李會杰 董蓮華 陳桂芳 劉思淵 楊佳怡 楊靖亞

（1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；2.中國計量科學(xué)研究院前沿計量科學(xué)中心，北京 100029；3.沈陽化工大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，沈陽 110142）

椰毒假單胞菌是一種革蘭氏陰性、兼性厭氧菌，多生長在谷類發(fā)酵制品、薯類制品、變質(zhì)銀耳等食品表面［1-2］。該菌在一定條件下產(chǎn)生米酵菌酸和毒黃素兩種脂肪酸類小分子物質(zhì)，具有毒性作用［3-4］。其中，米酵菌酸毒性較強(qiáng)，它結(jié)合線粒體中轉(zhuǎn)運(yùn)二磷酸腺苷/三磷酸腺苷（ADP/ATP）載體，影響ATP 代謝途徑，導(dǎo)致細(xì)胞死亡［5-6］。流行病學(xué)分析表明，椰毒假單胞菌食物中毒具有地域性特點，且具有明顯的季節(jié)性，主要發(fā)生在中國、東南亞以及非洲地區(qū)，多發(fā)于夏秋季［2，7］。2010年到至今，在我國廣西、云南、浙江、貴州、廣東、黑龍江等地陸續(xù)報道了多起椰毒假單胞菌食物中毒事件，造成中毒者嚴(yán)重的身體機(jī)能損害甚至死亡［8-10］。

目前，椰毒假單胞菌食物中毒的解毒藥物尚未發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌及其外毒素的檢測可從源頭監(jiān)測污染狀況，避免中毒事件的發(fā)生。根據(jù)GB 5009.189-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中米酵菌酸的測定》，經(jīng)過樣品提取、過濾后，進(jìn)行高效液相色譜法分析［11］。該方法操作繁瑣，檢測結(jié)果易受基質(zhì)干擾，無法滿足復(fù)雜基質(zhì)食品中米酵菌酸的快速定量分析要求。氣相色譜或液相色譜與質(zhì)譜串聯(lián)分析也被用于食品中米酵菌酸的檢測，但儀器要求較高，對現(xiàn)場檢測有一定的限制，對較低濃度米酵菌酸，存在漏檢的可能［12-13］。針對食品中椰毒假單胞菌的檢測是更為直接的方法，具有重要意義。根據(jù)GB 4789.29-2020《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 唐菖蒲伯克霍爾德氏菌（椰毒假單胞菌酵米面亞種）的檢驗》［14］，通過增菌培養(yǎng)、選擇性培養(yǎng)基分離、生化鑒定和血清學(xué)實驗等過程進(jìn)行檢驗，該方法檢測周期長，無法實現(xiàn)對食品中椰毒假單胞菌的快速定量檢測，不利于中毒者的及時診治。核酸體外擴(kuò)增的檢測方法具有迅速、靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)勢。馬曉燕等［15］建立環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)，利用特異性引物在恒溫條件下對椰毒假單胞菌16S-23S rRNA 序列進(jìn)行快速擴(kuò)增，將擴(kuò)增后的產(chǎn)物做瓊脂糖凝膠電泳檢測，通過觀察條帶驗證是否存在細(xì)菌污染，該方法只能實現(xiàn)定性。林捷等［16］針對16S-23S rRNA 序列進(jìn)行實時熒光定量PCR 檢測（quantitative real-time PCR，qPCR），該方法依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行相對定量，標(biāo)準(zhǔn)曲線的準(zhǔn)確性直接影響定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。

