彭契六，朱春玲，張 磊，韋尚謀，羅佳佳，甘麗英，張 智，韋邦寧

(1.廣西國際壯醫(yī)醫(yī)院檢驗科，南寧 530201；2.南寧市第一人民醫(yī)院肝膽外科,南寧 530022;3.廣西國際壯醫(yī)醫(yī)院肝膽外科,南寧 530201)

尋找肝癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的預(yù)警分子和預(yù)后標(biāo)志物，預(yù)防和降低術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率，已經(jīng)成為肝癌研究領(lǐng)域的熱點[1]。絲氨酸蛋白酶抑制劑A1(serine protease inhibitor A1,SERPINA1)是絲氨酸蛋白酶抑制劑家族的主要成員，主要由肝細(xì)胞合成[2]。SERPINA1具有強烈的催化反應(yīng)活性，主要通過與酶的活性部位結(jié)合，抑制酶的催化作用或阻止酶原轉(zhuǎn)化為活性酶，在調(diào)節(jié)酶活性和蛋白質(zhì)代謝，以及細(xì)胞生長、分化、運動和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方面發(fā)揮重要的作用[3]。近年的研究結(jié)果顯示，SERPINA1與胃癌、口腔扁平細(xì)胞癌和結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移預(yù)后相關(guān)[4-6]，但其在肝癌組織的表達及與肝癌患者預(yù)后的關(guān)系尚不清楚。本研究旨在分析肝癌組織中SERPINA1表達與肝癌患者術(shù)后轉(zhuǎn)移和預(yù)后的關(guān)系，并在HepG2細(xì)胞系中通過慢病毒轉(zhuǎn)染干擾SERPINA1表達，探討SERPINA1對肝癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的影響，為肝癌轉(zhuǎn)移的預(yù)防和早期干預(yù)提供新思路。

1 資料與方法

1.1 肝癌標(biāo)本

選取2013年1月至2016年6月在南寧市第一人民醫(yī)院肝膽外科行手術(shù)切除的肝癌病例68例和2019年1月至2019年8月在廣西國際壯醫(yī)醫(yī)院肝膽外科行手術(shù)切除的肝癌病例10例，肝癌切除術(shù)后收集肝癌組織和癌旁組織(癌組織與正常組織交界處2 cm以內(nèi))，-80 ℃保存?zhèn)溆?。納入的全部病例均經(jīng)病理確診為肝細(xì)胞癌。分析78例肝癌患者相關(guān)臨床資料，所有納入的病例均在入組前征得患者及其家屬的知情同意。本研究經(jīng)南寧市第一人民醫(yī)院倫理委員會(NNSY20160503)和廣西國際壯醫(yī)醫(yī)院倫理委員會(20181201)批準(zhǔn)。

1.2 細(xì)胞株和試劑

肝癌細(xì)胞株HepG2由中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院提供。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及實時熒光定量PCR(RT-PCR)試劑盒購自日本TaKaRa公司，E-鈣黏蛋白(E-cadherin)抗體購自美國Abcam公司，SERPINA1抗體、熒光二抗購自美國Santa Cruz公司，基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)、N-鈣黏蛋白(N-cadherin)單克隆抗體購自美國Sigma公司，24孔Transwell侵襲小室購自美國Corning公司，Matrigel購自美國BD公司。

1.3 方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞轉(zhuǎn)染

HepG2細(xì)胞采用DMEM培養(yǎng)基[含10%胎牛血清(FBS)]在37 ℃ 5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長至匯合度60%～70%，更換新鮮的培養(yǎng)基并加入適量的病毒懸液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，更換新鮮培養(yǎng)基，用嘌呤霉素篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。SERPINA1干擾RNA(siRNA)目標(biāo)序列為5′- GAA CUC ACC CAC GAU AUC A-3′和5′- GAU GAA GCG UUU AGG CAU G-3′。

