/STAT3/TWIST信號(hào)通路又是如何促進(jìn)ADS中EMT的發(fā)生，它們之間又是如何協(xié)調(diào)的，其機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究。