羅 聰， 鐘 崛

(1.湖北省武漢市第六醫(yī)院急診科， 湖北 武漢 430000 2.湖北省武漢市第三醫(yī)院， 湖北 武漢 430061)

神經(jīng)干細(xì)胞能夠在適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)條件下自我更新并分化為神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞。當(dāng)發(fā)生腦損傷時(shí)，內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞會(huì)變得活躍并參與神經(jīng)修復(fù)過程。在嚴(yán)重低氧條件下，神經(jīng)干細(xì)胞的增殖能力降低，凋亡能力增加[1]。此外，神經(jīng)干細(xì)胞比其他類型的細(xì)胞對(duì)氧濃度更敏感，并且低氧對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞有顯著的不利影響[2]。因此，開發(fā)新的藥物來促進(jìn)低氧誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞增殖、抑制凋亡具有重要意義。已有研究報(bào)道，促紅細(xì)胞生成素(Erythropoietin，EPO)能促進(jìn)腦內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化，對(duì)宮內(nèi)感染引起的早產(chǎn)小鼠腦損傷有一定的治療作用[3]。但關(guān)于EPO對(duì)低氧誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞增殖、凋亡的影響鮮有報(bào)道。另有研究表明，激活低氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)/細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular-signal-regulated kinase，ERK)通路中的HIF-1α、ERK因子可促進(jìn)腦損傷后神經(jīng)干細(xì)胞增殖[4]。而EPO能否通過調(diào)控HIF-1α/ERK信號(hào)通路影響低氧誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞增殖、凋亡尚不明確。因此，本研究主要探究EPO對(duì)低氧誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞增殖、凋亡的影響以及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物： 24h新生SD大鼠購自廣東維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司(SCXK(粵)2022-0063)。

1.2主要試劑：EPO購自南京北魚生物公司；HIF-1α抑制劑YC-1購自愛必信(上海)生物公司；兔源一抗巢蛋白(nestin)、細(xì)胞周期蛋白D1(CyclinD1)、Bcl-2/腺病毒干擾蛋白3(Bcl-2/adenovirusE1B 19-kDa-interacting protein 3，BNIP3)、切割型半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3(cleaved cysteine aspartate proteolytic enzyme-3，Cleaved Caspase-3)、HIF-1α、p-ERK1/2、ERK1/2、GAPDH及羊抗兔IgG二抗均購自英國(guó)Abcam公司。

1.3神經(jīng)干細(xì)胞的分離與培養(yǎng)：4%戊巴比妥鈉處死大鼠，分離出海馬組織，切塊，經(jīng)消化后，離心并收集細(xì)胞沉淀，加入1mL神經(jīng)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞沉淀，并接種于50mL培養(yǎng)瓶中。培養(yǎng)6～7d時(shí)將已增殖成由數(shù)百個(gè)細(xì)胞形成的大克隆球吹打至打散狀態(tài)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。觀察接種2h、24h、7d時(shí)細(xì)胞的形態(tài)。

1.4免疫熒光鑒定神經(jīng)干細(xì)胞:取第三代神經(jīng)干細(xì)胞克隆球，接種至6孔板中，經(jīng)固定、通透、封閉后，加入一抗nestin在4℃下孵育過夜，然后與DyLight649紅色熒光標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗在室溫下孵育2h，封片，觀察nestin蛋白表達(dá)情況。

1.5細(xì)胞分組與處理:取第三代生長(zhǎng)良好的神經(jīng)干細(xì)胞懸液，將其分為NC組、Model組、低劑量EPO組(EPO-L組)、高劑量EPO組(EPO-H組)、YC-1組、EPO-H+YC-1組。除NC組外，其它組神經(jīng)干細(xì)胞均需暴露在200μmoL/L 氯化鈷中24h以建立低氧損傷細(xì)胞模型[5]。低氧誘導(dǎo)24h后，EPO-L組、EPO-H組、YC-1組神經(jīng)干細(xì)胞分別用5 U/m L EPO、25 U/m L EPO、10μmoL/L YC-1處理48h，EPO-H+YC-1組神經(jīng)干細(xì)胞用25 U/m L EPO和10μmoL/L YC-1同時(shí)處理48h，NC組、Model組用神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)液處理48h后，收集各組細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.65-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxyuridine，Brd U)法檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞增殖:將各組細(xì)胞(5×104個(gè)/孔)接種于48孔板中，待細(xì)胞貼壁后，加入5μmoL/L Brd U，洗滌、固定后，Brd U和DAPI雙染，觀察陽性細(xì)胞數(shù)。

