李圣彥 李香銀 李鵬程 張明俊 張杰 郎志宏

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京 100081；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所 植物病蟲害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193）

玉米是我國(guó)重要的食物、飼料和工業(yè)原料。隨著人民生活水平不斷提高，對(duì)玉米的需求量也不斷增加。據(jù)統(tǒng)計(jì)，近20年來(lái)我國(guó)玉米種植面積和產(chǎn)量分別增長(zhǎng)了170%和228%，成為我國(guó)第一大作物［1］。但在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中蟲害一直是影響玉米產(chǎn)量和品質(zhì)的重要因素，我國(guó)玉米的主要害蟲包括亞洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）、東方粘蟲（Mythimna separate）、棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）、草地貪夜蛾（Spodoptera frugiperda）等。亞洲玉米螟俗稱鉆心蟲，屬鱗翅目螟蛾科，在我國(guó)各地均有發(fā)生，可危害玉米植株地上各個(gè)部分［2］。東方粘蟲，屬鱗翅目夜蛾科，低齡幼蟲食量較小，高齡幼蟲進(jìn)入暴食階段，可在短時(shí)間內(nèi)將大面積作物葉片吃光，繁殖能力較強(qiáng)［3］。棉鈴蟲，屬鱗翅目夜蛾科，多食性害蟲，第4 代棉鈴蟲主要危害玉米雌穗，嚴(yán)重影響雌穗和籽粒生長(zhǎng)［4］。草地貪夜蛾，屬鱗翅目夜蛾科，2019年入侵我國(guó)云南，因其適生區(qū)域廣、寄主范圍寬、增殖潛能強(qiáng)、擴(kuò)散速度快等特點(diǎn)，已經(jīng)成為一種嚴(yán)重威脅玉米生產(chǎn)的害蟲［5］。

隨著生物技術(shù)的發(fā)展，Bt 作物的應(yīng)用為害蟲防治開(kāi)辟了新的途徑。自1996年第一例轉(zhuǎn)基因玉米Bt176 商業(yè)化以來(lái)，轉(zhuǎn)基因玉米在全球得到廣泛應(yīng)用，取得了十分顯著的經(jīng)濟(jì)、社會(huì)和生態(tài)效益［6］。國(guó)外轉(zhuǎn)基因玉米研究起步較早，發(fā)展十分迅速，目前商業(yè)化種植的抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米主要有轉(zhuǎn)cry1Ab基因的MON810、Bt11，轉(zhuǎn)cry1Fa2基因的TC1507，轉(zhuǎn)cry2Ab2和cry1A.105基因的MON89034，轉(zhuǎn)vip3Aa20基因的MIR162 等，耐除草劑轉(zhuǎn)基因玉米主要有轉(zhuǎn)cp4-epsps基因的NK603，轉(zhuǎn)mepsps基因的GA21等［6］。我國(guó)一直高度重視作物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的研究，已經(jīng)培育出一批轉(zhuǎn)基因玉米新品系。2019-2021年農(nóng)業(yè)農(nóng)村部相繼批準(zhǔn)了轉(zhuǎn)cry1Ab和epsps基因的抗蟲耐除草劑玉米DBN9936，轉(zhuǎn)cry1Ab/cry2Aj和g10evoepsps基因的抗蟲耐除草劑玉米瑞豐125，轉(zhuǎn)epsps和pat基因的耐除草劑玉米DBN9858，轉(zhuǎn)vip3Aa19和pat基因的抗蟲耐除草劑玉米DBN9501，轉(zhuǎn)mcry1Ab和mcry2Ab基因的抗蟲玉米ND207，轉(zhuǎn)cry1Ab和cry2Ab基因的抗蟲玉米瑞豐8 以及抗蟲耐除草劑玉米DBN3601T（DBN9936×DBN9501）的安全證書，標(biāo)志著國(guó)產(chǎn)轉(zhuǎn)基因玉米即將進(jìn)入產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。

