靳思涵，李佳寧，孫 芳，李 鑫，張書睿，李婉明△

(1.中國醫(yī)科大學衛(wèi)生部細胞生物學重點實驗室/醫(yī)學細胞生物學教育部重點實驗室/生命科學學院細胞生物學教研室，沈陽 110122；2.中國醫(yī)科大學臨床三系，沈陽 110122；3.中國醫(yī)科大學第一臨床學院，沈陽 110001)

胃癌是全球第5大常見的癌癥，也是導致癌癥相關死亡的第3大原因[1]。胃癌早期診斷率較低，導致患者發(fā)現(xiàn)時已進入晚期，易轉移，預后差，生存率降低[2]。因此，設計特異性、靈敏度更高的靶向診斷探針在實現(xiàn)胃癌早期診斷中具有重要的價值。

核酸適配體(aptamer)是一類能特異性識別靶標的分子探針，可以折疊成不同的三維空間結構(如發(fā)夾、假結等)與靶標發(fā)生結合，又稱為“化學抗體”[3]。與蛋白類抗體相比，核酸適配體因具有高親和力和特異性、分子量小、穩(wěn)定性高、易于化學修飾等優(yōu)勢，成為腫瘤早期診斷領域的理想分子探針[4]。然而常規(guī)的核酸適配體熒光探針往往是“常亮式”的，容易產生假陽性，需要經過多次的洗滌步驟，操作過程繁雜，難以完成某些特定靶標的準確檢測[5]。核酸適配體分子信標是一種“激活式”分子探針，使用時操作簡單、背景低，可以高選擇性高特異性地結合目的分子，不需要經過洗滌步驟，即可一步法完成原位實時檢測。本研究擬在靶向上皮細胞黏附分子(epidermal growth factor receptor，EpCAM)的核酸適配體SYL3的基礎上，設計構建“激活式”分子探針——核酸適配體分子信標MAB-SYL3L，分析其親和性、特異性、生物活性及其對胃癌細胞的靶向識別，為核酸適配體分子信標的應用及胃癌的早期診斷提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

人胃癌細胞SGC-7901及人胚腎上皮細胞HEK-293均由實驗室保存；實驗室中所需適配體及文庫(Library)均委托上海生工生物有限公司合成，以HPLC方式純化。TU-1901紫外-可見分光光度計購自北京普析通用有限責任公司；熒光倒置顯微鏡Axio observer Z1購自德國Zeiss公司；流式細胞儀FACSalibur購自美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養(yǎng)

SGC-7901細胞和HEK-293細胞均使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.2.2核酸適配體分子信標的構建

根據(jù)EpCAM的核酸適配體SYL3的二級結構特征，在保留功能性結合區(qū)域的基礎上進行截短處理，截短序列命名為SYL3L。在此基礎上，根據(jù)分子信標設計的3大原則：莖部序列不能過長，序列中GC含量不能過高，熒光基團和淬滅基團之間的距離適宜，設計構建核酸適配體分子信標MAB-SYL3L，即在5′末端添加熒光基團FAM，在3′末端添加淬滅基團BHQ1。

1.2.3分光光度計檢測MAB-SYL3L的熒光情況

將合成的FAM-SYL3L和MAB-SYL3L溶于PBS中，取100 μL加入比色杯中，利用TU-1901紫外-可見光分光光度計檢測溶液的熒光情況。

1.2.4流式細胞術檢測MAB-SYL3L與不同細胞系的結合情況

取對數(shù)生長期的SGC-7901細胞和HEK-293細胞用無酶細胞消化液消化后制成細胞懸液。分別加入FAM-SYL3L或MAB-SYL3L(終濃度250 nmol/L)4 ℃孵育30 min，PBS洗滌2次，加入300 μL PBS重懸細胞，流式細胞儀檢測細胞的熒光信號。

1.2.5Western blot檢測不同細胞系中EpCAM的表達情況

收集對數(shù)生長期的SGC-7901細胞和HEK-293細胞，加入細胞裂解液冰上孵育20 min，4 ℃，12 000 r/min離心30 min，收集蛋白上清液，通過BCA法測定蛋白濃度。向蛋白樣品中加入5 × loading buffer，煮沸5 min。取煮沸后樣品注入加樣孔，80 V 30 min，120 V 60 min 電泳。電泳結束后80 V恒壓轉膜，封閉60 min后進行抗體孵育，EpCAM抗體購自英國Abcam公司，一抗在4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h，結束后通過成像系統(tǒng)進行結果分析。