微滴式數(shù)字PCR（droplet digital polymerase chain reaction，ddPCR）因特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)勢在食源性致病菌的定量檢測方面應(yīng)用廣泛，提高了食源性致病菌的檢測效率［17-18］，如大腸埃希氏菌、蠟樣芽孢桿菌、沙門氏菌等［19-20］。ddPCR 使DNA 分子隨機(jī)、獨立地分布在每個反應(yīng)單元，對單個DNA分子進(jìn)行PCR 反應(yīng)后對熒光信號計數(shù)，結(jié)合泊松分布得到DNA 分子拷貝數(shù)，無需依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線即可實現(xiàn)對樣品的絕對定量檢測。魏詠新等［21］針對大腸埃希氏菌O157∶H7 單拷貝基因hlyA 建立ddPCR 方法，對人工污染的三文魚樣品進(jìn)行特異性定量檢測，檢出限為110 CFU/g。在食品基質(zhì)中對鼠傷寒沙門氏菌的要求是零檢出［22］，Wang 等［23］針對鼠傷寒沙門氏菌FimY基因建立ddPCR 方法，快速定量檢測人工污染牛奶樣品，檢出限為250 CFU/mL。在上述研究中，研究者通過比較ddPCR 和qPCR 方法的定量檢測結(jié)果，發(fā)現(xiàn)ddPCR 檢出限更低。針對椰毒假單胞菌污染發(fā)酵米面等食物導(dǎo)致嚴(yán)重的食物中毒，且目前沒有準(zhǔn)確定量檢測方法的現(xiàn)狀，本研究根據(jù)16S-23S rRNA 序列，建立了椰毒假單胞菌ddPCR定量檢測方法，ddPCR 對人工污染糯米湯樣品的檢出限為361 CFU/mL 與平板計數(shù)法相比，ddPCR 方法縮短了檢測周期，有利于食品中椰毒假單胞菌的快速準(zhǔn)確檢測。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑 細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒（貨號：A1120，天根生化科技有限公司）；上下游引物、探針（上海英濰捷基貿(mào)易有限公司）；培養(yǎng)基（北京路橋技術(shù)股份有限公司）；密封墊（Gaskets for QX200/QX100）、微滴發(fā)生卡（Cartridges for QX200/QX100）、ddPCR 預(yù)混液、微滴發(fā)生專用油、微滴分析專用油（美國Bio-Rad 公司）；實驗所用菌株詳見表1，其中椰毒假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（CICC10574）和黃曲霉標(biāo)準(zhǔn)菌株（CICC2219）均購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（China Center of Industrial Culture Collection，CICC），其它標(biāo)準(zhǔn)菌株為實驗室保存。所有菌株均在各自的指示培養(yǎng)基上活化后備用。

表1 實驗用菌種Table 1 Strains for experiment

1.1.2 儀器與設(shè)備 Veriti PCR 儀（美國 Applied BioSystems 公司）；微滴分析儀、微滴生成儀（美國Bio-Rad 公司）；Nanodrop2000 超微量紫外分光光度計（美國Thermo 公司）；LightCycler 480 Ⅱ?qū)崟r熒光定量PCR 儀（德國Roche 公司）。

1.2 方法

1.2.1 引物和探針的設(shè)計 為實現(xiàn)對椰毒假單胞菌的特異性檢測和絕對定量分析，選取該菌中具有高度種屬特異性且高度保守的16S-23S rRNA 序列（基因號 EF552059）作為靶序列，利用Primer Express軟件設(shè)計引物和探針，并通過NCBI 在線工具進(jìn)行序列分析和比對，引物和探針序列見表2。探針5'端以熒光基團(tuán)FAM 標(biāo)記，3'端以淬滅基團(tuán)BHQ 標(biāo)記。

表2 ddPCR 引物和探針序列Table 2 Primers’ and probes’ sequences of ddPCR

1.2.2 基因組DNA 提取 將椰毒假單胞菌（CICC10574）接種于LB 液體培養(yǎng)基中，于37℃、220 r/min 搖床過夜培養(yǎng)。用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer Saline，PBS）對過夜培養(yǎng)菌液進(jìn)行10倍梯度稀釋，至108稀釋度。取各稀釋度菌液1 mL，用細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒（天根，貨號：A1120）分別提取基因組DNA。操作步驟參照試劑盒說明書，最后，用50 μL TE 緩沖液洗脫提取的基因組DNA。