Btcry2Ah基因是國(guó)內(nèi)研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)宏基因組方法克隆出的一種新的Bt 殺蟲蛋白基因，Cry2Ah 蛋白對(duì)玉米螟、棉鈴蟲和Cry1Ac 抗性棉鈴蟲有抑制活性［7］，并且與Cry1Ac、Cry1Ab 無(wú)交互抗性［8］。前期研究中，通過(guò)基因突變獲得了Cry2Ah 的兩個(gè)突變體Cry2Ah-vp（V354VP）和Cry2Ah-sp（V354SP），在煙草中分別表達(dá)cry2Ah及cry2Ah-vp、cry2Ah-sp基因，結(jié)果表明與Cry2Ah 相比，突變體Cry2Ah-vp 和Cry2Ah-sp 對(duì)棉鈴蟲和抗性棉鈴蟲具有更高的殺蟲活性［9］。隨后分別將cry2Ah-vp/bar和cry2Ah-sp/bar基因轉(zhuǎn)入玉米中，通過(guò)抗蟲性篩選得到一個(gè)含cry2Ahvp/bar基因高抗東方粘蟲的轉(zhuǎn)基因玉米事件VP1-5（即2HVB5），為抗蟲耐除草劑玉米的培育提供了種質(zhì)資源［10］。

在本研究中對(duì)已回交轉(zhuǎn)育至骨干自交系鄭58的BC5S1、BC5S2代2HVB5 材料進(jìn)行Southern blot、ELISA、抗蟲性（東方粘蟲、棉鈴蟲和草地貪夜蛾）、草銨膦耐受性檢測(cè)以及農(nóng)藝性狀調(diào)查，分析2HVB5材料的遺傳穩(wěn)定性和目標(biāo)性狀功能效率，為抗蟲耐除草劑轉(zhuǎn)基因玉米2HVB5 的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 玉米材料 玉米自交系鄭58（簡(jiǎn)稱Z58）和回交轉(zhuǎn)育鄭58 的BC5S1、BC5S2代轉(zhuǎn)基因玉米2HVB5 材料，以上材料均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所郎志宏實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 供試?yán)ハx 東方粘蟲、棉鈴蟲、草地貪夜蛾蟲卵均購(gòu)自美延（北京）農(nóng)業(yè)科技有限責(zé)任公司，蟲卵置于人工培養(yǎng)箱（28℃）孵化。所有初孵幼蟲作為供試蟲源進(jìn)行生物活性測(cè)定。

1.2 方法

1.2.1 Southern blot 檢測(cè) 分別提取BC5S1、BC5S2代2HVB5 轉(zhuǎn)基因玉米和對(duì)照材料鄭58 自交系的葉片基因組DNA，2HVB5 基因組DNA 分別用Hind III 和SacI 酶切，對(duì)照鄭58 基因組DNA 用Hind III 酶切，37℃酶切完全后將酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并轉(zhuǎn)膜。cry2Ah-vp基因探針（正向引物：5'-GAGTGGATGGAGTGGAAG-3'，反向引物：5'-CGATGTTTGGGAAGGTCT-3'）和bar基因探針（正向引物：5'-GACGCACAATCCCACTATCCT-3'，反向引物：5'-CAGCGACCACGCTCTTGAAGC-3'） 按照PCR DIG Probe Synthesis Kit 說(shuō)明書進(jìn)行制備。Southern blot 檢測(cè)按照DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II 說(shuō)明書進(jìn)行操作。利用超靈敏多功能成像儀對(duì)DNA 雜交信號(hào)進(jìn)行圖像分析。

1.2.2 ELISA 檢測(cè) 選取BC5S1、BC5S2代2HVB5 轉(zhuǎn)基因玉米和對(duì)照材料鄭58 苗期（V1）的根、葉，拔節(jié)期（V6）的根、莖、葉，吐絲期（R1）的根、莖、葉、花粉、雄穗、花絲、雌穗，完熟期（R6）的根、莖、葉、籽粒共4 個(gè)時(shí)期16 個(gè)部位的組織材料進(jìn)行總蛋白的提?。? 次生物學(xué)重復(fù)）。選用Envirologix Quantiplate Kit for Cry2A（Catalog Number AP 005）檢測(cè)Cry2Ah 蛋白的表達(dá)量及Envirologix Quantiplate Kit for PAT/bar（Catalog Number AP 013）檢測(cè)PAT 蛋白的表達(dá)量。操作步驟按照相應(yīng)試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行。使用多功能酶標(biāo)儀FlexStation3（450 nm 檢測(cè)波長(zhǎng)，630 nm 參考波長(zhǎng)）測(cè)定樣品OD 值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算Cry2Ah-vp 和PAT 蛋白的表達(dá)量。