1.3.2RT-PCR

Trizol一步法提取總RNA，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板進行RT-PCR，檢測SERPINA1的mRNA相對表達量。SERPINA1上游引物：5′-GGA ACA GGC TCA GGA CTA TCT C-3′，下游引物：5′-CAA CAT CTG GCA CTC CAC A-3′；GAPDH上游引物：5′-CAA CGA ATT TGG CTA CAG CA-3′，下游引物：5′-AGG GGT CTA CAT GGC AAC TG-3′。以GAPDH基因作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算目標(biāo)基因的相對表達量。

1.3.3Western blot

將組織和轉(zhuǎn)染48 h后的肝癌細(xì)胞用細(xì)胞裂解法提取細(xì)胞總蛋白，BCA定量試劑盒測定蛋白濃度。樣品均定量為5 μg/μL，變性，取50 μg蛋白經(jīng)8%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，70 V 100 min 電轉(zhuǎn)移至PVDF膜。5%脫脂奶粉封閉2 h，分別加入SERPINA1、E-cadherin、N-cadherin、MMP-9和β-actin一抗(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜。TBST洗膜，加入相應(yīng)二抗(1∶5 000)室溫孵育2 h，TBST清洗后，Bio-Rad ChemiDocTMXRS+ System曝光顯影，Bio-rad Quantity One軟件掃描膠片的灰度值進行定量分析。

1.3.4免疫組織化學(xué)檢測

組織標(biāo)本用石蠟包埋，切成厚度為4 μm的薄片，采用免疫組織化學(xué)法檢測SERPINA1表達，染色結(jié)果以細(xì)胞胞漿出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒判斷為陽性。免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果采用Greenspan分級，根據(jù)陽性細(xì)胞數(shù)和染色強度進行綜合評分。每張切片在光鏡下隨機挑選10個400倍視野，每個視野計數(shù)100個細(xì)胞。染色信號的強度分為4級：0級為“-”，1級為“+”，2級為“++”，3級為“+++”。陽性信號的面積根據(jù)陽性區(qū)域占整體切片面積的百分比分為5級：0級為0，1級為>0～25%，2級為>25%～50%，3級為>50%～75%，4級為>75%～100%。Greenspan分級將信號面積得分與信號強度得分相乘，“-”為0分；“+”為1～4分；“++”為5～8分；“+++”為9～12分。評分過程由兩位不知曉樣本臨床資料的實驗人員獨立完成。Greenspan分級“-”和“+”的樣本為低表達組，Greenspan分級“++”和“+++”的樣本為高表達組。

1.3.5Transwell實驗

取人工基底膜和無血清培養(yǎng)基按1∶4混勻加入Transwell小室中，凝固。無血清培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)24 h的HepG2細(xì)胞，無血清培養(yǎng)基清洗3次，將細(xì)胞懸液的細(xì)胞濃度調(diào)節(jié)為1×106/mL，每個Transwell小室下室加入500 μL含10% FBS的培養(yǎng)基，上室加入200 μL細(xì)胞懸液，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。取出Transwell小室，4%多聚甲醛固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色5 min，PBS洗2次，用棉簽擦去Transwell小室上表面細(xì)胞，顯微鏡下觀察并計數(shù)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 隨訪結(jié)果

78例肝癌患者男58例，女20例；年齡31～79歲，≤50歲46例，>50歲32例；28例術(shù)前甲胎蛋白(AFP)≤400 μg/L,50例AFP>400 μg/L；34例腫瘤直徑>5.0 cm，44例腫瘤直徑≤5.0 cm；TNM分期Ⅰ、Ⅱ期34例，Ⅲ、Ⅳ期44例；病理分級Ⅰ、Ⅱ級33例，Ⅲ、Ⅳ級45例；腫瘤有包膜28例，無包膜50例；血管侵犯34例，無血管侵犯44例；腫瘤單發(fā)42例，多發(fā)36例。所有研究病例均獲隨訪，隨訪截至2021年2月。78例行手術(shù)切除的肝癌患者隨訪時間2～72個月，中位隨訪時間28個月，5年總累積生存率17.9%(14例)。隨訪期間共有41例復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)率為52.6%。復(fù)發(fā)時間為術(shù)后2～49個月，復(fù)發(fā)中位時間為術(shù)后15個月。復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移部位依次為肝28例、肺24例、腹腔3例、骨7例、腹膜2例、腦2例、胸膜2例、胰1例、縱隔1例、食管1例。