1.2.3 平板計數(shù) 取1.2.2 中10 倍梯度稀釋的椰毒假單胞菌純培養(yǎng)菌液進(jìn)行平板計數(shù)，取100 μL 各稀釋度菌液加到馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA）內(nèi)，用涂布棒均勻涂開后，37℃倒置培養(yǎng)24±2 h，每個稀釋度做3 個平行。保證菌落數(shù)在（20-300）CFU 范圍內(nèi)、無蔓延菌落生長，計數(shù)結(jié)果取3 個平板計數(shù)結(jié)果的平均值。

1.2.4 ddPCR 檢測方法 對ddPCR 反應(yīng)體系中退火溫度進(jìn)行優(yōu)化，以確定適宜的PCR 擴(kuò)增程序。以椰毒假單胞菌基因組DNA 為模板，設(shè)置退火溫度在54℃、56℃、58℃、60℃和62℃ 下進(jìn)行ddPCR 擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增完成后，將96 孔板放置到微滴檢測儀中進(jìn)行檢測。根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果，篩選陽性微滴簇和陰性微滴簇分離明顯的溫度為ddPCR 檢測方法的退火溫度。

采用優(yōu)化后的退火溫度，對引物和探針濃度進(jìn)行優(yōu)化，確定合適的引物和探針濃度。選取引物工作濃度為0.2 μmol/L、0.4 μmol/L、0.6 μmol/L，探針工作濃度為0.2 μmol/L、0.3 μmol/L、0.4 μmol/L，進(jìn)行正交實驗。根據(jù)ddPCR 檢測結(jié)果選取合適的引物和探針濃度。

ddPCR 反應(yīng)采用20 μL 體系，包括ddPCR 預(yù)混液（10 μL），上、下游引物（2.4 μL，工作濃度為0.6 μmol/L），探針（0.6 μL，工作濃度為0.3 μmol/L），DNA 模板（5 μL），去離子水補(bǔ)足20 μL。將20 μL反應(yīng)體系和60 μL 微滴生成油分別加入到微滴發(fā)生卡對應(yīng)的孔中，通過微滴生成儀生成油包水的微滴。將生成的微滴轉(zhuǎn)移至96 孔板后封膜，將封好的96孔板置于PCR 儀進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，PCR 擴(kuò)增程序為：預(yù)變性95℃ 10 min；變性94℃ 30 s，退火加延伸56℃ 1 min，40 個循環(huán)；熱失活98℃ 10min。擴(kuò)增完成后，將96 孔板置于微滴讀取儀進(jìn)行檢測，進(jìn)一步讀取結(jié)果并分析。ddPCR 檢測結(jié)果與對應(yīng)的菌懸液濃度的換算公式如下：

上式中：C為對應(yīng)的菌懸液濃度（CFU/mL）；c1為核酸拷貝數(shù)濃度（copies/μL）；n為反應(yīng)體系中DNA 模板稀釋倍數(shù)；v1為提取核酸的最終洗脫體積（μL）；v2為提取的菌懸液體積（mL）。

1.2.5 ddPCR 檢測方法的特異性驗證 由于在椰毒假單胞菌中毒事件源頭查找過程中，易與黃曲霉、枯草芽孢桿菌等常見食源性致病菌混淆，黑龍江“酸湯子”食物中毒事件就曾被誤認(rèn)為是“黃曲霉毒素中毒”［24］。為驗證所建立的ddPCR 檢測方法的特異性，將提取的椰毒假單胞菌基因組DNA 作為陽性對照，選取黃曲霉、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、大腸埃希氏菌和枯草芽孢桿菌等7 種食源性致病菌（表1）提取的基因組DNA 作為模板，采用1.2.1 節(jié)中設(shè)計的引物和探針，按照1.2.4 節(jié)中的方法進(jìn)行檢測。