1.2.3 室內(nèi)生物活性測(cè)定 東方粘蟲和草地貪夜蛾的室內(nèi)生測(cè)分別參照王振營(yíng)等［11］和武奉慈等［12］的方法，取玉米V6 時(shí)期心葉剪成1 cm2左右的小片，放入24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔接1 頭初孵幼蟲，3次生物學(xué)重復(fù)，接蟲48 h 后每天統(tǒng)計(jì)1 次存活幼蟲數(shù)，連續(xù)統(tǒng)計(jì)至7 d。棉鈴蟲室內(nèi)生測(cè)參照常雪艷等［13］的方法，取玉米吐絲期的花絲和雌穗分別剪成小段，放入12 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔接1 頭棉鈴蟲初孵幼蟲，3 次生物學(xué)重復(fù)，接蟲48 h 后每天統(tǒng)計(jì)1 次存活幼蟲數(shù)，連續(xù)統(tǒng)計(jì)至7 d。每天統(tǒng)計(jì)結(jié)果時(shí)根據(jù)玉米材料的取食和新鮮程度及時(shí)更換新的材料。

1.2.4 田間生物活性測(cè)定 依據(jù)《轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品環(huán)境安全檢測(cè) 抗蟲玉米 第1 部分：抗蟲性》（農(nóng)業(yè)部953 號(hào)公告-10.1-2007）進(jìn)行2HVB5 轉(zhuǎn)基因玉米對(duì)東方粘蟲和棉鈴蟲的田間抗蟲性檢測(cè)。在玉米V6 期進(jìn)行東方粘蟲的接蟲，接蟲20 d 后調(diào)查葉片為害程度并判定2HVB5 對(duì)東方粘蟲的抗性水平。在玉米吐絲期進(jìn)行棉鈴蟲的接蟲，接蟲20 d 后調(diào)查雌穗為害程度并判定2HVB5 轉(zhuǎn)基因玉米穗期對(duì)棉鈴蟲的抗性水平。每小區(qū)人工接蟲不少于40 株。

1.2.5 草銨膦耐受性檢測(cè) 依據(jù)《轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品環(huán)境安全檢測(cè) 抗除草劑玉米 第1 部分：除草劑耐受性》（農(nóng)業(yè)部953 號(hào)公告-11.1-2007）對(duì)2HVB5轉(zhuǎn)基因玉米的田間目標(biāo)除草劑（草銨膦）耐受性進(jìn)行檢測(cè)。草銨膦除草劑施用量分別為農(nóng)藥登記標(biāo)簽中劑量的1 倍（600 g/hm2）、2 倍（1 200 g/hm2）、4倍（2 400 g/hm2）。按推薦時(shí)間施用。分別在用藥1、2、4 周調(diào)查和記錄成苗率、植株高度、藥害癥狀。藥害癥狀分級(jí)按GB/T 19780.42 執(zhí)行。

1.2.6 農(nóng)藝性狀調(diào)查 每個(gè)材料隨機(jī)選取30 株，吐絲后測(cè)量株高、穗位高。收獲后進(jìn)行考種，測(cè)量穗長(zhǎng)、穗粗、禿尖長(zhǎng)、穗行數(shù)、行粒數(shù)、千粒重及單株產(chǎn)量。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析 利用Excel 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，用SAS 9.4 數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，差異顯著性比較均采用成組法t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)基因玉米2HVB5的Southern blot分析

Southern blot 檢測(cè)了連續(xù)兩代（BC5S1、BC5S2）轉(zhuǎn)基因玉米2HVB5 的外源基因插入情況，結(jié)果（圖1）顯示，2HVB5 基因組DNA 在Hind III 和SacI 酶切后以目的基因cry2Ah-vp和bar為探針都只檢測(cè)到一條雜交條帶，且兩代之間條帶大小沒(méi)有差別，對(duì)照鄭58 未檢測(cè)到雜交信號(hào)。這表明2HVB5 中目的基因cry2Ah-vp和bar都是以單拷貝的形式整合到玉米基因組并穩(wěn)定遺傳。

圖1 BC5S1、BC5S2 代轉(zhuǎn)基因玉米2HVB5 中目的基因的Southern blot 檢測(cè)Fig.1 Southern blot analysis of the target genes in the BC5S1 and BC5S2 generation of transgenic maize 2HVB5

2.2 轉(zhuǎn)基因玉米2HVB5中目的蛋白的定量分析

ELISA 檢測(cè)結(jié)果（圖2）顯示，轉(zhuǎn)基因玉米2HVB5 的不同時(shí)期、不同組織部位的目的蛋白Cry2Ah-vp 和PAT 均有表達(dá)，不同代別之間差異不顯著，而對(duì)照材料鄭58 未檢測(cè)到目的蛋白。除花粉外，Cry2Ah-vp 和PAT 蛋白在2HVB5 不同時(shí)期的葉片中表達(dá)量相對(duì)較高，BC5S1代葉片中Cry2Ah-vp 和PAT 蛋白表達(dá)量分別在2.38-3.29 μg/g FW（鮮重）和8.24-16.85 μg/g FW（鮮重）之間；BC5S2代葉片中Cry2Ah-vp 和PAT 蛋白表達(dá)量分別在2.24-3.31 μg/g FW（鮮重）和11.49 -16.46 μg/g FW（鮮重）之間。