2.2 患者肝癌組織和癌旁組織中SERPINA1 mRNA和蛋白表達比較

肝癌組織中SERPINA1 mRNA表達明顯高于癌旁組織[(1.396±0.059)vs.(1.103±0.053)，t=4.872,P<0.05]，SERPINA1蛋白表達亦明顯高于癌旁組織[(0.894±0.086)vs.(0.583±0.095)，t=5.811,P<0.01]，見圖1。

2.3 SERPINA1表達與肝癌臨床病理特征的關(guān)系

SERPINA1主要定位于細(xì)胞質(zhì)，見圖2。肝癌組織SERPINA1的陽性表達率為60.3%(47/78)，癌旁組織為42.3%(33/78)，比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=5.03，P<0.05)。肝癌組織中SERPINA1陽性表達與TNM分期、病理分級和血管侵犯有關(guān)(P<0.05)，見表1。

圖2 肝癌組織SERPINA1免疫組化結(jié)果(×100)

表1 肝癌組織SERPINA1表達與臨床病理特征的關(guān)系

2.4 SERPINA1表達與肝癌患者預(yù)后的關(guān)系

78例肝癌患者術(shù)后1、3、5年累積復(fù)發(fā)率分別為23.1%(18/78)、46.2%(36/78)、48.7%(38/78)，術(shù)后1、3、5年累積生存率分別為83.3%(65/78)、42.3%(33/78)、17.9%(14/78)，見表2。SERPINA1高表達組5年累積復(fù)發(fā)率明顯高于SERPINA1低表達組(χ2=7.305，P<0.01)，5年累積生存率低于SERPINA1低表達組(χ2=5.899，P<0.05)，見圖3。

表2 肝癌患者術(shù)后1、3、5年累積復(fù)發(fā)及生存情況比較

A：累積復(fù)發(fā)率；B:累積生存率。

2.5 SERPINA1表達對肝癌細(xì)胞侵襲能力的影響

與對照組比較，siSERPINA1組穿過小室基底膜的細(xì)胞數(shù)量明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，Mock組無明顯差異(P>0.05)，見圖4。

圖4 各組細(xì)胞侵襲能力的變化

2.6 SERPINA1表達對肝癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)蛋白的影響

與對照組和Mock組比較，siSERPINA1組E-cadherin表達上調(diào)，SERPINA1、MMP-9和N-cadherin表達下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖5。

圖5 各組EMT相關(guān)蛋白表達比較

3 討 論

SERPINA1是絲氨酸蛋白酶抑制劑家族的主要成員，主要由肝細(xì)胞合成，少部分由巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞產(chǎn)生[7]。在人類基因組中，SERPINA1定位于第14號染色體上的q32.1,長度約為370 kb[8]。SERPINA1具有強烈的催化反應(yīng)活性，能夠與酶的活性部位結(jié)合，抑制酶的催化作用或阻止酶原轉(zhuǎn)化為有活性的酶，在調(diào)節(jié)酶活性和蛋白質(zhì)代謝等方面發(fā)揮重要的作用[9]。除此之外，SERPINA1還參與了生物體內(nèi)多種生理和病理反應(yīng)，在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、細(xì)胞分化、細(xì)胞運動和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮作用[4]。