1.2.6 qPCR 檢測方法 qPCR 反應(yīng)體系包括：qPCR預(yù)混液（12.5 μL），上、下游引物（1.5 μL，工作濃度為0.6 μmol/L），探針（0.75 μL，工作濃度為0.3 μmol/L），待測DNA 模板（5 μL），去離子水補(bǔ)足25 μL。置于LightCycler 480 Ⅱ?qū)崟r熒光定量PCR 儀中進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：預(yù)變性95℃ 10 min；變性94℃ 30 s，退火加延伸56℃ 1 min，40 個循環(huán)。取已知拷貝數(shù)濃度的椰毒假單胞菌基因組DNA 作為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)回歸方程和Ct 值計算未知樣品的拷貝數(shù)濃度。

1.2.7 人工污染糯米湯樣品的檢測 糯米湯易被椰毒假單胞菌污染，導(dǎo)致中毒事件的發(fā)生，選擇糯米湯作為食品基質(zhì)。對椰毒假單胞菌原菌液進(jìn)行10 倍梯度稀釋并進(jìn)行平板計數(shù)，同時取104、105、106、107稀釋度菌液各5 mL 分別添加到5 mL 糯米湯中，每個稀釋度設(shè)置3 個重復(fù)，制成含有不同椰毒假單胞菌添加水平的污染樣品。另取5 mL PBS 加入5 mL 糯米湯中作為陰性對照。對不同添加水平的人工污染樣品分別梯度稀釋，進(jìn)行平板計數(shù)。用細(xì)菌基因組試劑盒（天根，貨號：A1120）對不同添加水平的椰毒假單胞菌污染糯米湯樣品進(jìn)行提取，同時進(jìn)行ddPCR 和qPCR 檢測。

1.2.8 人工污染糯米湯樣品中ddPCR 檢測方法特異性的驗證 在核酸水平特異性驗證的基礎(chǔ)上，為驗證實際樣品中所建立ddPCR 檢測方法的特異性，采用椰毒假單胞菌與金黃色葡萄球菌、宋內(nèi)氏志賀氏菌等7 種食源致病菌同時污染糯米湯樣品，在4 mL糯米湯樣品中，加入椰毒假單胞菌的濃度梯度為（3×102-3×105）CFU/mL，其他7 種食源致病菌的濃度為6×105CFU/mL。混合均勻后用細(xì)菌基因組試劑盒（天根，貨號：A1120）進(jìn)行提取，并進(jìn)行ddPCR 檢測。

2 結(jié)果

2.1 ddPCR檢測方法體系優(yōu)化結(jié)果

為優(yōu)化ddPCR 檢測方法的退火溫度，將退火溫度分別設(shè)置為54℃、56℃、58℃、60℃和62℃進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果如圖1-A 所示，當(dāng)退火溫度為56℃時，陽性微滴簇與陰性微滴簇區(qū)分明顯，且各微滴簇較為集中，選擇56℃為椰毒假單胞菌ddPCR 檢測的退火溫度。優(yōu)化引物和探針的正交實驗結(jié)果見圖1-B，引物和探針的工作濃度分別為0.6 μmol/L 與0.3 μmol/L 時，陽性微滴簇和陰性微滴簇區(qū)分最為明顯，且微滴簇之間彌散微滴較少，確定該濃度為后續(xù)實驗中的工作濃度。

圖1 ddPCR 方法的退火溫度（A）、引物和探針濃度（B）優(yōu)化Fig.1 Optimization of annealing temperature（A），concentration of primer and probe（B）of ddPCR