圖2 BC5S1、BC5S2 代轉(zhuǎn)基因玉米2HVB5 中目的蛋白表達(dá)量分析Fig.2 Expression analysis of target proteins in the BC5S1 and BC5S2 generation of transgenic maize 2HVB5

2.3 轉(zhuǎn)基因玉米2HVB5的抗蟲性分析

室內(nèi)生物活性檢測(cè)結(jié)果（圖3）顯示，BC5S1、BC5S2代轉(zhuǎn)基因玉米2HVB5 心葉接?xùn)|方粘蟲初孵幼蟲2 d 后，幼蟲校正死亡率分別為50.42%和57.83%；3 d 后幼蟲校正死亡率分別為95.65%和97.03%；4 d 后東方粘蟲幼蟲全部死亡。BC5S1、BC5S2代轉(zhuǎn)基因玉米2HVB5 雌穗接棉鈴蟲初孵幼蟲2 d 后，幼蟲校正死亡率分別為50.42%和54.17%；3 d 后幼蟲校正死亡率分別為70.83%和83.33%；4 d 后幼蟲校正死亡率分別為96.65%和91.67%；5 d后棉鈴蟲幼蟲全部死亡。BC5S1、BC5S2代轉(zhuǎn)基因玉米2HVB5 花絲接棉鈴蟲初孵幼蟲2 d 后，幼蟲校正死亡率分別為50.76%和56.25%；3 d 后幼蟲校正死亡率分別為88.64%和83.75%；4 d 后棉鈴蟲幼蟲全部死亡（圖3-a）。2HVB5 的葉片、雌穗和花絲只受到輕微損傷，而對(duì)照材料鄭58 取食嚴(yán)重，兩者對(duì)比差異顯著（圖3-b）。BC5S1、BC5S2代轉(zhuǎn)基因玉米2HVB5 心葉接草地貪夜蛾初孵幼蟲3 d 后，幼蟲有死亡，7 d 后草地貪夜蛾幼蟲校正死亡率分別為25.08%和20.83%（圖4-a）；但與對(duì)照Z(yǔ)58 相比，轉(zhuǎn)基因玉米2HVB5 對(duì)草地貪夜蛾幼蟲有明顯的體重抑制，飼喂BC5S1、BC5S2代轉(zhuǎn)基因玉米2HVB5 的草地貪夜蛾幼蟲體重分別下降71.36%和80.83%（圖4-b），幼蟲活力下降不能進(jìn)一步完成生長(zhǎng)發(fā)育。室內(nèi)生物活性檢測(cè)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因玉米2HVB5 對(duì)亞洲玉米螟、東方粘蟲和棉鈴蟲的抗性水平均達(dá)到“高抗”，對(duì)草地貪夜蛾具有顯著的生長(zhǎng)抑制作用。

圖3 BC5S1、BC5S2 代轉(zhuǎn)基因玉米2HVB5 的東方粘蟲和棉鈴蟲室內(nèi)生物活性檢測(cè)結(jié)果Fig.3 AW and CB bioassay results of BC5S1 and BC5S2 generation transgenic maize 2HVB5 in laboratory

圖4 BC5S1、BC5S2 代轉(zhuǎn)基因玉米2HVB5 的草地貪夜蛾室內(nèi)生物活性檢測(cè)結(jié)果Fig.4 FAW bioassay results of BC5S1 and BC5S2 generation transgenic maize 2HVB5 in laboratory