鑒于其重要的生物學(xué)功能，SERPINA1已經(jīng)引起研究者的關(guān)注，并已成為腫瘤研究領(lǐng)域的熱點[10]。ERCETIN等[11]研究發(fā)現(xiàn)，SERPINA1在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達明顯高于癌旁組織，且癌組織中SERPINA1表達越高，患者的生存率越低。KWON等[12]研究發(fā)現(xiàn)，直結(jié)腸癌中SERPINA1表達與患者腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良相關(guān)，過表達SERPINA1增強直結(jié)腸癌細(xì)胞株侵襲和遷移的潛能，反之，沉默SERPINA1表達抑制直結(jié)腸癌細(xì)胞株的侵襲和遷移的潛能，進一步研究發(fā)現(xiàn)SERPINA1通過與Snail結(jié)合參與調(diào)節(jié)直結(jié)腸癌的侵襲轉(zhuǎn)移。在胃癌中，JIANG等[4]研究表明SERPINA1表達與胃癌的進展有關(guān)，SERPINA1可能是預(yù)防胃癌侵襲和轉(zhuǎn)移的潛在靶標(biāo)。本研究采用RT-PCR和Western blot檢測肝癌組織和癌旁組織中SERPINA1 mRNA和蛋白表達，結(jié)果顯示肝癌組織中SERPINA1表達明顯高于癌旁組織，SERPINA1表達與肝癌病理分級、TNM分期和血管侵犯相關(guān)(P<0.05)，而與肝癌其他臨床病理學(xué)參數(shù)無關(guān)(P>0.05)，提示SERPINA1表達可能在肝癌侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要的作用。

本研究采用Kaplan-Meier生存曲線分析SERPINA1表達與肝癌患者術(shù)后預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果顯示SERPINA1高表達組患者5年累積生存率明顯低于SERPINA1低表達組(χ2=5.899，P<0.05)，5年累積復(fù)發(fā)率明顯高于SERPINA1低表達組(χ2=7.305，P<0.01)，表明肝癌組織SERPINA1高表達的患者可能具有更高的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的風(fēng)險。為了進一步研究SERPINA1表達與肝癌細(xì)胞侵襲遷移的關(guān)系，采用RNA干擾技術(shù)在肝癌HepG2細(xì)胞中干擾SERPINA1的表達，然后應(yīng)用Transwell侵襲實驗檢測細(xì)胞的侵襲遷移能力，結(jié)果顯示與對照組和Mock組比較，siSERPINA1組穿過Transwell小室基底膜的細(xì)胞數(shù)量明顯減少，表明沉默SERPINA1的表達可以抑制肝癌細(xì)胞的侵襲遷移能力，SERPINA1與肝癌細(xì)胞侵襲遷移密切相關(guān)，與KWON等[12]研究結(jié)果一致。

EMT是指上皮細(xì)胞發(fā)生成纖維細(xì)胞形態(tài)改變，轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)細(xì)胞表型的生物學(xué)過程,是胚胎發(fā)育和器官形成的基礎(chǔ)過程[13]。大量研究結(jié)果表明，EMT在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過程中也發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，它是上皮源性腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟[14]。EMT程序啟動后，腫瘤細(xì)胞的上皮表型向間質(zhì)表型轉(zhuǎn)變，主要表現(xiàn)為上皮細(xì)胞失去細(xì)胞間黏附和細(xì)胞極性等分化表型，獲得侵襲遷移和抗凋亡等間質(zhì)細(xì)胞特征，同時間質(zhì)細(xì)胞和上皮細(xì)胞標(biāo)志物表達發(fā)生改變，如上皮標(biāo)志物E-cadherin表達下調(diào)，間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin表達上調(diào)等[15]。MMPs的重要作用是降解細(xì)胞外基質(zhì)，通過影響細(xì)胞外基質(zhì)導(dǎo)致EMT，促進腫瘤細(xì)胞移動。MMP-9已被證實在不同類型的腫瘤中促進腫瘤發(fā)生、發(fā)展，并且與腫瘤的侵襲和不良預(yù)后相關(guān)[16-17]。本研究發(fā)現(xiàn)，上皮標(biāo)志物E-cadherin表達升高，而MMP-9和間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin表達下降，表明SERPINA1可能通過調(diào)控MMP-9和EMT相關(guān)蛋白的表達，進而影響肝癌細(xì)胞的侵襲遷移。

綜上所述，SERPINA1在肝細(xì)胞癌中高表達，并與患者預(yù)后相關(guān)；SERPINA1可能通過調(diào)控MMP-9表達和肝癌細(xì)胞EMT，進而影響肝癌細(xì)胞的侵襲遷移。SERPINA1可能是預(yù)防肝癌遷移和早期干預(yù)的新的標(biāo)志物。