2.2 ddPCR檢測方法具有良好的特異性

由于黃曲霉與椰毒假單胞菌均易污染發(fā)酵玉米面等食品，在檢測過程中可能發(fā)生混淆，因此選取黃曲霉作為對照菌株。此外，還選取了金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌和沙門氏菌等6 種常見的食源性致病菌（表1），驗證所建立的ddPCR 檢測方法的特異性。以表1中菌株的基因組DNA 作為模板進(jìn)行ddPCR 檢測。結(jié)果如圖2所示，只有椰毒假單胞菌基因組DNA 被檢測出陽性微滴信號，而其它7 種菌株基因組DNA 檢測結(jié)果均呈陰性，表明設(shè)計的引物和探針具有良好的特異性。可避免食物中毒事件追查病原菌的過程中多種致病菌的干擾，有利于椰毒假單胞菌的準(zhǔn)確檢出。

圖2 椰毒假單胞菌ddPCR 檢測方法的特異性結(jié)果Fig.2 Specificity of ddPCR for Pseudomonas cocovenenans

2.3 椰毒假單胞菌菌液ddPCR與qPCR、平板計數(shù)檢測結(jié)果的比較

ddPCR 在102稀釋度時，陽性微滴的比率為100%，不滿足泊松分布，超出ddPCR 的定量范圍。菌液在（1.53×103-4.13×105）CFU/mL 濃度范圍內(nèi)，ddPCR 檢測結(jié)果相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD，relative standard deviation）均小于6%，說明該方法具有較好的重復(fù)性。針對3.25×102CFU/mL（107稀釋度）菌液進(jìn)行重復(fù)檢測，RSD 值為16.29%，此時ddPCR檢測讀數(shù)結(jié)果為1.38 copies/μL，若濃度更低則無法檢出。ddPCR 方法的檢出限為3.25×102CFU/mL（表3）。

如表4所示，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和Ct 值計算出的各稀釋度菌液濃度。在（5.42×103-2.75×108）CFU/mL 范圍內(nèi)，qPCR 檢測結(jié)果的RSD 值均小于6%，說明該方法重復(fù)性好。qPCR 在106稀釋度時已超出其檢測范圍（Ct ≥ 35），檢出限為5.42×103CFU/mL。相比于ddPCR 方法，qPCR 方法的檢出限更高，然而該方法可檢測到2.75×108CFU/mL 的高濃度菌液，具有更廣泛的檢測范圍。

為比較3 種檢測方法的檢出限和靈敏度，根據(jù)平板計數(shù)法，椰毒假單胞菌原菌液濃度為1.02×109CFU/mL；qPCR 方法在有效檢測范圍內(nèi)，由各稀釋度計算出的原菌液濃度的平均值為1.1×109CFU/mL；ddPCR 方法計算出的原菌液濃度為1.2×109CFU/mL。ddPCR 檢測結(jié)果比平板計數(shù)結(jié)果高18%，這可能是由于部分細(xì)菌處于存活非可培養(yǎng)狀態(tài)（viable but non-culturabe，VBNC），該狀態(tài)通過平板培養(yǎng)方法無法形成菌落，核酸檢測可檢出VBNC 狀態(tài)的細(xì)菌，導(dǎo)致平板計數(shù)結(jié)果偏低［25-27］。如圖3所示，線段的起止代表不同方法的檢測范圍，當(dāng)菌液稀釋度低于103（濃度高于4.13×105CFU/mL）時，超出ddPCR 方法的定量范圍，仍可通過qPCR 方法進(jìn)行定量檢測。ddPCR 方法的檢出限（3.25×102CFU/mL）低于qPCR 方法（5.42×103CFU/mL）。兩種方法在其檢測范圍內(nèi)均具有較好的重復(fù)性，ddPCR 方法具有更高的靈敏度，qPCR 方法對于高濃度的菌液，具有更廣泛的檢測范圍。

圖3 三種檢測方法對不同濃度椰毒假單胞菌檢測結(jié)果Fig.3 Different concentration results of P.cocovenenans by 3 detection methods