田間生物活性檢測(cè)結(jié)果顯示，根據(jù)《轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品環(huán)境安全檢測(cè) 抗蟲玉米 第1 部分：抗蟲性》（農(nóng)業(yè)部953 號(hào)公告-10.1-2007）中玉米葉片受粘蟲為害程度的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，BC5S1、BC5S2代轉(zhuǎn)基因玉米2HVB5的V6期東方粘蟲的食葉級(jí)別分別為1.19和1.29，而對(duì)照材料鄭58 的V6 期東方粘蟲食葉級(jí)別分別為7.10 和7.05，兩者差異極顯著。根據(jù)《轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品環(huán)境安全檢測(cè) 抗蟲玉米 第1 部分：抗蟲性》（農(nóng)業(yè)部953 號(hào)公告-10.1-2007）中玉米對(duì)粘蟲的抗性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，2HVB5 轉(zhuǎn)基因玉米對(duì)東方粘蟲的抗性級(jí)別為“高抗”，對(duì)照鄭58 對(duì)東方粘蟲的抗性級(jí)別為“感”（表1）。根據(jù)《轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品環(huán)境安全檢測(cè) 抗蟲玉米 第1 部分：抗蟲性》（農(nóng)業(yè)部953 號(hào)公告-10.1-2007）中玉米雌穗受棉鈴蟲為害程度的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，BC5S1、BC5S2代轉(zhuǎn)基因玉米2HVB5 的吐絲期棉鈴蟲的食穗級(jí)別分別為0.60和0.73，而對(duì)照材料鄭58 的吐絲期棉鈴蟲的食穗級(jí)別分別為3.20 和3.97，兩者差異極顯著。根據(jù)《轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品環(huán)境安全檢測(cè) 抗蟲玉米 第1 部分：抗蟲性》（農(nóng)業(yè)部953 號(hào)公告-10.1-2007）中玉米雌穗對(duì)棉鈴蟲的抗性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，2HVB5 轉(zhuǎn)基因玉米對(duì)棉鈴蟲的抗性級(jí)別為“高抗”，對(duì)照鄭58 對(duì)棉鈴蟲的抗性級(jí)別為“中抗”（表2）。田間生物活性檢測(cè)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因玉米2HVB5 對(duì)東方粘蟲和棉鈴蟲的抗性水平均達(dá)到“高抗”，與室內(nèi)生物活性檢測(cè)結(jié)果一致。

表1 心葉期東方粘蟲食葉級(jí)別Table 1 Leaf damage grades of AW at whorl stage

表2 吐絲期棉鈴蟲食穗級(jí)別Table 2 Ear damage grades of CB at silking stage

2.4 轉(zhuǎn)基因玉米2HVB5的草銨膦耐受性分析

草銨膦耐受性檢測(cè)結(jié)果顯示BC5S1、BC5S2代轉(zhuǎn)基因玉米2HVB5 在中劑量1 倍（600 g/hm2）、中劑量2 倍（1 200 g/hm2）和中劑量4 倍（2 400 g/hm2）的草銨膦處理后均未出現(xiàn)受害癥狀，對(duì)照鄭58 則全部死亡；轉(zhuǎn)基因玉米2HVB5 在不同處理、不同時(shí)間的株高與鄭58 相比無(wú)顯著差異，單株產(chǎn)量與鄭58相比無(wú)顯著差異（表3），這表明轉(zhuǎn)基因玉米2HVB5能夠抗中劑量4 倍及以下濃度的草銨膦，可以滿足生產(chǎn)應(yīng)用的需要。

2.5 轉(zhuǎn)基因玉米2HVB5的農(nóng)藝性狀調(diào)查

轉(zhuǎn)基因玉米2HVB5 連續(xù)兩代的農(nóng)藝性狀調(diào)查結(jié)果（表4）顯示，在同一世代中轉(zhuǎn)基因玉米2HVB5在未噴施草銨膦和噴施田間使用中劑量1 倍（600 g/hm2）、中劑量2 倍（1 200 g/hm2）和中劑量4 倍（2 400 g/hm2）的草銨膦后的主要農(nóng)藝性狀與鄭58相比無(wú)顯著差異，轉(zhuǎn)基因玉米2HVB5 因含有抗蟲和耐除草劑基因具有抗蟲和草銨膦耐受性之外，其他農(nóng)藝性狀與對(duì)照玉米鄭58 無(wú)顯著差異，回交的高代材料在農(nóng)藝性狀方面趨于穩(wěn)定，與回交受體相同，可用于后續(xù)的育種。