1.2.6流式細胞術檢測MAB-SYL3L的親和力

配制不同濃度的MAB-SYL3L(終濃度分別為0、1 nmol/L、2 nmol/L、4 nmol/L、8 nmol/L、16 nmol/L、32 nmol/L、64 nmol/L、128 nmol/L、256 nmol/L、512 nmol/L)，利用流式細胞儀檢測細胞的熒光信號。利用SigmaPlot軟件對各濃度MAB-SYL3L與SGC-7901細胞結合的平均熒光強度進行分析，得到相關結合曲線及Kd值。

1.2.7流式細胞術檢測不同溫度下MAB-SYL3L的結合能力

收集對數(shù)生長期的SGC-7901細胞，分別與MAB-SYL3L(終濃度250 nmol/L)在4 ℃、25 ℃和37 ℃下孵育30 min，PBS洗滌2次后，加入300 μL PBS重懸細胞，流式細胞儀檢測細胞的熒光信號。

1.2.8熒光顯微鏡觀察MAB-SYL3L對SGC-7901細胞的靶向成像

取對數(shù)生長期的SGC-7901細胞鋪于激光共聚焦小皿內，置于細胞培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)后取出，PBS洗滌細胞，分別加入FAM-SYL3L和MAB-SYL3L，在4 ℃孵育30 min后，分別進行洗滌步驟或無洗滌步驟，使用熒光倒置顯微鏡觀察并拍照。

2 結 果

2.1 MAB-SYL3L的構建

將靶向EpCAM的核酸適配體 SYL3從79 nt長度截短至43 nt的截短序列SYL3L(圖1)，在此基礎上構建核酸適配體分子信標MAB-SYL3L(圖2A)。紫外-可見分光光度計檢測結果如圖2B所示，直接連接熒光基團的FAM-SYL3L在518 nm波長左右處可見明顯的熒光峰，而MAB-SYL3L上熒光基團和淬滅基團間發(fā)生能量共振轉移，沒有檢測到任何熒光信號。

圖1 SYL3截短成SYL3L的二級結構模擬圖

A：MAB-SYL3L的二級結構模擬圖；B：紫外-可見分光光度計檢測MAB-SYL3L的熒光信號。

2.2 MAB-SYL3L的細胞選擇性

與對照序列Library比較，F(xiàn)AM-SYL3L和MAB-SYL3L與SGC-7901細胞的熒光結合峰發(fā)生明顯的右移，而與HEK-293細胞的熒光結合峰幾乎沒有發(fā)生右移，見圖3A。HEK-293細胞的EpCAM呈現(xiàn)低表達，而SGC-7901細胞的EpCAM呈現(xiàn)高表達，見圖3B。

A：流式細胞術檢測MAB-SYL3L與不同細胞系的結合情況；B：Western blot檢測EpCAM在不同細胞系中的表達情況。

2.3 MAB-SYL3L的親和性

隨著MAB-SYL3L濃度的增加，SGC-7901細胞的熒光結合峰逐漸發(fā)生右移，增加到一定程度后，熒光結合峰右移程度逐漸減弱，達到飽和狀態(tài)，見圖4A。MAB-SYL3L對SGC-7901細胞具有很好的親和力,見圖4B。

A：流式細胞術檢測不同濃度MAB-SYL3L與靶細胞的結合情況； B：MAB-SYL3L與SGC-7901細胞的解離曲線。

2.4 MAB-SYL3L在不同溫度下的結合能力

與對照序列Library比較，在室溫25 ℃和體內溫度37 ℃下，MAB-SYL3L與SGC-7901細胞的熒光結合峰均發(fā)生明顯的右移，且結合能力基本上與核酸適配體的篩選溫度4 ℃時幾乎相同，見圖5。

2.5 MAB-SYL3L對SGC-7901細胞的靶向成像

激光共聚焦熒光顯微鏡觀察結果顯示，當使用常規(guī)的熒光成像步驟操作時，即細胞與探針孵育后通過洗滌步驟去除沒有發(fā)生結合的探針，與對照序列Library比較，F(xiàn)AM-SYL3L和MAB-SYL3L的細胞表面均能觀察到明顯的綠色熒光。當探針與細胞孵育后不經過洗滌步驟直接觀察時，F(xiàn)AM-SYL3L和FAM-Library具有很高的熒光背景，無法實現(xiàn)細胞成像，而MAB-SYL3L熒光背景低，仍然能夠清晰觀察到細胞表面的綠色熒光，見圖6。

圖5 MAB-SYL3L在不同溫度下與SGC-7901細胞的結合情況

圖6 激光共聚焦顯微鏡觀察MAB-SYL3L對SGC-7901細胞的靶向成像(×200)