2.4 人工污染糯米湯樣品的檢測結(jié)果

取104-107稀釋度椰毒假單胞菌菌液添加到糯米湯中，根據(jù)添加菌液的平板計數(shù)結(jié)果，人工污染糯米湯樣品中椰毒假單胞菌的添加量為（3.4×102-3.4×105）CFU/mL。對不同添加量的人工污染糯米湯樣品同時進(jìn)行ddPCR 和qPCR 檢測以及平板計數(shù)，結(jié)果如圖4所示。ddPCR 對107稀釋度菌液添加水平仍能檢出，qPCR 不能檢出，ddPCR 具有更高的靈敏度，對人工污染糯米湯樣品的檢出限為361 CFU/mL。在各添加水平菌液污染糯米湯樣品的檢測結(jié)果中，ddPCR 檢測結(jié)果的RSD 值均小于平板計數(shù)結(jié)果的RSD 值，具有更好的重復(fù)性。此外，從細(xì)菌基因組提取到ddPCR 檢測可在4 h 內(nèi)完成，平板計數(shù)法檢測時間需包含細(xì)菌菌落生長的時間，需要至少18 h。與平板計數(shù)法相比，ddPCR 檢測方法明顯縮短了檢測時間，有利于食物中毒的快速檢測分析，從而提高相關(guān)診斷治療的科學(xué)性。

圖4 人工污染樣品中椰毒假單胞菌的定量檢測結(jié)果Fig.4 Quantitative results of Pseudomonas cocovenenans in artificially contaminated samples

2.5 人工污染糯米湯樣品中ddPCR 檢測方法的特異性驗證結(jié)果

2.2 的結(jié)果表明建立的ddPCR 檢測方法在核酸水平具有較好的特異性。制備椰毒假單胞菌和金黃色葡萄球菌、宋內(nèi)氏志賀氏菌等7 種食源致病菌同時污染的糯米湯樣品，對該方法在實際樣品中檢測的特異性進(jìn)行驗證。在人工污染糯米湯樣品中加入的椰毒假單胞菌濃度為（3×102-3×105）CFU/mL，金黃色葡萄球菌、宋內(nèi)氏志賀氏菌等7 種食源致病菌的濃度為6×105CFU/mL。對單一（椰毒假單胞菌）和多種食源性致病菌污染的糯米湯樣品進(jìn)行ddPCR檢測并比較其定量結(jié)果。結(jié)果如圖5所示，在椰毒假單胞菌不同水平的污染糯米湯樣品中，添加較高濃度的金黃色葡萄球菌、宋內(nèi)氏志賀氏菌等7 種食源致病菌，對于椰毒假單胞菌的定量結(jié)果沒有影響。表明建立的ddPCR 檢測方法在實際樣品檢測過程中具有較強(qiáng)的抗干擾能力，表現(xiàn)出較好的特異性。

圖5 人工污染樣品中椰毒假單胞菌ddPCR 檢測方法的特異性驗證結(jié)果Fig.5 Specificity verification of ddPCR method for the detection of P.cocovenenans in artificially contaminated samples