3 討論

在玉米的遺傳轉(zhuǎn)化中，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法以其費(fèi)用低、拷貝數(shù)低、重復(fù)性好、較完整的轉(zhuǎn)化大片段等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛使用。但農(nóng)桿菌介導(dǎo)的T-DNA 插入是隨機(jī)整合到植物的染色體中［14-15］，這種插入位置的不確定性，可能會(huì)造成外源或內(nèi)源基因的缺失或沉默，導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植物無(wú)目的性狀或農(nóng)藝性狀發(fā)生改變［16］。T-DNA 序列的整合位點(diǎn)因受體植物不同具有一定差異，并且轉(zhuǎn)入的外源基因整合是否具有穩(wěn)定性，整合的位置以及邊界序列的狀態(tài)等都難以控制。因此對(duì)比研究不同世代轉(zhuǎn)基因作物的外源基因DNA整合、蛋白表達(dá)、目的性狀以及農(nóng)藝性狀等遺傳穩(wěn)定性，對(duì)轉(zhuǎn)基因作物的商業(yè)化應(yīng)用具有非常重要的意義。在本研究中對(duì)連續(xù)5 代回交鄭58 并自交1 代和2 代（BC5S1、BC5S2）的轉(zhuǎn)基因玉米2HVB5 材料的檢測(cè)結(jié)果顯示，外源目的基因穩(wěn)定地整合到玉米基因組中，目的基因的拷貝數(shù)、蛋白表達(dá)量、抗蟲性、草銨膦耐受性以及農(nóng)藝性狀等在不同代別中無(wú)顯著差異，并且轉(zhuǎn)基因玉米2HVB5 高抗東方粘蟲、棉鈴蟲，能夠耐受田間使用中劑量4 倍的草銨膦。這些結(jié)果都證明轉(zhuǎn)基因玉米2HVB5 是一個(gè)高抗蟲耐除草劑并且遺傳穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因材料，具有較好的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用前景。

Bt 作物的應(yīng)用為害蟲防治開(kāi)辟了新的途徑。但從生物進(jìn)化角度來(lái)看，長(zhǎng)期種植單一的Bt 作物防治靶標(biāo)害蟲將不可避免地引發(fā)害蟲的抗性。近些年已經(jīng)有靶標(biāo)害蟲在田間對(duì)Bt 作物產(chǎn)生抗性的相關(guān)報(bào)道。美國(guó)東部發(fā)現(xiàn)對(duì)Cry1Ac 棉花產(chǎn)生抗性的美洲棉鈴蟲［17］，南非發(fā)現(xiàn)對(duì)Cry1Ab 玉米產(chǎn)生抗性的非洲二化螟［18］，波多黎各發(fā)現(xiàn)對(duì)Cry1F 玉米產(chǎn)生抗性的草地貪夜蛾種群［19］，巴西也發(fā)現(xiàn)對(duì)Cry1Ab 玉米產(chǎn)生抗性的草地貪夜蛾種群［20］。國(guó)內(nèi)也監(jiān)測(cè)到田間棉鈴蟲對(duì)Cry1Ac 的抗性水平呈明顯上升的趨勢(shì)［21］。這將影響B(tài)t 作物的可持續(xù)應(yīng)用。針對(duì)害蟲產(chǎn)生抗性風(fēng)險(xiǎn)的問(wèn)題，“多基因疊加”策略是目前應(yīng)用最為廣泛的抗性治理策略［22-23］。商業(yè)化的轉(zhuǎn)基因玉米中主要是通過(guò)雜交組合的方式疊加不同的Bt 基因擴(kuò)大殺蟲譜并延緩害蟲抗性的產(chǎn)生。已有的研究表明Cry1Ab/1Ac 與Cry2Ab 間存在不對(duì)稱的交互抗性［8，24］，而ABCC2 受體可能是導(dǎo)致產(chǎn)生交互抗性的主要原因［25］。cry2Ah基因是具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新型殺蟲基因，與cry2Ab基因（GenBank：DQ361266.1）核苷酸序列相似性為94.47%，氨基酸序列相似性為93.20%。盡管cry2Ah基因與cry2Ab基因序列相似性較高，但研究表明Cry2Ah 與Cry1Ab/1Ac 不存在交互抗性［8］，與Cry2Ab 相比，Cry2Ah 可能更適合與Cry1A 類和Vip3Aa 進(jìn)行組合抗蟲。在本研究中，表達(dá)Cry2Ah-vp 蛋白的轉(zhuǎn)基因玉米2HVB5 對(duì)東方粘蟲和棉鈴蟲高抗，對(duì)草地貪夜蛾有明顯的體重抑制。后續(xù)將轉(zhuǎn)基因玉米2HVB5 與本課題組培育的轉(zhuǎn)cry1Ah基因抗蟲玉米HGK60、轉(zhuǎn)vip3Aa11/cp4-epsps基因抗蟲耐除草劑玉米VP3C1 進(jìn)行雜交（未發(fā)表數(shù)據(jù)），培育多基因疊加的具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的抗蟲耐除草劑玉米，可有效增強(qiáng)對(duì)靶標(biāo)害蟲的殺蟲效果并延緩害蟲抗性的產(chǎn)生。