流式細胞術結果進一步證實，F(xiàn)AM-SYL3L沒有經過洗滌步驟，SGC-7901細胞會檢測到很高的非特異性熒光；而MAB-SYL3L有無洗滌步驟，SGC-7901細胞熒光結合峰幾乎重合，沒有非特異性熒光，見圖7。

圖7 洗滌步驟對MAB-SYL3L與SGC-7901細胞結合的影響

3 討 論

核酸適配體作為腫瘤早期診斷的靶向分子識別探針，主要是通過結合熒光染料或納米發(fā)光材料等完成對腫瘤細胞的靶向成像[6-7]。然而，傳統(tǒng)的核酸適配體分子探針具有恒定的信號，圖像對比度受到高背景的嚴重影響，因此，在使用的過程中需要經過多次洗滌步驟才能清楚地觀察到靶向熒光信號，操作不但復雜繁瑣，而且在觀察細小靶向對象(如外泌體)時難以實現(xiàn)。

分子信標是基于熒光共振能量轉移原理設計出的具有莖-環(huán)結構的一段寡核苷酸探針，其中環(huán)部是目標識別區(qū)，莖部是互補序列，熒光基團和淬滅基團分別連接在莖部的2個末端[8]。當目標分子不存在時，兩側互補堿基配對形成雙螺旋，分子信標呈發(fā)夾結構，使得2個堿基末端的熒光基團和淬滅基團相互接近，并發(fā)生能量轉移，熒光被淬滅。當目標分子存在時，環(huán)部與目標分子結合，導致分子信標的構象改變，熒光基團與淬滅基團分離，能量轉移終止，熒光恢復，且熒光強度與目標分子濃度呈正比。因此，利用分子信標對靶標物質進行檢測時不需要分離未結合探針即可實現(xiàn)靶標的檢測，具有操作簡便、快捷、靈敏度高等優(yōu)點[9-10]。將核酸適配體的靶向識別特性和分子信標的熒光檢測性能相結合，構建的一類新型的核酸適配體分子信標具有以下的優(yōu)點[11]：(1)核酸適配體在分子信標的設計中作為識別單元，只要獲得目標物的核酸適配體，就可以設計出相應的分子信標探針并對其進行檢測；(2)核酸適配體的靶標類型廣泛，在各領域都具有良好的應用前景；(3)核酸適配體對靶標具有高親和力和高特異性，因此可以明顯提高被檢測靶標的靈敏度和選擇性。

EpCAM也稱為CD326，是一種Ca2+非依賴性跨膜糖蛋白，它在上皮組織的基底外側細胞表面表達[12]。EpCAM參與細胞信號傳導、分化、增殖、侵襲和遷移，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[13-14]。作為腫瘤特異性蛋白，EpCAM在>90%的胃腫瘤中過度表達[15]。本研究中構建EpCAM核酸適配體分子信標MAB-SYL3L，采用流式細胞術分別對其親和性、溫度穩(wěn)定性等進行分析，結果表明MAB-SYL3L保留了核酸適配體SYL3的特性，且與SGC-7901細胞具有高親和力，Kd值依然在nmol/L級別；此外，MAB-SYL3L在25 ℃和37 ℃仍能保持與SGC-7901細胞的結合力，提示MAB-SYL3L可以應用于室溫或體內的實驗。

分子信標最大的優(yōu)勢之一就是在檢測靶標物質的過程中不需要額外的洗滌步驟，能夠實現(xiàn)一步法的特異性檢測，因此為了檢測MAB-SYL3L的分子信標特性，采用熒光顯微鏡和流式細胞術分析存在洗滌步驟與否的情況下，核酸適配體探針FAM-SYL3L和構建的核酸適配體分子信標MAB-SYL3L與SGC-7901細胞的檢測情況。熒光顯微鏡結果顯示不經過后續(xù)的洗滌步驟時，F(xiàn)AM-SYL3L的細胞熒光信號背景較深，掩蓋了細胞膜上的熒光信號，經過洗滌步驟后才可觀察到細胞膜表面的熒光；而MAB-SYL3L信噪比較高，幾乎沒有熒光信號背景，在有無洗滌步驟下均可很好地實現(xiàn)SGC-7901細胞的靶向識別/成像，提示MAB-SYL3L無須洗滌過程即可通過一步法達到檢測靶標物質的目的，體現(xiàn)出核酸適配體分子信標MAB-SYL3L對靶標物質檢測具有高特異性、高靈敏度并且操作簡便的優(yōu)勢。流式細胞術結果也進一步證實這一結論。

綜上所述，本研究成功構建了靶向EpCAM的核酸適配體分子信標MAB-SYL3L，建立了一種方便快捷、準確性高的胃癌細胞靶向成像方法，為核酸適配體和分子信標的相關應用及胃癌細胞的靶向成像提供新方法。