3 討論

2020年10月黑龍江省雞西市發(fā)生“酸湯子”食物中毒事件，9 名食用者全部死亡。經(jīng)流行病學(xué)調(diào)查與采樣檢測，在患者胃液及其食用的玉米面中檢出細(xì)菌毒素米酵菌酸，證實此次食物中毒事件是由椰毒假單胞菌污染產(chǎn)生的米酵菌酸所致［28］。椰毒假單胞菌引起食物中毒的潛伏期是4 h-6 h，初始中毒癥狀包括腹痛、全身無力、大量出汗、疲倦和嗜睡以及昏迷，在初始癥狀發(fā)作后 2 h-24 h 內(nèi)導(dǎo)致死亡［29］。椰毒假單胞菌污染食品的可能途徑很多，如原材料污染、工廠生產(chǎn)過程污染等［30-31］。同時，該菌溫度適應(yīng)范圍廣，在26℃-37℃范圍內(nèi)均可生長，低溫下也可存活，食物儲存方式不當(dāng)可能導(dǎo)致椰毒假單胞菌污染，其產(chǎn)生米酵菌酸毒素，對肝臟和腎臟等器官造成嚴(yán)重?fù)p傷，目前仍缺乏特效解毒藥物［3，32］。本研究針對椰毒假單胞菌高度保守的16S-23S rRNA 序列，優(yōu)化并建立了基于數(shù)字PCR技術(shù)的定量檢測方法。現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)GB4789.29-2020 采用平板培養(yǎng)結(jié)合毒理學(xué)實驗對椰毒假單胞菌進(jìn)行檢測［33］，樣品經(jīng)GVC 選擇性增菌液分離椰毒假單胞菌，該增菌液添加了龍膽紫抑制革蘭氏陽性菌及氯霉素抑制其他多種革蘭氏陰性菌，再利用選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行平板培養(yǎng)。平板培養(yǎng)耗時較長，不利于食物中毒事件中快速確定致病菌并進(jìn)行治療。已有研究表明：細(xì)菌在低溫、紫外線等脅迫條件下可能進(jìn)入存活非可培養(yǎng)（VBNC）狀態(tài)，VBNC 狀態(tài)的細(xì)菌仍具有代謝活性，但通過平板培養(yǎng)不能形成菌落［24，34］，因此可能導(dǎo)致平板計數(shù)法檢測結(jié)果偏低。與平板計數(shù)法相比，數(shù)字PCR 方法可避免檢測過程中細(xì)菌VBNC 狀態(tài)的影響。該方法將檢測時間由18 h 以上縮短至4 h 以內(nèi)，其檢測結(jié)果的RSD 小于平板計數(shù)法，顯著提高了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性與重復(fù)性。

基于PCR 擴(kuò)增技術(shù)，已有研究人員建立了環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增法、熒光定量PCR 法并用于椰毒假單胞菌的檢測，但是環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增法只能實現(xiàn)定性分析，熒光定量PCR 法依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行相對定量檢測［15-16］。目前尚無針對椰毒假單胞菌的絕對定量檢測方法，本研究采用的數(shù)字PCR 方法不依賴于標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以實現(xiàn)核酸分子的絕對定量。該方法通過將DNA 分子無限稀釋，使每個反應(yīng)單元中包含至少一個拷貝的核酸分子，經(jīng)過PCR 擴(kuò)增，通過統(tǒng)計陽性反應(yīng)的單元數(shù)結(jié)合泊松分布的原理計算目標(biāo)核酸的拷貝數(shù)，實現(xiàn)絕對定量檢測。本研究利用數(shù)字PCR 技術(shù)，通過對反應(yīng)體系的優(yōu)化，建立了針對椰毒假單胞菌核酸的絕對定量方法。在與其他常見食源性致病菌共同污染樣品的檢測過程中，該方法表現(xiàn)出良好的特異性。針對含不同菌液濃度的人工污染糯米湯樣品，該方法的檢出限為361 CFU/mL，而對于該濃度的人工污染樣品，qPCR 方法不能檢出，因此數(shù)字PCR 方法具有更高的靈敏度。本研究建立的數(shù)字PCR 方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高和檢測快速等特點，能夠為椰毒假單胞菌的快速準(zhǔn)確檢測提供參考，有助于預(yù)防中毒事件的發(fā)生。

4 結(jié)論

本研究依據(jù)椰毒假單胞菌16S-23S rRNA 序列，通過優(yōu)化ddPCR 反應(yīng)條件，建立了基于ddPCR 技術(shù)的定量檢測方法。該方法具有較好的特異性與準(zhǔn)確性，有利于潛在污染樣品中椰毒假單胞菌的快速定量檢測，未來可在食品安全監(jiān)測與中毒分析等領(lǐng)域進(jìn)行應(yīng)用。