1.7流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞凋亡:取100μL細(xì)胞懸液(5.0×104個(gè)細(xì)胞)，將5μL V-FITC和10μL PI加入細(xì)胞懸液中，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡率。

1.8Western blot檢測(cè)各組神經(jīng)干細(xì)胞中Cyclin D1、BNIP3、Cleaved Caspase-3、HIF-1α、p-ERK1/2蛋白表達(dá):RIPA裂解緩沖液裂解并提取總蛋白，經(jīng)定量、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，將膜與一抗Cyclin D1、BNIP3、Cleaved Caspase-3、HIF-1α、p-ERK1/2、ERK1/2、GAPDH在4℃下過夜孵育，與二抗在室溫下反應(yīng)2h。Image J軟件評(píng)估條帶灰度值。

2 結(jié) 果

2.1神經(jīng)干細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察:接種2h后可見大量單個(gè)圓形細(xì)胞生成，細(xì)胞大小均勻；24h后大量單個(gè)圓形細(xì)胞開始聚集，形成許多小的克隆球；7d時(shí)克隆球逐漸增殖、變大，每個(gè)大克隆球由數(shù)百個(gè)細(xì)胞組成，大克隆球整體輪廓呈現(xiàn)為圓形。見圖1。

圖1 倒置顯微鏡觀察神經(jīng)干細(xì)胞的形態(tài)(Bar=50μm)

2.2神經(jīng)干細(xì)胞的鑒定:第3代神經(jīng)干細(xì)胞克隆球呈現(xiàn)明亮的紅色熒光，表明第3代神經(jīng)干細(xì)胞克隆球表達(dá)nestin蛋白，見圖2。

圖2 熒光顯微鏡觀察第3代神經(jīng)干細(xì)胞克隆球中nestin蛋白表達(dá)(Bar=50μm)

2.3EPO對(duì)各組神經(jīng)干細(xì)胞增殖的影響:與NC組比較，Model組Brd U陽性細(xì)胞比例降低(P<0.05)；與Model組比較，EPO-L組、EPO-H組Brd U陽性細(xì)胞比例升高，YC-1組Brd U陽性細(xì)胞比例降低(P<0.05)；與EPO-L組比較，EPO-H組Brd U陽性細(xì)胞比例升高(P<0.05)；與EPO-H組比較，EPO-H+YC-1組Brd U陽性細(xì)胞比例降低(P<0.05)，見圖3和表1。

圖3 Brd U滲入法檢測(cè)EPO對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞增殖的影響(Bar=50μm)

表1 EPO對(duì)各組神經(jīng)干細(xì)胞增殖的影響

2.4EPO對(duì)各組神經(jīng)干細(xì)胞凋亡的影響:與NC組比較，Model組神經(jīng)干細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05)；與Model組比較，EPO-L組、EPO-H組神經(jīng)干細(xì)胞凋亡率降低，YC-1組神經(jīng)干細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05)；與EPO-L組比較，EPO-H組神經(jīng)干細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05)；與EPO-H組比較，EPO-H+YC-1組神經(jīng)干細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05)，見圖4和表2。

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)EPO對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞凋亡的影響

表2 EPO對(duì)各組神經(jīng)干細(xì)胞凋亡率的影響

2.5EPO對(duì)各組神經(jīng)干細(xì)胞中CyclinD1、BNIP3、Cleaved Caspase-3、HIF-1α、p-ERK1/2蛋白表達(dá)的影響:與NC組比較，Model組Cyclin D1、HIF-1α、p-ERK1/2蛋白表達(dá)降低，BNIP3、Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)升高(P<0.05)；與Model組比較，EPO-L組、EPO-H組Cyclin D1、HIF-1α、p-ERK1/2蛋白表達(dá)升高，BNIP3、Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)降低，YC-1組Cyclin D1、HIF-1α、p-ERK1/2蛋白表達(dá)降低，BNIP3、Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)升高(P<0.05)；與EPO-L組比較，EPO-H組Cyclin D1、HIF-1α、p-ERK1/2蛋白表達(dá)升高，BNIP3、Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)降低(P<0.05)；與EPO-H組比較，EPO-H+YC-1組Cyclin D1、HIF-1α、p-ERK1/2蛋白表達(dá)降低，BNIP3、Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)升高(P<0.05)，見圖5和表3。