表3BC5S1、BC5S2 代轉(zhuǎn)基因玉米2HVB5 草銨膦處理后的結(jié)果Table 3 Results of BC5S1 and BC5S2 generation transgenic maize 2HVB5 after glufosinate application量2.32a 2.62a 2.68a 2.45a 2.56a 2.95a 2.89a產(chǎn)2.70a株Damagepercent/%單Yield perplant/g 106.7±105.7±0106.6±0105±0106.7±106.4±106.6±0105.15±2.16a 0106.5±0106.45±2.5a 0100 4 周4 weeks 00100 0100 000100 0100 0100 0 2 周2 weeks 00100 000100 0100 0100 0100 0100 0率受1 周1 week害00 0100 100 0100 000100 0100 0100 0 1.5a 2.14a 2.48a 2.05a 1.62a 4 周4 weeks 113.45±1.47a 113.6±0113.15±1.95a 0112.5±0113.5±112.45±1.7a 112.55±2.04a 0112.7±0112.1±0112.95±1.54a 2 周2 weeks 1.47a 54.95±55.7±1.34a 1.19a 1.43a 055±1.56a Plant height/cm 055±1.65a 1.76a 53.1±1.62a 055.05±53.95±053±1.62a 053.5±1.54a 053.45±度1.14a 0.99a 1.32a 1.07a 1.39a 1.35a植1 周1 week株46.3±1.38a高46.65±046.5±1.15a 046.35±047.1±1.07a 46.05±45.25±046±1.21a 045.85±045.65±4 周4 weeks 100 Plantingpercent/%100 0100 0100 0100 100 100 0100 0100 0100 2 周2 weeks 100 100 0100 0100 0100 100 100 0100 0100 0100成1 周1 week率苗100 100 0100 0100 0100 100 100 0100 0100 0100草Glufosinate理處?kù)@treatment/（g·hm-2）0 600 1 200 2 400 0 600 1 200 2 400材Samples料Z58 2HVB5 Z58 2HVB5 Z58 2HVB5 Z58 2HVB5 Z58 2HVB5 Z58 2HVB5 Z58 2HVB5 Z58 2HVB5代Generation別BC5S1 BC5S2

單Yield perplant/g量2.32a 2.62a 2.68a 2.56a 2.95a產(chǎn)2.7a株106.7±105.7±106.6±105±106.4±106.6±105.15±2.16a 106.45±2.5a千1 000-grain 3.77a 2.55a 3.66a 2.92a 2.93a 3.25a重粒weight/g 280.6±279.55±3.2a 280.1±280.8±279.35±3.41a106.7±2.45a 279.9±280.4±278.55±2.5a 279.25±3.51a106.5±2.89a 280.3±28.1±0.72a 0.75a行Kernels perrow 0.86a 28.3±0.86a 0.79a 0.85a數(shù)0.66a粒0.83a 28.3±28.25±27.85±0.83a 28.1±28.1±0.79a 28.25±性0.91a 13.75±穗Rowsperear行0.79a 27.95±0.83a 13.9±0.85a數(shù)狀藝0.81a 28±13.85±14.1±0.79a 14.05±14±0.79a 14.05±14±0.86a 13.7±0.8a 14.1±0.85a農(nóng)2HVB5 的禿Baretip長(zhǎng)尖length/cm 0 0 0 0 0 00 0 0 0米玉因0.16a 0.14a基粗轉(zhuǎn)穗Ear diameter /cm 4.07±0.1a 4.1±4.12±0.16a 4.1±4.12±0.15a 4.08±0.12a 4.09±0.14a 4.13±0.19a 4.13±0.16a 4.11±0.14a BC5S2 代1.17a 1.27a 1.1a 0.79a 0.92a 4 BC5S1、穗Ear length/cm Table 4Agronomictraits of BC5S1 andBC5S2 generation transgenic maize2HVB5長(zhǎng)2.23a 16.55±1.15a 16.65±16.5±1.43a 16.55±1.96a 16.55±1.15a 16.25±2.06a 16.25±1.16a穗Ear height/cm 139.65±2.13a32.25±2.24a16.1±2.11a 16.45±1.1a 2.22a 16.3±1.66a高1.82a 32.05±2.07a 1.84a表位32.15±33.15±32.65±32.25±株P(guān)lant height/cm 1.93a 2.63a 1.61a 1.94a 1.79a高139.4±139.65±2.46a32.3±139.9±139.95±2.46a32.3±141.45±1.85a32.4±142.5±141.8±141.55±2.01a33.1±141.4±草Glufosinate理處?kù)@treatment/（g·hm-2）0鄭2HVB5 0 2HVB5 0 2HVB5 600 2HVB5 1200 2HVB5 2400 0材Sample料58 58鄭2HVB5 600 2HVB5 1200 2HVB5 2400代Generation別BC5S1 BC5S2

轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化以來(lái)，由于其顯著的經(jīng)濟(jì)、社會(huì)和生態(tài)效益，使其在全球得到了廣泛應(yīng)用，截至2019年，全球共有71 個(gè)國(guó)家采用了轉(zhuǎn)基因作物，其中29 個(gè)國(guó)家批準(zhǔn)種植，42 個(gè)國(guó)家（包含歐盟26國(guó)）批準(zhǔn)進(jìn)口轉(zhuǎn)基因作物用于食品、飼料和加工［6］。目前商業(yè)化轉(zhuǎn)基因玉米的目標(biāo)性狀主要集中在抗蟲、耐除草劑上，其中抗蟲耐除草劑復(fù)合性狀占復(fù)合性狀轉(zhuǎn)化體總數(shù)的96%。從現(xiàn)有商業(yè)化玉米轉(zhuǎn)化體數(shù)量上來(lái)看，單性狀商業(yè)化轉(zhuǎn)化體數(shù)量長(zhǎng)期處于較低水平，隨時(shí)間變化波動(dòng)平穩(wěn)；而復(fù)合性狀的商業(yè)化轉(zhuǎn)化體數(shù)量隨時(shí)間變化呈現(xiàn)持續(xù)升高后又降低的趨勢(shì)，其中2007-2015年為復(fù)合性狀商業(yè)化轉(zhuǎn)化體數(shù)量增長(zhǎng)最快的階段［26］。從玉米產(chǎn)業(yè)來(lái)看，復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因玉米符合生產(chǎn)發(fā)展要求，并且抗蟲和耐除草劑仍然是復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因玉米的主要目標(biāo)性狀。因此抗蟲耐除草劑玉米仍然是轉(zhuǎn)基因玉米發(fā)展的主要方向。在全球除草劑市場(chǎng)上，氨基酸類除草劑（包括草甘膦、草銨膦、雙丙氨膦）的市場(chǎng)規(guī)模最大。2019年全球除草劑市場(chǎng)規(guī)模為263.31 億美元，其中氨基酸類除草劑占比約23.6%［27］。2020年全球草銨膦市場(chǎng)規(guī)模達(dá)到10.5 億美元，僅次于草甘膦位列所有除草劑品種的第二位，近6年的復(fù)合增長(zhǎng)率為6.3%，是增長(zhǎng)最快的非選擇性除草劑，市場(chǎng)開(kāi)發(fā)潛力和應(yīng)用前景巨大［27］。轉(zhuǎn)基因玉米2HVB5 表達(dá)cry2Ah-vp和bar基因，在抗蟲的同時(shí)也賦予了玉米耐草銨膦的特性。本研究結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因玉米2HVB5 對(duì)草銨膦除草劑具有高的耐受性，田間能夠耐受中劑量4 倍的草銨膦，農(nóng)藝性狀與對(duì)照相比無(wú)顯著差異，達(dá)到了生產(chǎn)用抗除草劑玉米對(duì)除草劑的耐受性水平。與抗蟲耐草甘膦玉米HGK60 和VP3C1雜交后可同時(shí)抗草甘膦和草銨膦除草劑，具有更加廣泛的生產(chǎn)應(yīng)用前景。

4 結(jié)論

轉(zhuǎn)基因玉米2HVB5 的外源基因以單拷貝形式整合到玉米基因組中并穩(wěn)定遺傳，目的蛋白Cry2Ahvp 和PAT 在植株的不同時(shí)期、不同組織部位均有表達(dá)，其中在葉片中的表達(dá)量相對(duì)較高，分別達(dá)到2-3.5 μg/g FW（鮮重）和8-17 μg/g FW（鮮重）。轉(zhuǎn)基因玉米2HVB5 對(duì)東方粘蟲和棉鈴蟲高抗，對(duì)草地貪夜蛾有明顯的體重抑制，可有效防治玉米害蟲尤其是夜蛾科害蟲。2HVB5 轉(zhuǎn)基因玉米可耐受田間使用中劑量4 倍量的草銨膦，農(nóng)藝性狀與對(duì)照鄭58 相比無(wú)顯著差異。