表3 各組神經(jīng)干細(xì)胞中Cyclin D1 BNIP3 Cleaved Caspase-3 HIF-1α p-ERK1/2蛋白表達(dá)比較

圖5 western blot檢測(cè)各組神經(jīng)干細(xì)胞中Cyclin D1、BNIP3、Cleaved Caspase-3、HIF-1α、p-ERK1/2蛋白表達(dá)注：A：NC組；B：Model組；C：EPO-L組；D：EPO-H組；E：YC-1組；F：EPO-H+YC-1組

3 討 論

目前，神經(jīng)干細(xì)胞移植已成為修復(fù)腦損傷后神經(jīng)功能的新方法。然而，中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷過程中的一些不確定因素可能導(dǎo)致神經(jīng)干細(xì)胞移植的比例降低，進(jìn)而降低神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化。Nestin通常被認(rèn)為是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物[6]。本研究發(fā)現(xiàn)第3代神經(jīng)干細(xì)胞克隆球高表達(dá)nestin蛋白，證明成功分離出神經(jīng)干細(xì)胞。氯化鈷是常用于在體外誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞低氧損傷的藥物，本研究利用該藥物處理神經(jīng)干細(xì)胞，結(jié)果顯示，氯化鈷誘導(dǎo)的低氧損傷神經(jīng)干細(xì)胞增殖能力減弱，凋亡能力增強(qiáng)。此外，相關(guān)研究表明，上調(diào)Cyclin D1表達(dá)可促進(jìn)缺氧缺血性腦損傷后海馬神經(jīng)干細(xì)胞增殖[7]；BNIP3蛋白是對(duì)缺氧最敏感的凋亡蛋白，而Cleaved Caspase-3具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用[8]。本研究發(fā)現(xiàn)低氧損傷神經(jīng)干細(xì)胞中Cyclin D1蛋白表達(dá)降低，BNIP3、Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)升高，再次從蛋白質(zhì)水平上證實(shí)了低氧誘導(dǎo)對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖起到抑制作用，凋亡能力起到促進(jìn)作用。

EPO可促進(jìn)紅細(xì)胞祖細(xì)胞的增殖和分化，還具有神經(jīng)保護(hù)和抗細(xì)胞凋亡的作用[9]。據(jù)報(bào)道，EPO能抑制大鼠創(chuàng)傷性顱腦損傷后神經(jīng)細(xì)胞的凋亡[10]。而關(guān)于EPO對(duì)低氧誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞增殖、凋亡的影響尚未見報(bào)道，本研究顯示，EPO可促進(jìn)低氧誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡，提示EPO可能成為改善改善低氧損傷神經(jīng)干細(xì)胞的潛在有效藥物。

上調(diào)HIF-1α表達(dá)可促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡；促進(jìn)ERK1/2的磷酸化可以促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖[11]。本研究結(jié)果與其是一致的，本研究顯示，與Model組比較，經(jīng)HIF-1α抑制劑YC-1干預(yù)后的低氧損傷神經(jīng)干細(xì)胞中HIF-1α、p-ERK1/2蛋白降低，細(xì)胞增殖能力減弱，凋亡能力增強(qiáng)，表明HIF-1α/ERK通路確實(shí)參與了低氧誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞增殖、凋亡過程。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)EPO可上調(diào)低氧誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞中HIF-1α、p-ERK1/2蛋白表達(dá)升高，且EPO劑量越高，上調(diào)作用越明顯，推測(cè)EPO可能通過激活HIF-1α/ERK通路促進(jìn)低氧誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡。為了驗(yàn)證該推測(cè)，本研究在高劑量EPO處理的基礎(chǔ)上再加上YC-1干預(yù)Model組神經(jīng)干細(xì)胞，結(jié)果顯示，YC-1減弱了高劑量EPO對(duì)低氧誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用，以及對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制作用。證實(shí)了即EPO可能通過激活HIF-1α/ERK通路促進(jìn)低氧誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡。

綜上所述，EPO可能通過激活HIF-1α/ERK通路促進(jìn)低氧誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡。本研究存在一定的局限性，由于本研究是在體外進(jìn)行的，因此在體內(nèi)低氧條件下進(jìn)一步探索EPO對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的影響仍然是必要的。